Summary
予防的および治療的ワクチン接種は、多くの場合、週のリンパ節へのワクチンの排水および免疫細胞の関与の結果として、乏しいによる強力な免疫応答を刺激することができない。リンパ節へのワクチンの直接注射することによって、いわゆるリンパ内注射は、ワクチンの有効性を強く改善することができ、ワクチン用量を低減することができる。
Abstract
ワクチンは、典型的には、免疫応答の刺激のために、皮下または筋肉内に注射する。これが成功するかどうかは、抗原提示細胞が欲しかった免疫応答を生成するためのリンパ球と対話することができ、リンパ節へのワクチンの効率的な排液を必要とします。強さと誘導される免疫応答のタイプは、密度や周波数の相互作用ならびに微小環境、サイトカインの、特に内容によって異なります。末梢注入されたワクチンの分画のみがリンパ節に到達すると、マウスおよびヒトのワクチン接種、 すなわちリンパ内注射、鼠径リンパ節へのワクチンの直接注射により実施した。男性では、手順は、超音波によって導かれる。マウスでは、小さな（5〜10 mm）の切開が、リンパ節の局在化及び鉗子で固定化されているが、麻酔した動物の鼠径部に形成されており、ワクチンの10〜50μlの容量を視覚的制御下に注入される。切開部を外科用縫合糸を使用して、シングルステッチで閉じられる。マウスを、プラスミドDNA、RNA、ペプチド、タンパク質、粒子、および細菌ならびにアジュバントでワクチン接種し、ワクチンのすべてのタイプに対する免疫応答の強力な改善が観察された。ワクチン接種のリンパ管内方法は、従来のワクチン接種が不十分な免疫または利用可能な場合、ワクチンの量が限られているが生成状況では特に適しています。
Introduction
ワクチンは、典型的には、免疫応答の刺激のために、皮下または筋肉内に注射する。この方法の成功は、抗原提示細胞は、T-およびB細胞応答の生成のためにリンパ球と相互作用することができるリンパ節へのワクチンの効率的な排水を必要とする。また、強度と誘導される免疫応答のタイプも密度や周波数などの相互作用ならびに微小環境自体、サイトカイン、特に内容によって異なります。末梢組織に注入されたワクチンのごく一部は、リンパ節に到達すると、リンパ節へのワクチンの直接注射によりマウスおよびヒトのワクチン接種は、免疫応答部位が生成された、行われている。ヒトにおいて、手順は、超音波、また、リンパ系における可視化および診断のための造影剤の投与のために使用した手順によって案内される。マウスでは、手順が侵襲的である。ここでは、小さな（5〜10 mm）のincisioN麻酔した動物1の鼠径部で行われ、リンパ節はローカライズやピンセットで固定化して、ワクチンの10〜20μLの容量は、視覚的な制御の下で注入されて、10μlを最初の注射のために使用され、若いマウスでは小リンパ節、20μlの大きなリンパ節を有するより古いか、すでにプライミングしたマウスのリンパ節に注入することができる一方。切開は、外科用縫合糸を使用して、シングルステッチで閉鎖することができる。この方法によって、マウスをプラスミドDNA 2,3、メッセンジャーRNA 4、1,3,5,6ペプチド、タンパク質7-10、11粒子 、細菌12ならびにアジュバント7,13、および免疫の強力な改善でワクチン接種されているワクチンは、すべての種類に対する応答が観察されている。ワクチン接種のリンパ管内方法は、従来のワクチン接種が不十分な免疫を生産するか、利用可能なワクチンの量が限られていたり、バージョンである状況では特に適しています高価なY。人間では、予防接種のリンパ管内の方法は、アレルギー患者14,15にまたは癌16〜21の患者に適用されている。現在の概念はリンパ管内の方法は、筋肉内および皮下注射などの他の注射方法より侵襲的であるということですが、痛みの知覚は、静脈穿刺15後よりも高いではありません。これは、リンパ内ワクチン接種は、予防および特に治療予防接種の他の方法に代わる、または補完になることが期待されている。この記事では、リンパ管内ワクチン接種の手順は、マウスで実行する方法を詳細に説明します。記載されているすべての手順は、チューリッヒ州立獣医庁によって承認され、スイス連邦のガイドラインおよび科学的目的のために使用される動物の保護に関する指令を実施した。
