Summary
ここではin situハイブリダイゼーションの単純な蛍光（FISH）昆虫や植物組織中のウイルスや細菌の局在のための方法を説明します。このプロトコルは、全体のマウントおよび顕微鏡用切片におけるmRNAの可視化のために拡張することができます。
Abstract
in situハイブリダイゼーション （FISH） の蛍光は、一般に、真核細胞における遺伝子転写産物を可視化し、さらに、ウイルスや細菌による感染などの細胞内の他のコンポーネントを視覚化するために修飾することができるために使用される技術の様々に与えられた名称である。空間的局在および感染プロセス中のウイルスや細菌の可視化は、様々な刺激に応答してそのようなマイクロアレイおよびRNAseqとして発現プロファイリング実験を補完する重要なステップです。これらの試薬を用いた時空間の感染症を理解することは、細胞成分との相互作用を理解することを目的とした生物学的な実験を補完するものです。このようなレポーター遺伝子システムまたは免疫組織化学的方法などのウイルスおよび細菌を視覚化するためのいくつかの技術は時間がかかり、そしていくつかはモデル生物で動作し、複雑な方法論を含むよう限定される。細胞内のRNAまたはDNA種を対象としたFISHは比較的容易で、速い私です遺伝子の時空間局在を研究するための診断目的のためにTHOD。この方法は、堅牢でプロトコルは高価ではありません短いダイズ、商業的に購入したプローブを用いた場合に実施するのが比較的簡単にすることができます。試料調製、固定、ハイブリダイゼーション、および顕微鏡的視覚化は、複雑な工程を含まない場合に特に強固である。ここでは、昆虫や植物組織中の細菌やウイルスの局在化のためのプロトコルを記述します。この方法は、その5 'または3'末端に蛍光色素に結合させ20塩基対の短いDNAプローブを用いた簡単な準備、固定、および昆虫ホールマウントし、解剖し臓器や手作りの植物切片のハイブリダイゼーションに基づいています。このプロトコルは、正常昆虫および植物組織の数に適用されており、細胞内のmRNAもしくは他のRNAまたはDNA種の発現を分析するために使用することができる。
Introduction
それらの感染植物宿主と共に植物ウイルスおよび他の病原体の間の相互作用を研究するとき、それらはそれらの宿主に悪影響を引き起こすかどうかにかかわらず、 その場での病原体及びそれらのそれぞれの核酸を可視化することが重要である。植物細胞内病原体との間の動きを研究する場合に最も重要である。病原体の遺伝子産物のin situ局在化において病原性プロセスを研究するための他のアプローチを補完する重要なステップである。多くの植物病原体、特にウイルスは、それらのベクトルとの複合体との親密な相互作用を持つ、昆虫によって送信される。そのベクターでは、これらのウイルスの局在は、伝送のための経路、およびベクトル内部の可能な相互作用部位を研究するために重要である。いくつかの昆虫ベクトル化植物ウイルスの送信は、これらの昆虫内に存在する共生細菌によって助けられる。よりよいこれらの植物ウイルスBの送信を研究するために、yは、それらのベクターは、それは、特に、一般的な共生細菌およびウイルス伝播に関与するものを視覚化することも重要である。ウイルスや共生細菌の共局在は、このように彼らの昆虫宿主内でこれらの生物間の可能性のある関係を調査のために望ましい。脇にウイルスを送信してから、共生細菌が昆虫のベクターの生物学のいくつかの側面に影響を与え、昆虫内でのこれらの細菌のこのような空間局在は、高い関心と重要である。
トマト黄化葉巻ウイルス （TYLCV）（ベゴモウイルス、Geminiviridae）は、世界中で栽培トマト1-4の中で最も重要なウイルス性疾患の複合体である。 TYLCVは師部限定のウイルスであり、独占的にコナジラミコナジラミコナジラミ 5,6によってベクトル化されている。そのコナジラミのベクターにbegomovirusesの移行を記述するモデルは6-9提案されている。二つの具体的な障壁は、積極的にDUR交差している腸/血リンパおよび血リンパ/唾液腺の障害：この循環送信をING。この送信処理は、ウイルスキャプシドを認識し、未知の受容体によって媒介されると仮定される。 TYLCVはBを横断すると考えられているコナジラミの腸6,10、それが植物内に注入する前に、プライマリ唾液腺6を介して吸収される。コナジラミ血リンパでは、TYLCVは昆虫の二次共生細菌Hamiltonellaによって生成のGroELタンパク質と相互作用する。この相互作用は、血リンパにTYLCVの安全な輸送を確保し、昆虫の免疫系11。HamiltonellaとPortiera、一次細胞内共生による攻撃から保護するコナジラミの、bacteriocytes、血リンパやハウス内共生細菌11で見つかった昆虫細胞内に収容されている。B.コナジラミはリケッチア、Arsenophonus、ボルバキアとフリッチュ含む追加の共生細菌を保有bacteriocytes内側または外側に局所化することができ、EAは、昆虫の生物学12に多様な効果を持っている。
