Summary
Vi beskriver her en simpel fluorescens in situ hybridisering (FISH) metode til lokalisering af vira og bakterier i insekt-og plantevæv. Denne protokol kan udvides til visualisering af mRNA i hele mount og mikroskopiske sektioner.
Abstract
Fluorescens in situ hybridisering (FISH) er et navn givet til en række teknikker, der almindeligvis anvendes til at visualisere gentranskripter i eukaryote celler og kan modificeres yderligere til at visualisere andre komponenter i cellen, såsom infektion med virus og bakterier. Rumlig lokalisering og visualisering af virus og bakterier i løbet af infektionen proces er et vigtigt skridt, som supplerer udtryk profilering eksperimenter såsom microarrays og RNAseq som reaktion på forskellige stimuli. Forståelse af de spatiotemporale infektioner med disse midler supplerer biologiske eksperimenter med henblik på at forstå deres interaktion med cellulære komponenter. Adskillige teknikker til visualisering af virus og bakterier, såsom reportergenassays systemer eller immunhistokemiske metoder er tidskrævende, og nogle er begrænset til at arbejde med modelorganismer og involverer komplekse metoder. FISH, der er målrettet RNA-eller DNA arter i cellen er en forholdsvis nem og hurtig migThOD for at studere Spatiotemporal lokalisering af gener og til diagnostiske formål. Denne metode kan være robust og relativt let at gennemføre, når de protokoller anvender korte hybridiserende kommercielt indkøbte prober, som ikke er dyre. Dette er særlig robust når prøveforberedelse, fiksering, hybridisering og mikroskopisk visualisering ikke involverer komplicerede trin. Her beskriver vi en protokol til lokalisering af bakterier og virus i insekt-og plantevæv. Metoden er baseret på simpel forberedelse, fiksering og hybridisering af insekt hele mounts og dissekerede organer eller håndlavede plante sektioner med 20 basepar korte DNA-prober konjugeret til fluorescerende farvestoffer på deres 5 'eller 3' ender. Denne protokol er blevet anvendt med succes til en række insekter og plantevæv, og kan bruges til at analysere ekspression af mRNA'er eller andre RNA-eller DNA-arter i cellen.
Introduction
Når man studerer samspillet mellem plante vira og andre patogener med deres inficerede plante værter, er det vigtigt at visualisere patogener og deres respektive nukleinsyrer in situ, uanset om de forårsage negative virkninger på deres værter. Dette er meget vigtigt, når man studerer patogen bevægelighed inden for og mellem planteceller. In situ lokalisering af genprodukter af patogenet er et vigtigt skridt, der supplerer andre tilgange til at studere patogenicitet processen. Mange plantepatogener, især virus, der overføres af insekter, der har komplekse og intime samspil med deres vektorer. Lokalisering af disse vira i deres smittebærere er vigtig for at studere vejen for transmission, og de mulige interaktion steder inde i vektor. Transmissionen af nogle insekt-vektoriserede plantevirus er hjulpet af endosymbiotic bakterier, der bor inden for disse insekter. For bedre at studere fremsendelse af disse plantevira by vektorer, er det også vigtigt at visualisere endosymbiotic bakterier i almindelighed, og de, der er involveret i virus transmission, i særdeleshed. Colokalisering af virus og endosymbiotic bakterier er således ønsket at undersøge de mulige sammenhænge mellem disse organismer i deres insekt vært. Bortset fra virus transmission, endosymbiotic bakterier påvirke flere aspekter af biologi insekt vektorer, og dermed rumlig lokalisering af disse bakterier indenfor insekter er af stor interesse og betydning.