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Protocol
1。マウスの麻酔
- 緩衝生理食塩水でケタミン（解離性麻酔薬）およびキシラジン（鎮静および鎮痛）を混合することにより、麻酔薬を準備します。最終溶液中のケタミン及びキシラジンの濃度は、それぞれ、12.5および2 mg / mlのです。
- 25〜30gの針で注射器を用いて腹腔内投与によりマウスに麻酔薬を注入する。体重10gあたり0.1mLを使用してください。
- 角膜の乾燥を防ぐために、マウスの目に眼軟膏を適用します。
- マウスが十分にピンセットでその足やつま先をつまんで麻酔されていることを保証する。マウスがピンチに反射神経と反応しない場合は、手術に進みます。マウスは反射神経や筋肉の収縮とピンチに反応する場合は、1〜2分待ってからピンチテストを繰り返します。それでもマウスが反応した場合は、新しい動物とマウスを交換し、以降の手順1.2から手順を繰り返してください。
2。私は外科マウスの鼠径部のncision
- 仰向けにマウスを置きます。
- 消毒エタノール（70％）で1鼠径部を濡らす。より良好な消毒を提供するため、鼠径部をエタノールで消毒前のファーを除去するために剃られてもよい。
- 後ろ足を取り、股関節の約90°の角度を生成する股関節を曲げる。
- 湾曲したmicrodissecting鉗子を使用して、股関節を曲げた鼠径部でのマウス皮膚を取り、少し湿らせた肌を引き上げます。
- 鉗子で皮膚を保持しながら、外科はさみを使って皮膚を介して小切開（<5 mm）をカット。
- 切開部に閉じたハサミの先端を配置し、さらに、切開の中にそれを保持しながら、はさみを開くことによって、切開を開きます。これは、皮膚が破れの原因になり、10mm未満の直径を生成しなければならない。注：可撓性光ガイドを有する冷光源は、可視性を改善するために使用することができる。古い中マウス、特に男性、リンパ節の同定は、鼠径部における多くの脂肪組織に困難である。
3。リンパ内注射
- 28〜30 Gの皮下注射針と注射器（0.5ミリリットル以下）を調製、短い斜面は長くベベルすることが好ましい場合がある。ワクチンの吸引除去10μlを注入し、注射器は、空気を含まないことを保証する。
- 湾曲した鉗子と、閉じたハサミの先端の助けを借りて、鼠径リンパ節を局所化。リンパ節は、より白っぽい脂肪組織内で灰色表示され、さらに入力し、リンパ節を残して求心性と遠心性毛細血管を介して同定することができる。
- 湾曲鉗子の枝の間に保持することにより、リンパ節を固定する。
- シリンジを取り、上に向けベベルとリンパ節に針を挿入し、全体のかさがリンパ節に入ることを確認すること。
- ワクチン（10μl）を注入する。もしリンパNODeは（爆破）腫れている、注入が成功したと仮定することができます。針がリンパ節に深く十分に配置されていない場合、一部または全体のワクチンが漏れやリンパ節に入らないことがあります。針が深すぎる挿入されている場合は、注入されたワクチンは、皮下リンパ節の下にリリースされます。後者の例では、注入を繰り返したり、新しい未処理のマウスでマウスを交換します。
4。縫合することによって切開を閉じる
- 無菌手術用縫合糸のパックを開きます。
- 針本体の先端部に針ホルダとの縫合針をつかむ。第1ラチェットキャッチまでそれを絞ることによって針ホルダを締めます。
- （歯又は非歯付き鉗子または皮膚のフックを使用することができる、外科医の好みに応じて）鉗子を用いて切開部の片側に皮膚のホールドを取る。針CAを挿入2-3ミリ切開部の端から、皮膚の外部から侵入。
- ロース鉗子で皮膚のホールドENとピンセットで切開の反対側を把握する。針CAを挿入2-3ミリ切開部の端から、肌の内側から侵入。
- 針ホルダを緩め、ピンセットで針先を把握する。数匹のマウスを治療する場合は、短い方の端を残して（最初の針挿入点の外にトレッドの便利な長さを残して、皮膚を通してトレッド針を引いて、5月10日のマウスは1縫合針を操作でき/）トレッド。
- 標準外科医プロトコルによる好ましい結び目を作る。切開部が10mm以下である場合に一針で十分である。大きな切開のために、第二のステッチを作る。
