Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Floresan doi: 10.3791/51030 Published: February 24, 2014

Summary

Biz, böcek ve bitki dokularında virüs ve bakterilerin lokalizasyonu için burada in situ hibridizasyon, basit bir floresan (FISH) yöntemi tarif eder. Bu protokol bütün montaj mRNA görselleştirme ve mikroskopik bölümleri için uzatılabilir.

Abstract

In situ hibridizasyon (FISH) floresan yaygın ökaryotik hücrelerde gen transkript görselleştirme ve bundan başka, virüs ve bakteri enfeksiyonu gibi hücreye diğer bileşenleri görselleştirmek için modifiye edilebilir için kullanılan çeşitli teknikler verilen bir isimdir. Mekansal yerelleştirme ve enfeksiyon sırasında virüs ve bakterilerin görselleştirme farklı uyaranlara tepki olarak böyle mikroarray'ler ve RNAseq olarak ifade profilleme deneyler tamamlayan önemli bir adımdır. Bu maddelerle zamanmekansal enfeksiyonları anlama hücresel bileşenler ile etkileşimi anlamaya yönelik biyolojik deneyler tamamlar. Bu tür raportör gen sistemleri veya immünohistokimyasal yöntemler gibi virüs ve bakterileri görselleştirmek için çeşitli teknikler zaman alıcıdır ve bazı model organizmalar ile çalışmak ve karmaşık yöntemler dahil sınırlıdır. Hücreye RNA ya da DNA türleri hedef FISH nispeten kolay ve hızlı bir benimgenlerin zamanmekansal lokalizasyonu eğitim ve tanı amaçlı ThOD. Bu yöntem sağlam ve protokolleri pahalı değil kısa hibritlenmesini, ticari olarak satın sondalar, istihdam zaman uygulanması nispeten kolay olabilir. Örnek hazırlama, tespit, melezleme ve mikroskopik görüntüleme karmaşık adımlar içermeyen bu özellikle sağlamdır. Burada böcek ve bitki dokularında bakteri ve virüslerin lokalizasyonu için bir protokol açıklar. Bu yöntem, 5 'ya da 3' floresan boyalar konjüge kısa DNA probları uçları 20 baz çifti ile basit bir hazırlama, tespit ve böcek bütün bağlar ve kesilen organlarda veya el yapımı bitki bölümlerinin hibridizasyona dayanır. Bu protokol, başarılı bir şekilde böcek ve bitki dokularının, bir dizi tatbik edilmiştir ve hücrede mRNA veya başka RNA veya DNA türleri ifadesini analiz etmek için kullanılabilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Onların hastalıklı bitki barındıran bitki virüs ve diğer patojenleri arasındaki etkileşimleri inceleyerek, bu onların bilgisayarlar üzerinde olumsuz etkilere neden bakılmaksızın, in situ patojenleri ve kendi nükleik asitleri görselleştirmek için önemlidir. Bitki hücreleri içinde ve arasında patojen hareketini incelemek bu çok önemlidir. Patojenin gen ürünlerinin yerinde Yerleştirmede patojenite sürecini incelemek için diğer yaklaşımları tamamlamaktadır önemli bir adımdır. Birçok bitki patojenleri, özellikle virüsler, kendi vektörleri ile karmaşık ve samimi etkileşimleri olan, böcekler tarafından iletilir. Kendi vektörlerde bu virüslerin lokalizasyonu iletim yolunu incelemek için önemlidir ve vektör içinde olası etkileşim siteleri. Bazı böcek-vectored bitki virüsleri iletim bu böceklerin içinde ikamet endosimbiyotik bakteriler tarafından destekli. Iyi bu bitki virüsleri b iletim incelemek içinbunların vektörleri, genel olarak endosimbiyotik bakteriler görsel ve özellikle virüs aktarımı dahil olanlar, için de gereklidir y. Virüs ve endosimbiyotik bakteriler yardımcı sınırlama böylece böcek ev sahibi olan bu organizmalar arasındaki olası ilişkileri araştırmak için arzu edilir. Kenara virüs iletim, endosimbiyotik bakteri böcek vektörlerin biyolojinin çeşitli yönlerini etkileyen, böceklere olan bu bakterilerin, böylece mekansal lokalizasyonu yüksek ilgi ve önem taşımaktadır.