Tomat gule blade krøller virus (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae) er den vigtigste virussygdom kompleks af dyrkede tomater på verdensplan 1-4. TYLCV er en Phloem begrænset virus og udelukkende vektoriserede af mellus Bemisia tabaci 5,6. En model, der beskriver translokation af begomoviruses i deres mellus vektorer er blevet foreslået 6-9. To specifikke barrierer aktivt krydses durning denne circulative transmission: mellemtarmen / hæmolymfe og hemolymph / spytkirtel barrierer. Denne transmission proces er en hypotese at være medieret af ukendte receptorer, som genkender virus capsidet. TYLCV menes at krydse B. tabaci mellemtarmen 6,10 og absorberes gennem den primære spytkirtel 6, før det sprøjtes ind i planten. I whitefly hæmolymfe, TYLCV interagerer med en GroEL protein produceret af insekt sekundære endosymbiotic bakterie Hamiltonella. Dette samspil sikrer sikker transport af TYLCV i hæmolymfe, og beskytter den mod angreb fra insektet immunsystemet 11. Hamiltonella og Portiera den primære endosymbiont af whiteflies, er opstaldet i bacteriocytes, insektceller findes i hemolymph og hus endosymbiotic bakterier 11. B. tabaci havne yderligere endosymbiotic bakterier, herunder Rickettsia, Arsenophonus, Wolbachia og Fritschea, der kan lokaliseres i eller uden for bacteriocytes og har forskellige virkninger på insektets biologi 12.
Adskillige rapporter har forsøgt at undersøge lokalisering af TYLCV i planter og mellus ved hjælp af tidskrævende og kostbare protokoller såsom Transmission Electron Microscopy (TEM), antistoffer og RNA in situ på mikroskopisk tyk sektion 10,13, beskrev en nylig undersøgelse lokalisering af plante virus inde i deres plante-og vektor værter ved hjælp af en simpel protokol 14. Her beskriver vi en enkel protokol til lokalisering af TYLCV i B. tabaci dissekeret midguts og spytkirtler, og i afsnit fremstillet af TYLCV-inficerede planter. Vi beskriver yderligere lokalisering af Portiera den primære endosymbiont B. tabaci, og dens sekundære endosymbionts Hamitonella, Rickettsia og Arsenophonus. Denne protokol er baseret på anvendelse af korte DNA-sonder, derer fluorescensmærket på deres 5'-ende, og specifikt at hybridisere til komplementære sekvenser i virale eller bakterielle gensekvenser. Prøven behandlingen er forholdsvis let, og det opnåede signal er meget specifik. Den beskrevne protokol kan anvendes til at lokalisere vira, bakterier og andre patogener i deres plante-, dyre-og insekt-værter, og kan yderligere anvendes til at lokalisere mRNA i en given væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. General Whitefly, anlæg og viruspræparater til FISH analyse
- Rear B og Q biotype whiteflies på bomuld frøplanter (Gossypium hirsutum L. cv. Acala) og vedligeholde indenfor insektnet bure og vækst værelser under standardbetingelser på 25 ± 2 ° C, 60% relativ fugtighed, og en 14-timers lys / 10-timers mørke fotoperiode.
- Udføre PCR til at teste infektion med endosymbionts hjælp endosymbiont-specifikke primere, som tidligere beskrevet 15-19.
- Køb Tomatkimplanter (Solanum esculentum cv. Bøf) fra en kommerciel planteskole eller tomatfrø plante.
- Opretholde under de samme opdræt ovenfor beskrevne indtil planterne nå de fire sand-bladsstadiet alder mest egnet til mellus-medieret podning af TYLCV 15 (se afsnit 4.1 nedenfor).
2. Insekt Handling, Fiksering, Probe Design, hybridisering og visualisering for Endosymbionten FISH
- Saml 10 voksne whiteflies ved aspiration fra bomuld planter, eller plukke 10 3. eller 4. stadiums nymfer fra bomuld blade.
- Umiddelbart nedsænkes i Carnoy fiksativ (chloroform-ethanol-iseddikesyre, 06:03:01, vol / vol) i Eppendorf-rør. Fix i 2 timer til natten over (helst natten over).
- Helt fjerne fiksativ og affarve i 6% H 2 O 2 i ethanol i 2 timer.
- Bevare prøverne i absolut ethanol i flere dage til flere uger ved stuetemperatur, eller gå videre til næste trin.