5。ポストの運用トリートメント
- ケージにマウスを置き、暖かい保つために組織にカバーしています。複数のマウスを治療する場合、暖かく保つために互いに近接して配置します。彼らは目覚めまで、または、暖かいパッドの上にマウスを置くアップ。
- 彼らが目を覚ますまで、マウスを観察します。
- 癒しだけでなく、創傷感染症などの他の臨床症状を巻かに関しては毎日マウスを観察します。傷は通常、十分に2日以内に閉鎖し、手順の7日以内に癒されます。
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Representative Results
マウスではリンパ管内注射の手順は、外科的な性質にもかかわらず、まっすぐ進むと、比較的高速である。訓練を受けた人は3〜4分で手続きを行うことができます。一針で閉じられ切開は、典型的には2日以内に治癒する（ 図1）
リンパ内ワクチン接種またはimmunizationがmRNAと行ったプラスミドDNA、ペプチドタンパク質ウイルスおよび細菌2タンパク質ホスホリパーゼA2（PLA2）、メジャー蜂毒アレルゲンによる免疫後、抗体の製造を説明Figure。 CBAマウスに、0.01、0.1、又は皮下（sc）またはリンパ内（ILN）注射により水酸化アルミニウムに吸着した10μgのPLA2で0日、14日、および28日に免疫した。 PLA2-特異的抗体（IgG2aの）は、8週間後に血液で測定し、その結果を時uの10μgのPLA2が必要としながら、0.01μgのPLA2は、強力な抗体応答を刺激するのに十分であったことを明らかにした皮下経路9を歌う。
リンパ内ワクチン接種はまた、CD8 T細胞の刺激のためのH-2DBの文脈においてMHC-クラスIに結合するLCMV糖タンパク質から、 例えば 、ペプチドGP33（KAVYNFATM）、細胞傷害性T細胞応答を刺激するために使用されている。 GP33とTCR318マウスの単回皮下注射は細胞傷害性CD8 T細胞応答を引き起こしたが、効果は約だった。リンパ内注射後に強力な6桁（ 図3A）、TCR318マウスは1 GP33に特異的なCD8 T細胞受容体のためのトランスジェニックである。
CD4 T細胞機能はまた、腫瘍チャレンジアッセイで試験した。再度C57BL / 6マウスを、CD4 T細胞の刺激のためのMHC-クラスIIに結合し、ペプチドのCpG ODN 1826と混合したVSV核タンパク質からのペプチドnp52（SDLRGYVYQGLKSG）でリンパ内又は皮下に免疫した。マウスに静脈内にチャレンジしたときは同系EL4腫瘍細胞をnp52発現マウスは、全身性リンパ腫（ 図3B）を開発した。リンパ内の経路によって免疫化したマウスは、皮下経路（<22日間）で免疫したマウスよりもはるかに長い生存時間（> 75日）を示した。
リンパ内免疫化の方法はまた、特に、花粉症などのアレルギーの治療のために、ヒトで行われた。この方法は、現在ILIT（イントラリンパ免疫療法）として知られている。花粉症で165人の患者に関するある研究では、イネ科花粉アレルゲンと2ヶ月以上3 ILITセッションは3年間15以上の54回の皮下注射で、従来の治療法と同等に効率的であった。また、投与量は、1,000以上の倍減少させることができた。同様に、猫の毛アレルギーの患者20人に関する研究では、リンパ内投与猫の毛皮のアレルゲンとの3セッションでは、後でアレルゲン曝露14に改善された耐性を引き起こすのに十分であった。
jove_contentは">皮下免疫化と比較して、リンパ管内免疫の改善された有効性の一つの説明は、放射性の99m Tcで標識されたタンパク質を使用した。人に例示することができるし、 図4に示すように、皮下注射は勿論ながら、リンパ節への不十分な排出が観察されたリンパ管内直接噴射送達リンパ系への全体のワクチン含有量は、従って、免疫細胞が利用できるようにし、免疫応答刺激22。同様の結果は、放射性タンパク質9を注射したマウスで得られた。
図1リンパ内注射後の手術創傷の治癒。雌BALB / cマウスリンパ内注射により免疫化した。 incisイオンは、単一の縫合糸のステッチで閉じた。 2日後、手術および注射部位は、創傷治癒の管理のために写真撮影した。