いくつかの報告が微小厚部10,13上にその場で 、例えば透過型電子顕微鏡（TEM）、抗体およびRNAのような時間がかかり、高価なプロトコルを用いて植物およびコナジラミにおけるTYLCVの局在化を研究するために試みられているが、最近の研究では、局在化を記載単純なプロトコル14を使用して、彼らの工場とベクトルのホスト内部の植物ウイルスの。ここでは、BのTYLCVの局在化のための単純なプロトコルを記述タバココナジラミは、中腸と唾液腺を解剖して、セクションでTYLCVに感染した植物から調製した。我々はさらにPortiera、Bの一次細胞内共生の局在を説明コナジラミ、およびその二次共生Hamitonella、リケッチアおよびArsenophonus。このプロトコルは、短いDNAプローブを用いることに基づくということです蛍光5 '末端に標識され、具体的には、ウイルスまたは細菌の遺伝子配列中の相補配列にハイブリダイズされる。サンプル処理は比較的容易であり、得られた信号は、非常に特異的である。記載されたプロトコルは、それらの植物、動物および昆虫宿主においてウイルス、細菌および他の病原体を局在化するために使用することができ、さらに、任意の所与の組織中のmRNAを局在化するために使用することができる。
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Protocol
1。 FISH解析のための一般的なコナジラミ、プラント、およびウイルス調製
- リアBとQバイオタイプ綿の苗（ ワタヒルスツム L.品種不動明王）にコナジラミおよび25±2℃、相対湿度60％の標準的な条件下で防虫ケージと成長室の内部で維持し、14時間の明/ 10時間暗の光。
- 前に説明した15〜19のように細胞内共生特異的プライマーを用いて内部共生の感染をテストするためにPCRを行う。
- 商用保育園や植物トマトの種子からトマトの苗（ ナスエスクレンタムビーフステーキ）を購入。
- 植物はTYLCV 15のコナジラミ媒介接種に最も適した年齢は（セクションの下に4.1を参照）、4真葉期に達するまで、上記と同様の飼育条件で維持する。
2。遠藤昆虫処理、固定、プローブ設計、ハイブリダイゼーション、および可視化共生FISH
- 綿植物からの吸引により10大人のコナジラミを収集、または綿の葉から10 第 3または第 4齢幼虫を選ぶ。
- すぐにエッペンドルフチューブ内部のカルノア固定液（クロロホルム - エタノール - 氷酢酸、6時03分01秒、体積/体積）に浸す。一晩に2時間（好ましくは一晩）を修正しました。
- 完全に固定液を除去し、2時間、エタノール中の6％H 2 O 2で脱色。
- 室温で数日から数週間のための無水エタノール中のサンプルを保存したり、次のステップに進みます。
- 各細菌の16SリボソームRNA遺伝子に基づいて補完的なリバースDNAプライマーとして設計プローブ。プローブを設計するために、考慮にPCRプライマーを設計するための同じ考慮がかかる。オリゴヌクレオチドプローブを使用BTP1 5'-Cy5でTGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3 '、5'-Rb1をCy3でTCCACGTCGCCGTCTTGC-3'、5'-BTHのCy3-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3 'および5'-Ars2のcy3-TCATGACCACAACCTCCAAA-3 'は、それぞれPortiera、リケッチア、Hamilonella、およびArsenophonus、の特異的標的化のために。
- ml当たり10pmolの蛍光プローブを含有する暗ハイブリダイゼーション緩衝液中（20mMのトリス-HCl、pH8.0、0.9 MのNaCl、0.01％[重量/容量]ドデシル硫酸ナトリウム、30％[容量/容量]ホルムアミド）中で一晩サンプルをハイブリ。必要に応じて、異なる蛍光色素で、複数のプローブを兼ね備えています。ネガティブコントロールとして目標と細菌と非プローブのサンプルと非感染コナジラミを使用してください。
- 液体ブロッカーを備えた自給ハイブリダイゼーション緩衝液中で、顕微鏡スライド上に、全体のサンプルをマウントカバーガラスで覆い、蛍光または共焦点顕微鏡下でのマニキュア、およびビューで密封する。
3。コナジラミオルガン解離、ボール、ハイブリダイゼーション、およびTYLCVの魚のための可視化
- 連続して吸引とANEでTYLCV感染トマト植物で飼育大人のコナジラミを収集アセトンを含浸させた紙タオルに暴露することによってsthetize。アセトン長すぎて露出がコナジラミ組織を固定できるようにわずか1〜2分間コナジラミを公開します。特異的ハイブリダイゼーションを確認するために、非感染トマト植物とコントロールをなしプローブサンプルで飼育nonviruliferousコナジラミを使用してください。
- うつ病顕微鏡のマウントコナジラミは、実体顕微鏡を用いて、臓器の解剖のためにスライドさせる。