- Design prober som komplementære reverse DNA primere baseret på 16s ribosomale RNA gener for hver bakterie. For at designe sonder, tage ind på kontoen de samme overvejelser for at designe PCR primere. Brug oligonucleotidproberne BTP1 5'-Cy5-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3 ', RB1 5'-Cy3-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3', BTH 5'-Cy3-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3 'og Ars2 5'-Cy3-TCATGACCACAACCTCCAAA-3 'til specifik målretning af Portiera, Rickettsia, Hamilonella og Arsenophonus hhv.
- Hybridisere prøverne natten over i mørke i hybridiseringsbuffer (20 mM Tris-HCI, pH 8,0, 0,9 M NaCl, 0,01% [vægt / vol] natriumdodecylsulfat, 30% [vol / vol] formamid) indeholdende 10 pmol fluorescerende probe pr ml . Kombinere mere end én probe med forskellige fluorescerende farvestoffer hvis nødvendigt. Brug inficerede whiteflies med den målrettede bakterien og no-sonde prøver som negative kontroller.
- Monter prøverne hele, på et objektglas, i hybridisering buffer indeholdt med en flydende blocker, dække med et dækglas, forsegles med neglelak, og udsigt under et fluorescens eller konfokal mikroskop.
3. Whitefly Organ Dissektion, Fiksering, hybridisering og visualisering for TYLCV FISH
- Saml voksne whiteflies udelukkende opdrættet på TYLCV-smittede tomatplanter ved aspiration og Anesthetize ved udsættelse for papirserviet imprægneret med acetone. Expose whiteflies kun 1-2 min som for lang udsættelse for acetone kan løse whiteflies væv. Brug nonviruliferous whiteflies opdrættet på inficerede tomatplanter og ingen sonde prøver til kontrol for at bekræfte specifik hybridisering.
- Mount whiteflies på depression objektglas for orgel dissektion ved hjælp af et stereo mikroskop.
- Træk væk insekt hoved fra prothorax og dissekere spytkirtler i 1x PBS suppleret med 1% toluidinblåt pletten for bedre visualisering, på grund af deres lille størrelse. Tillad absorption af pletten i 2-3 min.
- Træk insektet hinanden ved sammenføjningen mellem brystkassen og maven til at observere og udvise ud mellemtarmen. Bortvise indholdet af maven ved at skubbe med pincet på maven spids.
- Fjern forsigtigt PBS og toluidinblåt fra succesfulde dissektioner og forsigtigt tilføje 300 pi Carnoys fixativ for at fastsætte de organer i 5 min.
- Add fiksativ fra den ene side af den forsænkede godt og ikke fra toppen for at forhindre ukontrolleret bevægelse af dissekerede organer. Når rører fiksativ, vil de organer, klæbe til glasset, og hele processen ikke vil bevæge sig.
- Fjern fiksativ og tilsæt 500 ul hybridiseringsbuffer suppleret med 10 pmol af det fluorescerende DNA-probe Cy5-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 ', som er komplementær til en sekvens i TYLCV kappeproteingen.
- Hybridisere natten over ved stuetemperatur i mørke ved at inkubere objektglasset med prøven inde i en lille fugtigt kammer bestående af små plastik kasse med vådt håndklæde papir i bunden.
- Efter hybridisering, afhente organerne med en fin dissektion værktøj og hurtigt flytte dem til en frisk objektglas indeholdende 30 pi ny hybridisering buffer suppleret med DAPI (0,1 mg / ml i 1x PBS) og indeholdt med flydende blocker.
- Dæk prøver med et dækglas, forsegle with neglelak og udsigt under et fluorescens eller konfokal mikroskop.
4.. Plant Handling, Hånd-sektionering, fiksering og hybridisering til TYLCV FISH
- Podes tomatplanter med TYLCV hjælp spiseligt virusinficeret mellus-medieret podning. Den virus kan påvises ved hjælp af denne FISH metode symptomfri planter en uge efter podning. Typiske sygdomssymptomer er synlige tre uger efter inokulering. Brug inficerede tomatplanter og ingen sonde prøver til kontrol for at bekræfte specifik hybridisering.