Domates sarı yaprak kıvrılma virüsü (TYLCV) (Begomovirüs, Geminiviridae), tüm dünyada yetiştirilen 1-4 domates en önemli viral bir hastalıktır karmaşıktır. TYLCV floem sınırlı bir virüs olduğunu ve sadece beyaz sinek Bemisia tabaci 5,6 ile vectored edilir. Onların beyaz sinek vektörlerinde begomovirüslerinden translokasyon açıklayan bir model 6-9 önerilmiştir. İki özel bariyerler aktif dur kesilmişlerdirmidgut / hemolenfi ve hemolenfi / tükürük bezi bariyerler: Bu circulative iletimini ing. Bu iletim işlemi virüs kapsidine kabul bilinmeyen alıcıları tarafından aracılık ettiği varsayılmaktadır. TYLCV B. çapraz düşünülmektedir Bu bitki içine enjekte edilmeden önce orta bağırsak tabaci 6,10 ve birincil salya bezi 6 boyunca emilir. Beyaz sinek hemolimf ise, TYLCV böcek ikinci endosimbiyotik Hamiltonella bakteri tarafından üretilen bir proteinin GroEL ile etkileşime girer. Bu etkileşim hemolimfteki TYLCV güvenli taşıma sağlayan ve böcek bağışıklık sistemi 11. Hamiltonella ve Portiera birincil endosymbiont tarafından saldırılara karşı korur beyaz sinek, bacteriocytes yerleştirilmiştir, hemolenfi ve ev endosimbiyotik bakteriler 11. B. bulunan böcek hücreleri tabaci Rickettsia'lara, Arsenophonus, Wolbachia ve Fritsch gibi ek endosimbiyotik bakteri barındırırbacteriocytes içinde veya dışında lokalize edilebilir ve adet, böceğin biyolojisi 12 farklı etkileri vardır.

Çeşitli raporlar mikroskobik kalın bölümünde 10,13 üzerinde yerinde böyle Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM), antikorlar ve RNA gibi zaman alıcı ve masraflı protokolleri kullanarak bitki ve limonluk içinde TYLCV yerelleştirme çalışması için çalıştılar, yeni bir çalışma lokalizasyonu tarif basit bir protokol 14 ile kendi tesis ve vektör konak içindeki bitki virüsleri. Burada B. TYLCV lokalizasyonu için basit bir protokol açıklar tabaci midguts ve tükürük bezleri disseke ve bölümlerde TYLCV-enfekte bitkilerden hazırladı. Biz daha Portiera, B. birincil endosymbiont lokalizasyonunu tarif tabaci ve ikincil endosimbiyontlar Hamitonella, Rickettsia ve Arsenophonus. Bu protokol, kısa DNA sondaları kullanılarak dayalı olduğunufloresan, 5 'ucunda etiketlenmiştir ve özellikle viral ya da bakteriyel gen dizilerinde tamamlayıcı dizilere hibridize edilir. Numune işleme nispeten kolaydır ve elde edilen sinyal çok özeldir. Açıklanan protokol, bunların bitki, hayvan ve böcek ana virüs, bakteri ve diğer patojenleri lokalize etmek için kullanılabilir ve ayrıca herhangi bir dokuda mRNA lokalize etmek için de kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1.. FISH Analizi Genel Sinek, Bitki ve Virüs Hazırlıklar

  1. Arka B ve Q biyotipindeki pamuk fidelerinin (Gossypium hirsutum L. cv. Acala) üzerinde sinekler ve 25 ± 2 ° C,% 60 bağıl nem standart koşullar altında böcek geçirmez kafesleri ve büyüme odaların içinde korumak, ve 14 saat ışık / 10 saat karanlık fotoperiyot.
  2. Daha önce tarif edildiği gibi 15-19 endosymbiont-özgü primerler kullanılarak endosimbiyont ile enfeksiyonu test etmek için PCR yapın.
  3. Ticari bir kreş veya bitki domates tohumları Domates fideleri (Solanum esculentum cv. Beefsteak) satın alın.
  4. Bitkiler TYLCV 15 beyazsineği-aracılı aşılama için en uygun yaş (bölüm 4.1 'e bakınız), dört gerçek yaprak aşamasına gelinceye kadar, yukarıda açıklanan aynı yetiştirme koşullarında koruyun.