図2の刺激抗体応答のためのタンパク質とリンパ内免疫化。雌CBAマウスに水酸化アルミニウムに吸着されたホスホリパーゼA2タンパク質の示された用量で0日、14日、および28日に免疫した。 0日目と28と14日目に右リンパ節に、左リンパ節：ワクチンは、首や鼠径リンパ節中の10μLの首筋にある50μLの注入により皮下（SC）を投与した。
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刺激細胞傷害性CD8 T細胞応答に対するペプチドと図3リンパ内免疫化（A）女性TCR318マウス後足蹠に鼠径リンパ節（ILN）又は皮下（sc）投与にGP33ペプチドを注射した。 24時間後、流入領域リンパ節を採取し、30:1のeffector/target-（E / T）細胞比でgp33特異的CTL活性について分析した。 （B） メスのC57BL / 6マウスに、0日目、2目に免疫した4回の皮下（sc）またはリンパ管内（ILN）投与経路によってμgのnp52 10で。次いで、マウスをVSVnp52を表す同系リンパ腫細胞（EL-4）でチャレンジして、マウスの生存率はカプランマイヤー曲線で示されました。
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図4：ヒトにおけるリンパ内ワクチン投与。ヒトにおけるリンパ内ワクチン投与は、超音波を用いて皮下リンパ節を割り当てることによって行われる。皮下針は、リンパ節の副皮質に挿入され、注入は、超音波画像内の膨潤即時リンパ節を観察することによって制御することができる。 （A）リンパ内注射は、超音波によって案内される。 （B）リンパ節の副皮質内に挿入された針（直白っぽい線）を示す超音波画像。 （C）鼠径リンパ節（「Injekt IM LK ";右前）に放射性標識されたタンパク質の注射後の体内分布および皮下（「Injektのsubkutan";左前）。ヒトで拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
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Discussion
リンパ管内免疫化および免疫療法は、抗体応答およびT細胞応答の両方を刺激するため適切であることが示されている。このビデオの記事で示されているように、ワクチン接種のリンパ管内の手順は、マウスにおいて強力な免疫応答を刺激するための迅速かつ簡単な方法です。訓練された外科医は、3〜4分の間に手続きを行うことができます。セッションも1は、一般的に麻酔や縫合をしていると第二外科医は切開や注射をしている2の外科医の間で共有することができます。手続きの効率は、外科医は、まだ十分に訓練を受けていない場合は特に、他の予防接種法よりも演算子に依存しています。しかし、経験豊かなオペレータが、免疫応答解析により定量的にモニターし、実験結果を再現することができる。方法の変形は、脾臓1,2にワクチンを注入することである。準備はリンパ管内注入のそれと似ていますが、目切開の電子サイズが典型的に大きく、2針は、それを閉じるために行われる。針挿入または注入によるリンパ節の損傷が伴うだろうが、このような脾臓内免疫化の主な利点は、脾臓は、より大きな注射体積およびより頻繁な注射を適用することができる見つけ、リンパ節よりもヒットすることが容易であることであり、そしてリンパ節の大面積、脾臓の損傷は、臓器の比較的少ないが関与し、地域の自然のよりだろう。
マウスにおけるリンパ管内免疫化の手順が実行され、同じリンパ節における第二の注入前の3〜4週間の回復時間の後に（ 例えば、ワクチンは注射を昇圧）繰り返すことができる。より頻繁な注射が計画されている場合、左右の鼠径リンパ節を使用すべきである。リンパ節毎に少なくとも2回の注射を行うことができるが、さらなる研究は、より正確には、この潜在的な制限を定義するために必要とされる。さらに注射が困難なDかもしれリンパ節及び皮膚の両方の瘢痕形成、並びにアジュバントにより生じる潜在的な肉芽腫形成にUE。一方、予防接種は、一過性のリンパ節の炎症の原因となり、増加リンパ節の大きさは、その後のローカライゼーションと注射を簡素化します。実際に、リンパ節の局在化は、この方法の主要な制限である。