- Brug en skarp histologisk barberblad for at forberede hånd-cut 2-4 cm lange langsgående eller tværsnit af tomat stængler og blade.
- I Eppendorf-rør, løse sektioner i Carnoy fiksativ i 2 timer til natten over ved stuetemperatur.
- Fjern fiksativ og bevare sektioner i absolut ethanol i flere dage til flere uger ved stuetemperatur, eller gå videre til næste trin.
- Vask sektionernetre gange, 1 min hver i hybridiseringspuffer.
- Hybridiserer afsnittene med 500 pi hybridiseringsbuffer suppleret med 10 pmol af det fluorescerende oligonukleotidprobe Cy3-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 ', som er komplementær til en sekvens i TYLCV kappeproteingen.
- Vask sektionerne tre gange, 1 min hver i hybridiseringspuffer.
- Mount sektioner helhed i hybridisering buffer suppleret med DAPI (0,1 mg / ml i 1x PBS) og indeholdt med flydende blocker, dække med et dækglas, forsegles med neglelak og udsigt under et fluorescens eller konfokal mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Systemet undersøgt i dette manuskript er vist i figur 1 og indbefatter en inficeret plante med TYLCV en voksen og en nymfe af mellus B. tabaci, og den interne anatomi mellus viser vejen for TYLCV translokation i insektet. 2 viser dobbelt FISK i en voksen mellus for den primære symbionten Portiera og den sekundære symbionten Figur Arsenophonus. Figur 3 viser dobbelt FISH for Portiera og Hamiltonella, og Figur 4 viser dobbelt FISH for Portiera og Rickettsia, begge tal i B. tabaci 4 th instar nymfe. Figur 5 viser FISH for TYLCV og DAPI farvning i en mellus dissekeret midgut, og figur 6 viser en FISH for TYLCV og DAPI farvning i en dissekerede mellus primære spytkirtler. Figur 7 viser FISH for TYLCV og DAPI farvning ihånd-cut TYLCV-inficerede plante sektioner.
Figur 1.. Generelt overblik over systemet undersøgt i dette manuskript. A) Typisk sygdomssymptomer forårsaget af infektion med tomat gule blade krøller virus (TYLCV). B) Ekstern visning af en voksen whitefly. C) Ekstern visning af 4 th nymfestadiet i mellus udviklingsmæssige livscyklus. Andre nymfestadier er ens i den almindelige eksterne visning, men mindre i størrelse. D) Skematisk billede af det indre anatomi en voksen B. tabaci viser vej TYLCV erhvervelse fra plante si elementer, cirkulation og transmission (sorte pile). Røde partikler henviser til TYLCV virioner. p: Phloem; s: s tylet e: spiserøret fc: filter kammer, dm: faldende mellemtarmen; am: opadstigende mellemtarmen, ca: caeca; hg: stortarmen, BC: bacteriocytes, PSG:. primær spytkirtel Klik her for at se større billede.
Figur 2. Dobbelt FISH af Portiera og Arsenphonus på B. tabaci Q biotypen voksen (A) og zoome ind på det mærkede område (B) både under lyse felt kanal og kombinerede optiske sektioner afsløre de fluorescerende signaler, der udsendes af hver probe. Portiera-specifik probe (rød) konjugeret til Cy5 og Arsenphonus-specifik probe ( gul), konjugeret med Cy3 blev anvendt. e: æg.pg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.
Figur 3.. Dobbelt fisk af Portiera og Hamiltonella på B. tabaci nymfe. Portiera-specifik probe (rød) konjugeret til Cy5 og Hamiltonella-specifik probe (grøn) konjugeret til Cy3 blev brugt. A) Hamiltonella hybridisering signal fra kombinerede optiske sektioner, og set under mørke felt. B) Portiera hybridisering signal, der opnås fra kombineret optiske sektioner, og set under mørke felt. C) Portiera og Hamiltonella fusionerede signaler under lyse felt. D) Portiera og Hamiltonella kombinerede signaler ses under dark felt. Klik her for at se større billede.