2. Endo için böcek Taşıma, Fixation, Probe Tasarım, Hibritleşme ve Görselleştirmesymbiont BALIK

  1. Pamuk bitkilerinden aspirasyonu ile 10 yetişkin sinekleri toplayın, ya da pamuk yaprakları 10 3 üncü veya 4. evre perileri almak.
  2. Hemen Eppendorf tüpleri içine Carnoy fiksatif (kloroform-etanol buzlu asetik asit, 06:03:01, hac / hac) içinde bırakın. (Tercihen bir gece) gece 2 saat için düzelt.
  3. Tamamen fiksatif çıkarın ve 2 saat boyunca, etanol içinde% 6 H 2 O 2'de renginin.
  4. Oda sıcaklığında birkaç gün ila birkaç hafta boyunca mutlak etanol içinde örnekleri korumak, veya bir sonraki adıma geçin.
  5. Design probları, her bir bakterinin, 16S ribozomal RNA genlerinin göre tamamlayıcı DNA, ters primerler. Sondalar tasarımı için, hesaba PCR primerleri tasarımı için aynı düşünceler almak. Oligonükleotid probları kullanarak BTP1 5'-Cy5-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3 ', 5'-Cy3 Rb1-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3', 5'-Cy3 BTH-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3 've 5'-Cy3 Ars2-TCATGACCACAACCTCCAAA-3 'sırasıyla Portiera, Rickettsia, Hamilonella ve Arsenophonus, spesifik hedefleme için.
  6. , Ml başına hibridizasyon tamponu içinde karanlıkta gece boyunca melezleşme numuneleri (20 mM Tris-HCI, pH 8.0, 0.9 M NaCl,% 0.01 [ağr / hac], sodyum dodesil sülfat,% 30 [hacim / hacim] formamid) 10 pmol içeren floresan probe . Gerektiğinde farklı floresan boyalar ile birden fazla probun birleştirin. Hedeflenen bakteri ve hiçbir prob örneklerinin negatif kontroller ile enfekte olmayan whiteflies kullanın.
  7. Bir sıvı engelleyicisi ile yer hibridizasyon tamponu içinde, bir mikroskop lamı üzerine, bütün numunelerin bir kapak monte kayma ile kapak, bir floresan veya konfokal mikroskop altında oje ve görünümü ile sağlanır.

3. Beyazsineği Organ Diseksiyon, Fixation, Hibritleşme ve TYLCV FISH için Görselleştirme

  1. Sürekli aspirasyon ve ane tarafından TYLCV enfekte domates bitkileri yetiştirilen yetişkin sinekleri toplayınaseton ile emprenye kağıt havlu maruz bırakılarak sthetize. Aseton çok uzun pozlama whiteflies dokuları çözebilirsiniz gibi sadece 1-2 dakika whiteflies Açığa. Ibridazyonunu onaylamak için enfekte olmayan domates bitkileri ve denetimler için hiçbir prob örnekler üzerinde yetiştirilen nonviruliferous whiteflies kullanın.
  2. Depresyon mikroskop Mount whiteflies stereo mikroskop kullanarak organı diseksiyon için kayar.
  3. Prothorax gelen böcek başını çekmeye ve 1x PBS içinde tükürük bezlerini incelemek nedeniyle küçük boyutu, daha iyi görüntülenmesi için% 1 toluidin mavisi boyası ile desteklenmiş. 2-3 dakika boyunca, lekenin emme izin verir.
  4. Göğüs ve gözlemlemek ve midgut dışarı çıkarmak için karın arasındaki noktada ayrı böcek çekin. Karın ucunda forseps ile iterek karın içeriğini kovun.
  5. Yavaşça başarılı kesitlerden PBS ve toluidin mavisi çıkarın ve yavaşça 5 dakika boyunca organlarını düzeltmek için Carnoy fiksatifi 300 ul ekleyin.
  6. Akesilen organlarda kontrolsüz hareketini önlemek üzere depresif kuyunun bir taraftan olup üstten fiksatif dd. Bir kez fiksatif dokunmadan, organları cama yapışacak ve süreç boyunca onlar hareket etmez.
  7. Fiksatif çıkarın ve TYLCV kat protein geninde bir diziye tamamlayıcı olan floresan DNA probu Cy5-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 ', 10 pmol ile takviye edilmiş hibritleme tampon 500 ul ekleyin.
  8. Altındaki ıslak havlu kağıt ile birlikte küçük bir plastik kutu içinde oluşan küçük bir nemli odası içinde örnek ile inkübe edilmesi slayt ile karanlıkta, oda sıcaklığında gece boyunca hibridize olur.
  9. Hibridizasyon sonra, ince bir diseksiyon aleti ile organları almak ve hızla DAPI (1 x PBS içinde 0.1 mg / ml) ile takviye edilmiş ve sıvı engelleyicisi ile içerdiği yeni hibridizasyon tamponu 30 ul ihtiva eden taze bir mikroskop lamı taşıyın.
  10. Bir kapak kayma örnekleri örtün, zekâ mühürBir floresan veya konfokal mikroskop altında h oje ve görünümü.