- 前胸から昆虫ヘッドを引き離すと、1X PBS中に唾液腺を解剖は、その小さなサイズのため、より良い視覚化のために、1％トルイジンブルー染色を補った。 2〜3分間汚れの吸収を可能にします。
- 観察し、腸を排出するために胸部と腹部の間の接合部で離れて昆虫を引く。腹部先端に鉗子で押すことで、腹部の内容を追放。
- 静かに成功した解剖からPBSおよびトルイジンブルーを削除して、ゆっくりと5分間の臓器を固定するためのカルノア固定液を300μlを加える。
- A解剖した臓器の制御不能な動きを防止するために落ち込んウェルの片側からではなく、上から固定液をD-D固定液に触れると、臓器がガラスに付着し、プロセス全体を通じて、彼らは移動しません。
- 固定液を除去してTYLCVコートタンパク質遺伝子の配列に相補的な蛍光DNAプローブのCy5-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 '、10pmolの補充したハイブリダイゼーション緩衝液500μlを加える。
- 下部に濡れタオルペーパーで小さなプラスチックの箱で構成小さな加湿チャンバー内部の試料をスライドをインキュベートすることにより、暗所で室温で一晩ハイブリダイズ。
- ハイブリダイゼーション後、細かい解剖ツールで臓器をピックアップし、急速にDAPI（1X PBS中0.1 mg / ml）を補充した液体ブロッカーに含まれている新たなハイブリダイゼーション緩衝液30μlを含有する新鮮な顕微鏡スライドに移動します。
- カバーガラスで標本をカバーする、ウィットをシール蛍光または共焦点顕微鏡下でのHのマニキュアとビュー。
4。 TYLCVの魚のための植物の処理、ハンド切片、固定、及びハイブリダイゼーション
- 病原体を持つコナジラミ媒介接種を使っTYLCVとトマトの苗に接種。ウイルスは、無症候性植物におけるこのFISH法接種後一週間を用いて検出することができる。典型的な病気の症状は、目に見える3週間後接種である。特異的ハイブリダイゼーションを確認するためのコントロールの非感染トマト植物なしプローブのサンプルを使用してください。
- トマトのハンドカット2〜4センチメートル長い縦または断面を製造するための鋭利な組織学的かみそりの刃を使用して、茎葉。
- エッペンドルフチューブ中で、2時間まで、室温で一晩のためにカルノア固定液中でのセクションを修正。
- 固定液を除去して、室温で数日から数週間のために無水エタノールにセクションを保存したり、次のステップに進みます。
- セクションを洗うハイブリダイゼーション緩衝液中で3回、各々1分、。
- TYLCVコートタンパク質遺伝子内の配列に相補的な蛍光性オリゴヌクレオチドプローブのCy3-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 '10pmolのを補充したハイブリダイゼーション緩衝液500μlで切片をハイブリダイズする。
- ハイブリダイゼーション緩衝液中で、各項を3回、1分ごとに洗浄します。
- DAPI（1×PBS中0.1 mg / ml）を補充した液体ブロッカーに含まれているハイブリダイゼーション緩衝液中のホールマウント部分は、蛍光または共焦点顕微鏡下でのマニキュアとビューで密封、カバーガラスでカバーしています。
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Representative Results
この原稿で研究システムは、 図1に示されており、TYLCVに感染した植物は、成人およびコナジラミBのニンフが含まれているコナジラミ、昆虫におけるTYLCV転のための経路を示すコナジラミの内部解剖図2は 、一次共生生物Portieraと二次共生生物Arsenophonusのための大人のコナジラミに二重魚を示しています。図3は、PortieraとHamiltonella二重魚を示しており、 図4は Portieraとリケッチア、Bの両方の図のための二重の魚を示していますコナジラミ 第 4齢ニンフ図5コナジラミ解剖し、中腸内TYLCV及びDAPI染色のために魚を示し、 図6を解剖コナジラミ原発唾液腺におけるTYLCV及びDAPI染色のために魚を示しています。図7は、中TYLCVとDAPI染色のために魚を示していますハンドカットのTYLCVに感染した植物のセクション。
図1。この原稿で研究システムの一般的な概要 トマト黄化葉巻ウイルス（TYLCV）。B）の感染によって引き起こされる。A）一般的な病気の症状大人のコナジラミ4 番目の幼虫の段階の。C）外観の外観図コナジラミ発達ライフサイクルの。他の幼虫の段階は、一般的な外観は似ているが、サイズが小さくなっている。D）大人のBの内部組織の模式図コナジラミは、植物の篩要素、循環とトランスミッション（黒矢印）からのTYLCV獲得の経路を示す。赤い粒子はTYLCVビリオンを参照してください。 P：師部、S：S tylet、E：食道; FC：フィルター室、DM：降順腸;服装：;：盲腸; HG：CA腸昇順後腸、BC：bacteriocytes、PSG：原発唾液腺は拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図2。 