Figur 4.. Dobbelt fisk af Portiera og Rickettsia på B. tabaci nymfe. Portiera-specifik probe (rød), konjugeret med Cy5 og Rickettsia-specifik probe (blå), konjugeret med Cy3, blev anvendt. A) Rickettsia hybridiseringssignal opnået fra kombinerede optiske sektioner og ses under mørke område. B) Portiera hybridiseringssignal opnået fra kombineret optiske sektioner, og set under mørke felt. C) Portiera og Rickettsia kombinerede signaler under lyse felt. D)
Figur 5.. FISH af TYLCV på dissekeret mellemtarmen af en voksen B. tabaci kvinde, der havde erhvervet virus i 48 timer fra en inficeret tomatplante. TYLCV-specifik probe (rød) konjugeret til Cy3 blev brugt, og mellemtarmen blev farvet med DAPI før montering og visualisering. A) dissekeret mellemtarmen set fra kombineret optiske sektioner under lyse felt. B) TYLCV FISH signal (rød) og DAPI farvede kerner (blå) set fra kombinerede optiske sektioner under mørke felt. fc: filter kammer; dm: descendi ng mellemtarmen; er: stigende mellemtarmen, ca: caeca; hg: stortarmen. Klik her for at se større billede.
Figur 6.. Fisk af TYLCV på dissekeret primær spytkirtel af en voksen B. tabaci kvinde, der havde erhvervet virus i 48 timer fra en inficeret tomatplante. TYLCV-specifik probe (rød) konjugeret til Cy3 blev brugt, og spytkirtlerne farvet med DAPI før montering og visualisering. A) dissekeret og DAPI farvede primære spyt kirtel set fra kombinerede afsnit under lyse felt. B) TYLCV FISH signal (rød) og DAPI farvede kerner (blå), som set fra kombinerede afsnit under mørke felt.s :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51030/51030fig6highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.
Figur 7. FISH af TYLCV på hånd-cut længdesnit gennem en stilk af TYLCV-inficerede plante. TYLCV-specifik probe (rød), konjugeret med Cy3 blev anvendt og kombineret med DAPI-farvning før montering og visualisering. A) En sektion med rød TYLCV signal i en Phloem si element, og DAPI farvede kerner set fra kombinerede afsnit under mørke felt. b) Det samme kombinerede sektioner vist i (A) under lyse felt til orientering. ph: Phloem, xy:. xylem Klik her for at se større imalder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den her beskrevne til lokalisering af en plante virus i sin fabrik vært og insektvektor og endosymbiotic bakterier i deres specifikke mellus vært protokol kan tilpasses til lokalisering af andre vira i planter og selv i dyrevæv. Endvidere kan protokollen anvendes til at lokalisere endosymbiotic og sygdomsfremkaldende bakterier og andre mikroorganismer i vegetabilske og animalske systemer. De beskrevne metoder er afhængige af enkle koncept af hybridisering mellem en kort, fluorescens-mærket oligonucleotid-DNA-probe og mål-DNA-eller RNA-molekyle i cellen. Resultatet er en specifik hybridisering med minimal baggrund, og et signal detekteres ved hjælp af fluorescens eller konfokale mikroskoper. Flere prober med forskellige fluorescerende farvestoffer, der er målrettet mere end ét gen, der kan bruges samtidig. Dette gør det muligt at visualisere mere end et mål i en enkelt celle eller væv. De er beskrevet i disse protokoller er enkle og prøven behandlingstider minimal. Problemer i forbindelse med andre protokoller, såsom høj baggrund signal, lang sagsbehandlingstid for prøver og brug af mange og dyre materialer til analysen, er ikke begrænsninger i protokollen beskrevet her.