4. Bitki Taşıma, TYLCV FISH için El-kesit, Fiksasyon ve Hibritleşme

  1. Virüliferöz beyaz sinek aracılı aşılama kullanılarak TYLCV olan domates fideleri inoküle. Virüs symptomless bitkilerde bu FISH yöntemi aşılamadan bir hafta sonra kullanılarak tespit edilebilir. Tipik hastalık belirtileri görülebilir üç hafta sonrası aşılama vardır. Belirli bir hibridizasyon teyit etmek için kontrol enfekte olmamış domates bitkileri ve prob örnekleri kullanın.
  2. Domates el kesme 2-4 cm uzun boyuna veya enine kesitler hazırlamak için keskin bir histolojik jilet kullanın sapları ve yaprakları.
  3. Eppendorf tüpleri içinde, 2 saat için oda sıcaklığında gece boyunca Carnoy sabitleyici olarak bölümleri düzeltin.
  4. Fiksatif çıkarın ve oda sıcaklığında birkaç gün ila birkaç hafta boyunca mutlak etanol içinde muhafaza bölümleri, ya da bir sonraki adıma geçin.
  5. Bölümleri yıkayınHibridizasyon tamponu ile üç kez, her biri 1 dakika.
  6. TYLCV kılıf proteini genine bir diziye tamamlayıcı olan oligonükleotid prob, floresan Cy3-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 '10 pmol ile takviye edilmiş hibritleme tampon 500 ul bölümleri hibridize.
  7. Melezleme tamponu, bölümleri üç kez, her biri 1 dakika yıkayın.
  8. DAPI (1x PBS içinde 0.1 mg / ml) ile takviye edilmiş ve sıvı engelleyicisi ile yer hibridizasyon tamponu içinde bütün montaj bölümleri, bir floresan veya konfokal mikroskop altında oje ve görünümü ile mühür, bir lamel ile kapsamaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu yazıda incelenen sistem Şekil 1 'de gösterilen ve TYLCV ile enfekte olmuş bir bitki, bir yetişkin beyaz sinek ve B'nin bir peri içerir tabaci ve böcek TYLCV translokasyon için yol gösteren beyaz sinek iç anatomisi. 2. birincil simbiyonudur Portiera ve ikincil simbiyonudur için bir yetişkin beyaz sineğe çift BALIK göstermektedir Arsenophonus. Şekil 3. Portiera ve Hamiltonella için çift BALIK gösterir ve Şekil 4 Portiera ve Rickettsia'lara, B. Her iki figür çift FISH gösterir tabaci 4. evre perisi. 5. Bir sineği disseke midgut TYLCV ve DAPI boyama için FISH gösterir ve Şekil 6 disseke sineği birincil tükürük bezlerinde TYLCV ve DAPI boyama için bir BALIK göstermektedir. 7. TYLCV ve DAPI boyama için FISH göstermektedirel-cut TYLCV enfekte bitki bölümleri.