若齢マウス（5週未満）が非常に小さなリンパ節、古く、特に高齢雄マウスはあまり皮下脂肪を有していてもよいを有してもよいが、その局在化が困難である。最適な条件は、6〜12週間のメスのマウスで得られる。実際に、手順の最も重要なステップの一つは、リンパ節自体への注射である。ノードの隣接した領域への注入は、直接リンパ管内注入後よりも免疫応答のずっと弱いトリガと皮下注射と同等になります。その理由は、ノードを囲んでなく、固体のカプセルは大きな分子に対して透過性ではないということです。抗原がリンパ節に入るためには、リンパ液を排出するために持っています。この旅では、通常、リンパ次排水に向けて蠕動運動によって駆動され、そこから、皮膚中の初期のリンパ管に始まり皮下組織内に血管を収集するリンパドレイン皮膚のより深い層に大きなダクトに続くリンパ液は、23,24ノード 。さらに下流抗原が、この経路に沿って堆積され、そのあまりの求心性リンパへのアクセスを取得します。
リンパ管内免疫化の方法は、筋肉内または皮下経路などの従来の方法により投与するとき、弱く免疫原性である抗原の投与のために特に興味深い。リンパ内ワクチン接種は、mRNA、プラスミドDNA、ペプチド、タンパク質、ウイルスおよび細菌22,25-27で行われた。ペプチドおよびタンパク質なしでのビルドのアジュバントを持っていないが、mRNAのプラスミドDNAウイルスや細菌は、真性補助EFFEを発揮危険信号（ウイルスおよび細菌の複製）を提供することによって、又はそのような一本鎖RNA（TLR7およびTLR8）、二本鎖RNA（TLR3）のような病原体関連分子パターン（PAMP）を検知することができるToll様受容体（TLR）を刺激することによってカラット、非メチル化シトシンとグアニンオリゴヌクレオチドクラスター（TLR9）、細菌flaggelin（TLR5）、リポ多糖（TLR2、4）だけでなく、他のウイルスや細菌の分子28。したがって、特に、ペプチドとタンパク質をワクチンがリンパ節に直接ワクチンを注入する免疫増強作用の恩恵を受けるだろう。実際、B-及びT-細胞応答をマウスにおいてリンパ管内1,8,9ペプチドおよびタンパク質のワクチン接種後に増加することが実証されている。また、遺伝子ワクチン、特にmRNAのベースのワクチンは、彼らは確実に、細胞外の組織で短い通過時間を有効投与方法から利益を得るであろう理由のために非常に不安定である。抗原アンと確かに、リンパ内接種コードRNAは、マウス腫瘍モデル4における強力な予防および治療 免疫を誘発した。同様に、例えば、CpGなどのアジュバントのリンパ内投与は、必要な低用量に対する毒性の低減を可能にし、増加したアジュバント効果は、免疫細胞13への直接的および希釈されていない効果が観察された。また、このようなポリマーナノおよびマイクロ粒子ならびにリポソームのような他のアジュバントまたは抗原送達系の性能は、リンパ内投与11によって向上させることができた。従来のワクチン接種の経路上のリンパ管内の別の主な利点は、はるかに低い用量は、通常、必要なことである。タンパク質および細胞傷害性CD8 T細胞応答の刺激のためのDNAの投与量は、約で還元することができ、一方、抗体応答を刺激するために、投与量は、100〜1,000倍の9によって低減することができる。 10,000倍2。
サブユニット抗原または死ワクチンとは対照的に、生のvirAlおよび細菌ワクチンは通常、リンパ管内行政の恩恵を受けると予想されていません。この理由は、微生物は、典型的には、任意のアジュバントの助けを借りずにリンパ節によく排水生きる部分にある。さらに、感染性微生物は、複製によって、末梢組織における抗原希釈効果に対応することができる。従って、二次リンパ系に到達する抗原用量は、典型的には免疫を生成するのに十分であろう。既存の生ワクチンが不足して免疫を生産している場合、しかし、リンパ内投与は、ワクチンを有効にするために必要な補正を行うことができます。最近、現在、利用可能な結核ワクチンMとワクチン接種後、その免疫が実証されたウシ型結核菌 BCGは大幅にマウス12の鼠径リンパ節へのBCGの直接注射することによって向上させることができた。リンパ内投与はまた、皮下adminisに比べて100〜1,000倍BCGの接種された量の低減を可能にしたtration。これは、特に免疫低下の人に、リンパ管内ワクチン接種の安全性の利点を表している。