B-og Q biotyper af B. tabaci whiteflies blev brugt til at beskrive de protokoller i dette manuskript, men opvaekstomstaendigheder gælder for enhver whitefly biotype, med deres respektive værtsplante. Den whitefly fuldender dets livscyklus på tre uger under de angivne betingelser. Hver enkelt af B biotype befolkning brugte, var smittet med den primære endosymbiont Portiera, og de sekundære endosymbiotic bakterier Hamiltonella og Rickettsia. Q biotype personer blev smittet med Portiera og Arsenophonus. Andre mellus befolkninger rundt om i verden viste sig at være inficeret med disse eller andre endosymbiotic bakteriearter, og med forskellige rumlige localizatipå mønstre i kroppen 16-20.
TYLCV inficerede planter viser typiske sygdomssymptomer tre uger efter ugen podningen. For TYLCV lokalisering, kan symptomatiske planter anvendes til virus overtagelse af mellus i 24 timer, og virus kan påvises i inficerede planter og insekter ved hjælp af FISH-protokollen beskrevet ovenfor. Mens der i insekter de anvendte prober kan konjugeres med mange fluorofor, som kan udskæres med forskellige bølgelængder, herunder Cy3 og Cy5, i planter Cy3 er det mest egnede og ikke fluorescerer ved tilsvarende bølgelængder som chloroplaster, den mest udbredte organeller i plantecellen.
En vellykket gennemførelse af de beskrevne protokoller for lokalisering af bakterier og virus i planter og insekter, afhænger af god fiksering af prøverne for bedre visualisering og sonde penetration, god sonde design for specificitet og clearing med H 2 O 2 i tilfælde af hele insekter til bafter signal visualisering. I tilfælde af fisk i planter skal håndlavede sektioner være så tynd som muligt for god probe indtrængning og bedre visualisering af signalet. Dette kan forbedres ved at sætte bladet mellem to Styrofoam stykker til at hjælpe med opskæring og ved hjælp af professionelle barberblade, som kan købes til dette formål fra flere leverandører.
Protokollen er ikke egnet til subcellulær lokalisering af mål, men det har potentiale til at blive udviklet ved hjælp af probe-format beskriver her, i en egnet fremgangsmåde til subcellulær lokalisering. For eksempel kan de korte prober beskrevet her konjugeres til molekyler, såsom biotin og ikke fluorescerende molekyler, som igen kan målrettes under anvendelse af guldpartikler konjugeret til streptavidin, der kan visualiseres under TEM. Denne senere modifikation kan være egnet til subcellulær lokalisering af flere mål, herunder gentranskripter og mikroorganismer. Endelig beskrevne protokols er egnede til hybridisering med nukleinsyrer, såsom DNA og RNA, men ikke proteiner.
For at opnå de bedste resultater i fisken protokoller er beskrevet her, er det bedst at bruge frisk insekt-og plantemateriale, samt frisk fiksativ og hybridisering buffere. Sonderne skal altid holdes i -20 º C i små portioner for at undgå gentagen nedfrysning og optøning. Behandlingstiden for hver beskrevne trin kan kalibreres efter de undersøgte organismer. Som nævnt i protokollen, efter fiksering og blegning, mellus og plante prøver kan bevares for lang tid i absolut ethanol ved stuetemperatur. Dette trin er særligt nyttigt, når der sendes prøver til forarbejdning fra et sted til et andet, eller når der udføres lange tidsforløb eksperimenter. Kvaliteten af hybridiseringssignal blev ikke påvirket efter denne lange tid konservering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forskning i Ghanim lab blev støttet af forskningsbevilling nej. 908-42.12/2006 fra den tysk-israelske Foundation (GIF), ikke give. IS-4062-07 fra USA-Israel Binational Agricultural Research og Development Fund (BARD), og forskningsbevilling nej. 884/07 fra Israel Science Foundation (ISF) til MG
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescently labeled Probes | Metabion | 20 bp HPLC purified | Sequence designed by customer |
| Toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | Molecular Biology Grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Liquid Blocker | Ted Pella Inc. | 22309 |
References
- Czosnek, H., Laterrot, H. A worldwide survey of Tomato yellow leaf curl viruses. Arch. Virol. 142, 1391-1406 (1997).