Şekil 1
Şekil 1. Bu yazıda incelenen sistemin genel bakış Domates sarı yaprak kıvırcık virüsün (TYLCV). B) ile enfeksiyonun neden. A) Tipik hastalık belirtileri bir yetişkin beyaz sineğe 4. nimf aşamasında. C) Dış görünümü dış görünümü beyaz sinek gelişim yaşam döngüsünde. Diğer nimf aşamalar genel dış görünüşü benzer ancak daha küçük boyutta bulunmaktadır. D) Bir yetişkin B'nin iç anatomisinin şematik görünümü tabaci bitki elek elemanları, dolaşım ve iletim (siyah oklar) TYLCV edinme yolunu gösteren. Kırmızı parçacıklar TYLCV viryonlara bakın. p: floem; s: s tylet; E: özofagus; fc: filtre haznesi; dm: azalan ortabağırsak; Cinsiyetim:,: çekumlar; hg: ca midgut artan hindgut; bc: bacteriocytes; PSG:. birincil tükürük bezi büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Şekil 2,
Şekil 2. B. Portiera ve Arsenphonus Çift BALIK tabaci Q biyotip yetişkin (A) ve işaretlenmiş bölgede (B) parlak alan bir kanal altında. Portiera spesifik prob (kırmızı) ve Cy5 Arsenphonus spesifik sonda (konjüge her sonda tarafından yayılan flüoresans sinyallerini tespit birleşik optik bölümleri, iki yakınlaştırmak Cy3 konjüge edilmiş) sarı kullanılmıştır. e: Yumurta.pg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Şekil 3,
Şekil 3. B. Portiera ve Hamiltonella Çift BALIK Cy5 ve Cy3 konjüge Hamiltonella spesifik sonda (yeşil) konjuge tabaci nimf. Portiera spesifik prob (kırmızı) kullanılmıştır. A) Hamiltonella hibridizasyon sinyali kombine optik kesit elde edilmiş ve. oda karanlık alan altında izlendi) 'dan elde Portiera hibridizasyon sinyali optik bölümleri birleştirilmiş ve karanlık alan altında izlendi. C) Portiera ve Hamiltonella parlak alanının altındaki sinyalleri birleşti. D) Portiera ve Hamiltonella Kombine sinyaller dekar altında inceledirk alan. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 4,
Şekil 4. B. Portiera ve Rickettsia'nin Çift BALIK Cy5 ve Rickettsia spesifik sonda Cy3 konjüge edilmiş (mavi) konjuge tabaci nimf. Portiera spesifik prob (kırmızı) kullanılmıştır. A) bir araya getirilmiş optik kesit elde edilmiş ve koyu alan altında izlendi Rickettsia hibridizasyon sinyali. B'den elde edilmiş) Portiera hibridizasyon sinyali Aydınlık alan altında optik bölümleri birleştirildi ve karanlık alan altında izlendi. C) Portiera ve Rickettsia kombine sinyaller. D) Rickettsia Kombine sinyaller. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 5,
Bir yetişkin B. disseke ortabağırsak üzerine TYLCV Şekil 5. BALIK Cy3 konjüge edilmiş bir enfekte olmuş domates bitki. TYLCV-özgü prob (kırmızı) ile 48 saat boyunca bu virüsü elde ettiği tabaci kadın kullanıldı ve midgut birleşik görüldüğü gibi kesilmiş midgut montaj ve görselleştirme. A) önce DAPI ile boyanmıştır Aydınlık alan altında optik bölümleri. B) TYLCV BALIK sinyali (kırmızı) ve DAPI lekeli çekirdekleri koyu alanın altındaki kombine optik bölümlerde görüldüğü gibi (mavi). fc: filtre haznesi; dm: descendi ng ortabağırsak; duyuyorum: artan ortabağırsak; ca: çekumlar; hg: hindgut. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 6,
Bir yetişkin B. disseke birincil tükürük bezi üzerine TYLCV Şekil 6.. BALIK Cy3 konjüge edilmiş bir enfekte olmuş domates bitki. TYLCV-özgü prob (kırmızı) ile 48 saat boyunca bu virüsü elde ettiği tabaci dişi kullanıldı ve montaj ve görselleştirme. A) kesilir ve DAPI lekeli birincil salya önce DAPI ile boyanmış tükürük bezi Aydınlık alan altında birleştirildi bölümlerde. B) TYLCV BALIK sinyali (kırmızı) ve karanlık alanda altında birleştirildi bölümlerde görüldüğü gibi DAPI lekeli çekirdekleri (mavi) görüldüğü bezi gibi.s :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51030/51030fig6highres.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Şekil 7
Şekil 7. TYLCV-enfekte bitkinin kök yoluyla el kesme uzunlamasına bölümünde TYLCV BALIK. TYLCV-spesifik prob Cy3'e konjuge (kırmızı) kırmızı ile gösterilen bir bölümü montaj ve görselleştirme. A) daha önce kullanılan ve DAPI boyama ile kombine edildi TYLCV floem elek elemanı sinyal, ve karanlık alan altında birleştirildi bölümlerde. B) yönelimi için parlak bir alan altında (A) gösterilen aynı kombine bölümlerde görüldüğü DAPI lekeli çekirdekler. ph: floem; xy:. ksilem büyük im görmek için buraya tıklayınyaş.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Aynı zamanda bitki ve böcek ev sahibi vektör bir bitki virüsünün lokalizasyonu ve onların özel sineği konukçuda endosimbiyotik bakteriler için burada açıklanan protokol, bitki ve hatta hayvan dokularında diğer virüslerin lokalizasyonu için uyarlanabilir. Ayrıca, protokol endosimbiyotik ve patojenik bakteri ve bitki ve hayvan sistemlerinin diğer mikroorganizmaları lokalize etmek için de kullanılabilir. Tarif edilen yöntemler, kısa, flüoresan-işaretli oligonükleotid DNA prob ve hücredeki hedef DNA ya da RNA molekülü arasındaki hibridizasyonun basit kavramına dayanmaktadır. Sonuç en az bir arka plan ile, belirli bir melezleştirme, ve floresan veya konfokal mikroskop kullanılarak tespit bir sinyaldir. Birden fazla geni hedef farklı floresan boyalar ile çeşitli problar, aynı anda kullanılabilir. Bu, tek bir hücre ya da doku içinde birden fazla hedef görselleştirme sağlar. Bu protokollerin açıklanan işlemleri basit ve örnek işleme zaman vardıraz. Bu tür yüksek bir zemin sinyali, numuneler için uzun işlem süresi ve analizi için çok sayıda ve yüksek maliyetli malzemelerin kullanılması gibi başka protokolleri ile ilgili problemler, burada anlatılan protokolde, kısıtlamaları değildir.