BのPortieraとArsenphonusの二重FISH コナジラミ Qバイオタイプアダルト（A）と明視野チャネルの下と結合された光のセクションでは、各プローブによって放出される蛍光シグナルを検出し、両方のラベル面積（B）を調べます。Portiera 特異的プローブ（赤）のCy5とArsenphonus特異的プローブに結合させ（イエロー）のCy3とコンジュゲートを使用した。 E：卵。PG "ターゲット=" _blank ">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図3。B上のPortieraとHamiltonellaのダブルFISHから取得したコナジラミニンフ。Portiera特異的プローブ（赤）のCy5とコンジュゲートおよびCy3に結合させHamiltonella特異的プローブ（緑）を使用した。A）Hamiltonellaハイブリダイゼーション信号が結合された光のセクションから入手し、暗視野下で見た。B）Portieraハイブリダイゼーションシグナル光学部分を組み合わせ、暗視野下で見た。C）PortieraとHamiltonellaは明視野の下で信号を統合しました。D）DA下で見PortieraとHamiltonella合成された信号RKフィールド。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図4。B上のPortieraとリケッチアのダブルFISH コナジラミニンフ。Portiera 特異的プローブ（赤色）をCy5とコンジュゲートおよびCy3とコンジュゲートリケッチア属特異的プローブ（青）を使用した。A） リケッチアハイブリダイゼーションシグナル複合光学切片から得られ、暗視野下で見た。B）から得Portieraハイブリダイゼーションシグナル明視野の下に光学部分を組み合わせ、暗視野下で見た。C）Portieraおよびリケッチア合成された信号。D）
図5。大人のBの解剖し腸にTYLCV魚感染したトマト植物からの48時間のウイルスを獲得していたタバココナジラミの女性。をCy3に結合させTYLCV特異的プローブ（赤）を使用し、中腸をマウントし、可視化する前にDAPIで染色した。A）を組み合わせから見て解剖し、中腸暗視野下の結合された光のセクションから見た明視野の下での光のセクション。B）TYLCVのFISH信号（赤）およびDAPI染色された核（青）。 FC：フィルター室、DM：descendi NG腸は、午前：昇 順中腸、CA：盲腸; HG：後腸。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図6。大人のBの解剖し、一次唾液腺にTYLCV魚感染したトマト植物から48時間、ウイルスを獲得していたタバココナジラミの女性のCy3とコンジュゲート。TYLCV特異的プローブ（赤）を使用した、実装および視覚化する前にDAPIで染色された唾液腺であって、a）解剖し、DAPIは、プライマリ唾液を染色暗視野下の組み合わせのセクションから見た明視野の下で組み合わせた部分から見た。B）TYLCVのFISH信号（赤）およびDAPI染色された核（青）などの腺。S :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51030/51030fig6highres.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
赤で示され、図7。TYLCVに感染した植物の茎を通してハンドカット縦断面上のTYLCV魚のCy3とコンジュゲート。TYLCV特異的プローブ（赤）をマウントし、可視化する前に使用し、DAPI染色と組み合わせた。a）1つのセクション師部ふるい要素におけるTYLCV信号、および暗視野下の組み合わせのセクションから見DAPI染色した核。B）配向のための明視野の下で、（A）に示したのと同じ結合されたセクション。 pHは師部、XY：木部大きなIMを見るにはここをクリックしてください時代。
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Discussion
その具体的なコナジラミホストでの植物宿主と昆虫ベクターにおける植物ウイルスの局在のためにここで説明するプロトコル、および共生細菌は、植物であっても動物組織内の他のウイルスの局在に適応させることができる。さらに、プロトコルは、植物および動物系において共生および病原性細菌および他の微生物を局在化するために使用することができる。記載された方法は、短い、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドDNAプローブと細胞中の標的DNAまたはRNA分子間のハイブリダイゼーションの単純な概念に依存する。結果は、最小バックグラウンドを持つ特異的ハイブリダイゼーション、および蛍光または共焦点顕微鏡を用いて検出する信号である。複数の遺伝子を標的異なる蛍光色素を持ついくつかのプローブは、同時に使用することができる。これは、単一の細胞または組織内の複数の標的を可視化が可能となる。これらのプロトコルに記載の手順は簡単であり、試料処理時間最小限に抑えられます。このような高いバックグラウンド信号など、他のプロトコル、長い処理時間と検体の分析のための多数の、高価な材料の使用に関連する問題は、ここに記載のプロトコルに制約されない。