- Ling, K. S., Simmons, A. M., Hassell, R. L., Keinath, A. P., Polston, J. E. First report of Tomato Yellow Leaf Curl Virus in South Carolina. Plant Dis. 90, 379 (2006).
- Polston, J. E., McGovern, R. J., Brown, L. G. Introduction of Tomato yellow leaf curl virus in Florida and implications for the spread of this and other geminiviruses of tomato. Plant Dis. 83, 984-988 (1999).
- Polston, J. E., Rosebrock, T. R., Sherwood, T., Creswell, T., Shoemaker, P. J. Appearance of Tomato yellow leaf curl virus in North Carolina. Plant Dis. 86, 73 (2002).
- Frohlich, D. R., Torres-Jerez, I., Bedford, I. D., Markham, P. G., Brown, J. K. A phylogeographical analysis of the Bemisia tabaci species complex based on mitochondrial DNA markers. Mol. Ecol. 8, 1683-1691 (2002).
- Ghanim, M., Morin, S., Czosnek, H. Rate of Tomato yellow leaf curl virus translocation in the circulative transmission pathway of its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Phytopathology. 91, 188-196 (2001).
- Ghanim, M., Rosell, R. C., Campbell, L. R., Czosnek, H., Brown, J. K., Ullman, D. E. Digestive salivary and reproductive organs of Bemisia tabaci (Gennadius) Hemiptera: Aleyrodidae) B type. J. Morphol. 248, 22-40 (2001).
- Hunter, W. B., Hiebert, E., Webb, S. E., Tsai, J. K., Polston, J. E. Location of geminiviruses in the whitefly Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae). Plant Dis. 82, 1147-1151 (1998).
- Rosell, R. C., Torres-Jerez, I., Brown, J. K. Temporal pathway of geminivirus in whitefly extracts, saliva, hemolymph and honeydew. Phytopathology. 89, 239-246 (1999).
- Czosnek, H., Ghanim, M., Ghanim, M. The circulative pathway of begomoviruses in the whitefly vector Bemisia tabaci—insights from studies with Tomato yellow leaf curl virus. Ann. Appl. Biol. 140, 215-231 (2002).
- Gottlieb, Y., et al. The transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virusby the whitefly Bemisiatabaciis correlated with the presence of aspecificsymbiotic bacterium species. J. Virol. 84, 9310-9317 (2010).
- Brumin, M., Levy, M., Ghanim, M. Transovarial transmission of Rickettsia spp. and organ-specific infection of the whitefly Bemisia tabaci. Appl. Environ. Microbiol. 78, 5565-5574 (2012).
- Ghanim, M., Medina, V. Localization of Tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector Bemisia tabaci. In Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease, Management, Molecular Biology, Breeding for Resistance. Czosnek, H. , Springer. New York. 175-187 (2007).
- Ghanim, M., Brumin, M., Popovski, S. A simple, rapid and inexpensive method for localization of Tomato yellow leaf curl virus and Potato leafroll virus in plant and insect vectors. J. Virol. Methods. 159, 311-314 (2009).
- Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. J. Virol. 86, 13241-13252 (2012).
- Nirgianaki, A., et al. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47, 93-101 (2003).
- Baumann, P. Biology of bacteriocyte-associated endosymbionts of plant sap-sucking insects. Ann. Rev. Microbiol. 59, 155-189 (2005).
- Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (Homoptera) Aleyrodidae). App. Environ. Microbiol. 72, 3646-3652 (2006).
- Li, Z. X., Lin, H. Z., Guo, X. P. Prevalence of Wolbachia infection in Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 54, 467-471 (2007).
- Skaljac, M., Zanic, K., Hrncic, S., Radonjic, S., Perovic, T., Ghanim, M. Diversity and localization of bacterial symbionts in three whitefly species (Hemiptera: Aleyrodidae) from the east coast of the Adriatic. Bull. Entomol. Res. 103, 48-59 (2013).