B. B ve Q biyotipleri koşulları kendi ana tesisi ile, herhangi bir sineği biyotipinin için geçerli yetiştirme, ancak; tabaci whiteflies bu yazının protokolleri tanımlamak için kullanılmıştır. Beyaz sinek, belirtilen koşullar altında, üç hafta içinde yaşam döngüsü tamamlanır. Kullanılan B biyotipindeki nüfusun her birey birincil endosymbiont Portiera ile enfekte edilmiş ve ikincil endosimbiyotik bakteri Hamiltonella ve Rickettsia. Q biyotipindeki bireyler Portiera ve Arsenophonus ile enfekte edildi. Dünyada Diğer sineği popülasyonları bu ya ile enfekte olduğu gösterilmiştir Diğer endosimbiyotik bakteri türleri ve farklı uzamsal localizati ilevücut 16-20 desenleri üzerinde.

TYLCV enfekte bitkiler tipik hastalık semptomlarının aşılamadan aşağıdaki üç hafta gösterir. TYLCV lokalizasyonu için semptomatik bitkiler, 24 saat için ak sinekler yolu ile virüs satın alınması için kullanılabilir ve virüs, yukarıda tarif edilen protokol kullanılarak FISH enfekte olmuş bitkilerde ve böceklerde tespit edilebilir. Böcek kullanılan sondalar bitkilerde Cy3 en uygun olan ve kloroplast, bitki hücresinde en bol organel olarak benzer dalga boyunda floresan değildir, Cy3 ve Cy5 dahil olmak üzere farklı dalga boyları ile kesilip birçok florofor ile konjuge edilebilir iken.