ヒトにおけるリンパ管内免疫化および免疫療法は、これまでのところ、癌患者およびアレルギー患者に適用されている。ヒトにおける方法は非侵襲的であるが、最良の結果および品質管理は、病院又はより大きな治療室への適用を制限し得る、注入を導くために、超音波を用いて得られる。癌研究において、転移性黒色腫の治療のためのプラスミドDNAとペプチドとのプライム-ブーストワクチン接種は、免疫原性および定義された29患者集団における疾患の制御の証拠を明らかにした。また、樹状細胞とリンパ管内自家ワクチン接種は、癌患者において行われた。いくつかの試験は、免疫応答30,31を強化しながら、他の試験では、リンパ管内行政32,33の利点を示すことができなかった。リンパ内投与の手順はESPEあることが証明されているcially有益にアレルギー患者の免疫療法。リンパ管内方法に変更することで、完全な成功免疫療法のための注射の回数は、2ヶ月14,15の上にわずか3回の注射を3年間で約50回の皮下注射から減少させることができた。両方の噴射番号ので用量は強くアレルゲン特異的リンパ管内免疫療法を行うことによって低減することができ、リンパ節ヒスタミン放出肥満細胞を含んでいないので、本方法は、安全上の利点を示し、短い治療期間で、患者のコンプライアンスが改善される。次の年の間に、アレルギーは、おそらくワクチン接種および免疫療法のこの新しい方法の最も直接的な利益を見ることが目安です。
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Disclosures
特定目的会社は、ヒトにおけるリンパ管内免疫療法を扱う特許の発明者として名前が付けられています。特定目的会社は、科学顧問されており、PJは開示する競合の関心を持っていないImVisioN社、CYTOSバイオテクノロジー、MannKind株式会社、およびXBiotech USA社から旅費を受け取った。
Acknowledgments
著者は、アイリスエルトマン、バーバラ·フォン·ボイスト、ジュリア·マリア·マルティネス·ゴメスからマウスではリンパ管内免疫化の方法を開発する上での実験の助けに感謝しています。私たちは、このビデオ制作のために彼らの手術室を使用させるためにもマギーアラスとニコラCesarovicに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (Ketasol-100) | Graeub AG, Switzerland | Anesthetics | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer, Germany | Anesthetics | |
| Viscotears Eye-Gel | Novartis, Switzerland | To keep eyes from drying out during anesthesia. | |
| BD Micro-Fine 0.5 ml | BD Medical, France | 29 G Insulin syringes with permanently attached needles | |
| 6-0 Dermalon Monofilament Nylon | Covidien, MA, USA | For sutures (0.7 metric, 18 G, 45 cm, Blue) | |
| Curved forceps, 4.5 in | Polymed, Switzerland | For incision and holding of lymph node | |
| Straight surgical scissors, 4.5 in | Polymed, Switzerland | For incision | |
| Needle holder, 5.5 in | Polymed, Switzerland | To close incision with suture |
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