BのBとQバイオタイプタバココナジラミのコナジラミは本稿でのプロトコルを記述するために使用されたが、飼育条件は、それぞれの宿主植物で、任意のコナジラミバイオタイプに適用されます。コナジラミは、指定された条件の下で3週間で、そのライフサイクルを完了する。中古Bバイオタイプ集団の各個体は、一次細胞内共生Portiera、および二次共生細菌Hamiltonellaやリケッチアに感染させた。のQバイオタイプの個人がPortieraとArsenophonusを感染させた。世界中の他のコナジラミ個体群は、これらのかに感染していることが示された他の内共生細菌種、および異なる空間localizatiとボディー16〜20のパターンに。
TYLCV感染した植物は、接種後3週間、一般的な病気の症状を示す。 TYLCV定位については、症候性植物は、24時間コナジラミによるウイルス捕捉のために使用することができ、ウイルスは、上記のFISHプロトコルを使用して、感染した植物および昆虫を検出することができる。昆虫で使用されるプローブはCy3およびCy5などの異なる波長を用いて切除することができ、多くのフルオロフォアと結合させることができるが、植物でのCy3が最も適していると、葉緑体と同様の波長で植物細胞中で最も豊富な細胞小器官を蛍光を発しない。
植物や昆虫、細菌やウイルスの局在化のための記載されたプロトコルの実装を成功させるには、よりよい可視化とプローブの浸透のためのサンプルの良好な固定に依存するため、全昆虫の場合、H 2 O 2との特異性とクリアのための良いプローブ設計Better信号の可視化。植物の魚の場合には、手作りのセクションでは、優れたプローブの浸透、信号のより良い視覚化のために、可能な限り薄くなければならない。これは、切削を支援する2発泡スチロール片の間葉を入れて、いくつかのベンダーから、この目的のために購入することができ、プロのかみそりの刃を使用することによって改善することができる。
プロトコルは、しかし、それはプローブの形式は細胞内局在に適した方法に、ここで説明する使用して、開発される可能性を秘めている、ターゲットの細胞内局在には適していません。例えば、ここで説明する短いプローブは、ビオチン、順番にTEM下で可視化することができ、ストレプトアビジンにコンジュゲートした金粒子を用いて標的化され得る蛍光分子ではない、などの分子にコンジュゲートすることができる。この後者の修飾は、遺伝子転写物および微生物を含むいくつかの標的の細胞内局在のために適切であり得る。最後に、説明されたプロトコルsはそのようなDNAおよびRNAはなく、タンパク質のような核酸とのハイブリダイゼーションに適している。
ここで説明するFISHプロトコルにおける最良の結果を得るためには、新鮮な昆虫と植物材料だけでなく、新鮮な固定およびハイブリダイゼーションバッファーを使用するのが最適です。プローブは常に凍結融解の繰り返しを避けるために、小アリコートで-20℃に保たれるべきである。各説明した工程の処理時間を研究する生物に応じて校正することができる。プロトコルで述べたように、固定及び脱色以下、コナジラミ、プラントのサンプルは、室温で無水エタノールで長時間保存することができる。ある場所から別の場所へ処理のためにサンプルを送るとき、または長い時間経過実験を行う場合、このステップは、特に有用である。ハイブリダイゼーション信号の品質は、この長期保存以下の影響を受けなかった。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
Ghanimラボでの研究は研究助成金なしでサポートされていました。ドイツ·イスラエル財団（GIF）から908-42.12/2006は、無許可する。 IS-4062から07米国 - イスラエル二国間農業研究と開発基金（BARD）、および研究助成金がないから。 MGにイスラエル科学財団（ISF）から884/07
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescently labeled Probes | Metabion | 20 bp HPLC purified | Sequence designed by customer |
| Toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | Molecular Biology Grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Liquid Blocker | Ted Pella Inc. | 22309 |
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