Bakteri ve bitki ve böcek virüsleri lokalizasyonu için tarif edilen protokollere başarılı bir şekilde uygulanması daha iyi bir görünüm ve prob penetrasyon, özgüllük için iyi bir prob için tasarım ve bütün böceklerin halinde 2 O 2 H ile temizlenmesi için örneklerin iyi tespit bağlıdır better sinyal görselleştirme. Bitkilerde FISH durumunda, el yapımı bölümler iyi nüfuz sondası ve sinyalin daha iyi görüntülenmesi için mümkün olduğu kadar az olmasının sağlanması gerekir. Bu kesim yardımcı olması için iki strafor parçaları arasındaki yaprak koyarak ve çeşitli satıcılardan bu amaç için satın alınabilir profesyonel jilet kullanarak geliştirilebilir.

Protokol ancak bu prob biçimi hücre-altı lokalizasyonu için uygun bir yöntem olarak, burada tarif kullanılarak geliştirilebilir potansiyeline sahip, hedef hücre içi lokalizasyonu için uygun değildir. Örneğin, burada tarif edilen kısa problar gibi biotin ve sırayla TEM ile görselleştirilebilir streptavidin konjüge edilmiş altın parçacıkları ile hedeflenebilir floresan olmayan moleküller gibi moleküller konjuge edilebilir. Bu daha sonra değişiklik gen transkript ve mikroorganizmalar dahil olmak üzere çeşitli hedeflerin hücre içi lokalizasyonu için uygun olabilir. Son olarak, tarif edilen protokols, DNA ve RNA değil, proteinler gibi nükleik asitlerle hibridizasyona için uygundur.

Burada anlatılan protokollerin FISH en iyi sonuçları elde etmek için, taze böcek ve bitki malzemesi, hem de taze sabitleyici ve melezleştirme tamponları kullanmak en iyisidir. Problar, her zaman tekrar dondurma ve buz çözme önlemek için küçük parçalar halinde -20 ° C'de saklanmalıdır. Her açıklanan adımın işlem süresi okudu organizmalar bağlı olarak kalibre edilebilir. Protokolde belirtildiği gibi, sabitleme ve renk açma sonra, beyaz sinek ve bitki numunesi, oda sıcaklığında mutlak etanol içinde uzun bir süre için muhafaza edilebilir. Başka bir yerden oluşu örnekleri gönderirken, veya uzun zaman süreci deneyler Bu adım özellikle yararlıdır. Hibridizasyon sinyalinin kalitesi, bu uzun bir süre muhafaza aşağıdaki etkilenmedi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Ghanim laboratuarda araştırma hiçbir araştırma bursu ile desteklenmiştir. Alman-İsrail Vakfı (GIF) dan 908-42.12/2006, hiçbir hibe. IS-4062-07 Amerika Birleşik Devletleri-İsrail Binational Tarımsal Araştırma ve Geliştirme Fonu (Bard), ve araştırma hibe hayır dan. MG İsrail Bilim Vakfı (ISF) için 884/07

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluorescently labeled  Probes Metabion 20 bp HPLC purified Sequence designed by customer
Toluidine blue Sigma-Aldrich 89640
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771 Molecular Biology Grade
Formamide Sigma-Aldrich F9037 Molecular Biology Grade
Tris-HCl Sigma-Aldrich T5941 Molecular Biology Grade
Glacial Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Molecular Biology Grade
Liquid Blocker Ted Pella Inc. 22309

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Czosnek, H., Laterrot, H. A worldwide survey of Tomato yellow leaf curl viruses. Arch. Virol. 142, 1391-1406 (1997).
  2. Ling, K. S., Simmons, A. M., Hassell, R. L., Keinath, A. P., Polston, J. E. First report of Tomato Yellow Leaf Curl Virus in South Carolina. Plant Dis. 90, 379 (2006).
  3. Polston, J. E., McGovern, R. J., Brown, L. G. Introduction of Tomato yellow leaf curl virus in Florida and implications for the spread of this and other geminiviruses of tomato. Plant Dis. 83, 984-988 (1999).
  4. Polston, J. E., Rosebrock, T. R., Sherwood, T., Creswell, T., Shoemaker, P. J. Appearance of Tomato yellow leaf curl virus in North Carolina. Plant Dis. 86, 73 (2002).
  5. Frohlich, D. R., Torres-Jerez, I., Bedford, I. D., Markham, P. G., Brown, J. K. A phylogeographical analysis of the Bemisia tabaci species complex based on mitochondrial DNA markers. Mol. Ecol. 8, 1683-1691 (2002).
  6. Ghanim, M., Morin, S., Czosnek, H. Rate of Tomato yellow leaf curl virus translocation in the circulative transmission pathway of its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Phytopathology. 91, 188-196 (2001).
  7. Ghanim, M., Rosell, R. C., Campbell, L. R., Czosnek, H., Brown, J. K., Ullman, D. E. Digestive salivary and reproductive organs of Bemisia tabaci (Gennadius) Hemiptera: Aleyrodidae) B type. J. Morphol. 248, 22-40 (2001).
  8. Hunter, W. B., Hiebert, E., Webb, S. E., Tsai, J. K., Polston, J. E. Location of geminiviruses in the whitefly Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae). Plant Dis. 82, 1147-1151 (1998).
  9. Rosell, R. C., Torres-Jerez, I., Brown, J. K. Temporal pathway of geminivirus in whitefly extracts, saliva, hemolymph and honeydew. Phytopathology. 89, 239-246 (1999).
  10. Czosnek, H., Ghanim, M., Ghanim, M. The circulative pathway of begomoviruses in the whitefly vector Bemisia tabaci—insights from studies with Tomato yellow leaf curl virus. Ann. Appl. Biol. 140, 215-231 (2002).
  11. Gottlieb, Y., et al. The transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virusby the whitefly Bemisiatabaciis correlated with the presence of aspecificsymbiotic bacterium species. J. Virol. 84, 9310-9317 (2010).
  12. Brumin, M., Levy, M., Ghanim, M. Transovarial transmission of Rickettsia spp. and organ-specific infection of the whitefly Bemisia tabaci. Appl. Environ. Microbiol. 78, 5565-5574 (2012).
  13. Ghanim, M., Medina, V. Localization of Tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector Bemisia tabaci. In Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease, Management, Molecular Biology, Breeding for Resistance. Czosnek, H. Springer. New York. 175-187 (2007).
  14. Ghanim, M., Brumin, M., Popovski, S. A simple, rapid and inexpensive method for localization of Tomato yellow leaf curl virus and Potato leafroll virus in plant and insect vectors. J. Virol. Methods. 159, 311-314 (2009).
  15. Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. J. Virol. 86, 13241-13252 (2012).
  16. Nirgianaki, A., et al. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47, 93-101 (2003).
  17. Baumann, P. Biology of bacteriocyte-associated endosymbionts of plant sap-sucking insects. Ann. Rev. Microbiol. 59, 155-189 (2005).
  18. Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (Homoptera) Aleyrodidae). App. Environ. Microbiol. 72, 3646-3652 (2006).
  19. Li, Z. X., Lin, H. Z., Guo, X. P. Prevalence of Wolbachia infection in Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 54, 467-471 (2007).
  20. Skaljac, M., Zanic, K., Hrncic, S., Radonjic, S., Perovic, T., Ghanim, M. Diversity and localization of bacterial symbionts in three whitefly species (Hemiptera: Aleyrodidae) from the east coast of the Adriatic. Bull. Entomol. Res. 103, 48-59 (2013).
Floresan<em&gt; In situ</emVirüsler ve Bitki ve Böcek Dokularda Endosimbiyotik Bakterilerin lokalizasyonu&gt; Hibritlemeler (FISH)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kliot, A., Kontsedalov, S., Lebedev, G., Brumin, M., Cathrin, P. B., Marubayashi, J. M., Skaljac, M., Belausov, E., Czosnek, H., Ghanim, M. Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues. J. Vis. Exp. (84), e51030, doi:10.3791/51030 (2014).More

Kliot, A., Kontsedalov, S., Lebedev, G., Brumin, M., Cathrin, P. B., Marubayashi, J. M., Skaljac, M., Belausov, E., Czosnek, H., Ghanim, M. Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues. J. Vis. Exp. (84), e51030, doi:10.3791/51030 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter