Summary
절개 바셀린 갭 접근 방식은 빠른 채널 반응 속도의 높은 해상도와 Xenopus의 난자에서 발현 전압 - 의존성 이온 채널에서 이온 및 게이팅 전류의 낮은 잡음 녹음을 얻는 데 사용됩니다. 사소한 변형에, 전압 클램프 형광 측정은 절개 난자 프로토콜에 연결될 수있다.
Abstract
절개 난자 바셀린 갭 (COVG) 전압 클램프 기술은 난자의 이종 이온 채널의 전기 생리학과 운동 특성을 분석 할 수 있습니다. 절개 설정에서 녹음 낮은 크기의 게이트 전류, 빠른 이온 전류의 활성화 및 비활성화를 해결하는 데 특히 유용합니다. 두 전극 전압 클램프 (TEVC) 기법을 통해 주요 장점은 증가 된 클램프 속도, 개선 된 신호대 잡음비, 및 세포 내 및 세포 외 환경을 조절하는 능력을 포함한다.
여기서는 절개 설정 및 프로토콜뿐만 아니라 전압 클램프 형광 측정 기능을 추가하는 데 필요한 변형을 설명하기 위해, (HNA V 1.5), 아프리카 손톱 개구리의 난모 세포에서 발현 인간 심장 나트륨 채널을 이용한다.
이러한 HNA V 1.5 빨리 활성화 이온 채널의 특성은 완전히 whic에서 TEVC를 사용하여 상온 근처에 해결 될 수없는난자의 세포막의 시간 전체가 전압 제어가 어려워 고정된다. 그러나 절개 기술에서 세포막의 단지 작은 부분의 절연은 패치 클램프 기술과 연관된 채널 황폐 방지하면서 정확하게 빠른 반응 속도를 기록 할 필요 급속한 클램핑을 허용한다.
COVG 기술, 이온 채널 속도론 및 전기 생리 특성과 함께 추가로 단백질 움직임이 세포 외로 적용 형광체, 유전자에 의해 코딩 형광 단백질의 삽입 또는 부자연 아미노산의 혼입 시스테인 공액 통해 추적되는 전압 클램프 형광 측정을 사용하여 정량 할 수있다 관심 1의 영역으로. 이러한 추가적인 데이터는 형광 분자를 둘러싸는 미세 변화를 통한 단백질의 전압 의존성 구조적 재 배열 대해 운동 정보를 산출한다.
Introduction
특수 전압 클램핑 기술은 제어 된 막 전위에서 이온 전류의 기록을 허용한다. 널리 두 전극 전압 클램프 (TEVC)를 사용하고 패치 클램프 기술은 많은 이온 채널의 특성에 대한 신뢰성있는 전기 생리 정보를 제공한다. 그러나, 이러한 방법은 모두 빠른 전압 문 나트륨 채널과 같은 Xenopus의 난자의 세포막에있는 것과 같은 다른 빠른 활성화 채널에 대한 신뢰할 수있는 데이터의 취득을 방지 단점이 있습니다. Bezanilla과 스테파니 연구소는 따라서 난자 2의 절개 바셀린 갭 전압 클램프 기술 (COVG)를 개발했다. 기법은, 나 +, K +, 및 칼슘 2 + 채널 3-8을 기록 널리 적용되어왔다.
COVG 기록하는 동안, 이종 단백질 발현 난자의 막을 세 지역으로 나누어 져 있습니다. 이온 전류 데이터로서 난자의 상부 영역으로부터 기록된다정상 영역을 둘러싸 욕을 용이하고 신속하게 변경 될 수있는 명령 전위에 클램프된다. 중간 영역의 상부 영역 (9)과 동일한 전위에 클램프 됨으로써 누설 전류에 대하여 가드. 난자 개구 (절개) 사포닌 용액 또는 정맥의 사용을 통해 발생하는 위치를 하단 영역입니다. 화학적 또는 저부 영역에서 멤브레인의 수동 개방은 접지에 클램프 내부 전위의 제어를 허용하고, 하부 챔버 용액과 인접 셀 내부를 렌더링한다. 상부 챔버의 솔루션 교환이 외부 환경을 변경하는 반면 하부 챔버에 솔루션을 살포는 내부 환경의 특성을 조정할 수 있습니다. 
그림 1. 난자 절개 전압 클램프 욕실 설치 다이어그램. (A) 최고서로 분리 된 세 개의 화장실의 아래로보기. COVG의 챔버의 치수는 그림에 표시됩니다. (B) 테스트 위치에 화장실 설치의 측면보기. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
COVG 기법의 이점은 낮은 전류 노이즈 (3 kHz에서 1 NA), 외부 미디어의 이온 조성, 내부 용지, 빠른 시간 해상도 (의 붕괴 20-100 마이크로 초 시간 상수를 조절하는 능력의 제어를 포함 용량이 과도), 몇 시간 9 안정 녹음. 단점은 특수 장비를 필요로하며 두 전극 전압 클램프 (TEVC) (10)에 비해 수행하기 더 어려운 것이있다.
COVG 접근 방식은 고도의 전문 장비와 복잡한 절차 적 요소가 필요하지만, 그것은 VALU의 인수를 허용 할 수 있습니다수 전기 생리학 데이터. 같은 빠른 반응 속도와 꼬리 전류 4 전류를 게이팅 등이 데이터는, 채널 런 다운 등 다른 전압 클램핑 프로토콜과 관련된 몇 가지 문제없이 녹음 할 수 있습니다. COVG 설정에 약간의 수정은 온도 조절기와 전압 클램프 형광 측정 (VCF)의 사용을 허용 할 수있다. COVG 조립체 내의 전압 클램프 형광 측정 요소의 포함은 동시에 현재 11-13을 촬영하면서 단백질 형태 적 변화를 모니터링하는 기능을 부여하여 데이터 출력을 증강 할 수있다.
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Protocol
1. 초기 장비 설치
- 전기 및 기계 소음을 방지하기 위해 주변 패러데이 케이지 진동 격리 시스템 (예를 들면, 공기 테이블)에 무대와 미세 조작기를 놓습니다.
- 24 AWG 와이어의 6 인치 길이에 여섯 자세 / AgCl을 알약을 납땜. 이들 중 하나의 길이 (P1에 접속되는) 제 2 와이어의 접합부는 "Y"를 형성한다. 각 와이어의 끝에 앰프에 포함 된 금 BNC 핀을 납땜.
- 욕실 / 가드 headstage (P1, P2, CC, GS1 및 GS2)에 24 AWG 와이어에 납땜 다섯 자세 / AgCl을 알약을 연결합니다. 연결 "I" "I"headstage 및 V2의 headstage에 P1 떨어져 재림 와이어 자세 / AgCl을 펠렛.
- 장비 설명서의 지시에 따라 데이터 수집 장치에 앰프를 연결합니다.
- 배치하고 온도 컨트롤러 서미스터를 에폭시. 금속 scaffol에 구멍을 통해 블록 서미스터 쓰레드직접 가열 / 냉각 요소의 중심 위에서 좋아. 놓고 아주 가까이 있지만 솔루션을 접촉하지 온도 전도 하단 챔버의 몸에 드릴 구멍에 목욕 서미스터를 에폭시.
2. 난자와 예비 준비
- 이러한 HNA V 1.5로 발현 된 채널을 녹화하려면, (hSCN5a에서 파생)의 mRNA를 합성하고 주위 4-5일 프로토콜 4를 수행하기 전에 Xenopus의 난자에 주입. hSCN5a를 들어, 피크 표현은 19 ℃에서 4 ~ 5 일 배양 한 후 얻어진 자세한 난자에 대한 지침, mRNA의 준비 및 난자 주입 리차드와 Dempski (14)와 코헨 등. 15을 참조하십시오.
- 프로토콜 4 시작하기 전에의 AgCl 와이어와의 AgCl 펠릿을 염화. 이를 위해서는, 적어도 20 분 동안 표백제로 한 와이어의 일단 펠릿을 배치 한 O / N. 등 펠릿은 chlorid되고 나면에드, 접착제를 사용하여 매니 폴드에 부착합니다.
주 : 와이어를 통해 전류를 구동하는 것은 또한 와이어 및 펠릿 클로라이드 사용될 수있다. 이 기술은 염화, 백 염화의 속도를 증가뿐 아니라 더 많은 장비를 필요로 할 것이다. 추가 명령 16 일 실버 와이어 Chloriding에 대한 기술을 참조하십시오.
3. 한천 다리 준비
- 중간 불에 붕 규산염 모세관 튜브의 한쪽 끝을 가열하여 적어도 6 한천 교량을 확인합니다. 모세관 튜브의 끝이 푸른 불꽃의 상단 부분에 있는지 확인하십시오. 원본에 손상이 발생 하였을 경우에는, 여분의 다리를합니다.
- 모세관이 가열되면, 튜브에서 90 ° 각도의 굴곡을 만들기 위해 집게를 사용합니다. 부드러운 곡률보다는 급격한 모서리 굽힘 조준 또는 훨씬 더 어렵게 만든다 충진 및 브리지의 저항을 증가 유리의 내부 직경을 감소시킬 수있다.
- 제 90도 굴곡을동일한 방향으로 제 벤드 모세관 아래 25mm는 동일한 단계를 사용.
참고 : 다리의 정확한 길이는 긴 다리의 크기가 일치로 문제가되지 않지만, 궁극적으로 길이는 그들이에 사용되는 장비에 적합해야한다. 브리지 저항은 길이에 비례하고 최소화 할 것을 염두에 두십시오. - 모세관 튜브를 냉각 한 후, 대략 5 mm로 다리의 "다리"트림 다이아몬드 팁 유리 절단기를 사용합니다.
- 한천 (17)에서의 저항을 줄임으로써 성능을 향상시키기 위해 세 "통전"교량의 모세관 튜브에 백금 와이어의 길이를 삽입한다. 관 외부에 노출하여 유선이 없도록 초과 백금 와이어를 잘라.
참고 : 인해 백금의 높은 비용, 검색 및 깨진 다리에서 전선을 다시 사용할 수 있습니다. - 이러한 마이크로 피펫 t으로 구현 더 뾰족한와 모세관 튜브에 백금 와이어를 밀어IP 와이어는 캐 필러 리 튜브의 양단에 유리보다 짧은 1mm가되도록.
- HEPES 1.2 g의 버퍼 1 M NMDG 100 mL로한다. pH 측정기를 사용하여 7.4의 pH를 (~ 10 g)을 달성 할 때까지 MES 하이드레이트 파우더를 추가합니다. 7.4의 pH가 도달되면, pH 전극을 제거한다. 스토리지 솔루션으로 유지하기 위해 옆 용액 40 ㎖를 설정합니다.
- 2-3 % 년 한천의 혼합물을 생산하기 위해 과립 한천을 추가합니다. 한천 솔루션까지 저어 가열 용해하고 분명하다. 과열 또는 지나치게 점성과 다리가 어려울 것입니다 작성 될 것 같은 솔루션을 끓여하지 마십시오.
- 새로운 비커에 한천 솔루션을 이동하고 작은 교반 막대를 추가합니다. 가열하고 적당한 속도로 교반을 계속합니다.
- 모세관 다리에게 위로 향하게하여 다리를 한 번에 하나씩 추가합니다. 시간이 지남에 따라 다리는 한천로 채울 것입니다. 대안 적으로, 작은 피펫 팁에 부착 된 주사기를 통해 한천 용액을 누름으로써 다리 채우기.
- 기포는 BRI에 없다하면차기 총재, 한천 용액으로부터 다리를 검색하고 건조 종이 타월에 다리를 놓습니다. 잔류 거품이있는 모든 다리는 거품 종료를 용이하게하기 위해 집게로 교반 할 수 있습니다.
참고 : 거품 정착 한천이 완전히 끓는 물에 다리를 담근 제거 할 수 있습니다. 한천을 제거한 후에 잔류 물을 제거하는 진공 라인을 사용한다. 교량은 한천 처리를 위해 재사용 될 수있다. - 마른 다리에서 초과 한천을 제거합니다. 40 ㎖ 예비 용액에 60 ㎖의 물을 추가하고 스토리지 솔루션에 다리를 놓습니다.
4. 절개 조작 준비
- 온도 컨트롤러의 물 소스와 온도 컨트롤러로 다음 전원 스위치를 켭니다. 목욕 온도가 특정 온도 (19 ° C에서)에 도달 할 때까지 기다립니다.
- 0.2 ~ 0.5 MΩ의 저항에 미세 전극 풀러와 붕규산 모세관 튜브에서 미세 전극을 당깁니다.
참고 : 낮추면 핍ETTE 저항은 체결 속도를 향상시킵니다. 그러나, 낮은 저항 피펫은 난자를 손상 가능성이 더 높습니다. 실험은 각각의 응용에 대한 최선의 피펫 저항 값을 결정하기 위해 요구된다. - 내부 용액 50 ㎖로 건조 사포닌 0.125 g을 혼합하여 사포닌 솔루션을 준비합니다. 이것은 0.25 % 용액으로 이어질 것입니다. 혼합 부드럽게 반전.
- 해부 현미경 하에서 매우 뾰족한 물체와 중간 챔버와 상부 챔버의 하부 측의 상부 측에 구멍의 가장자리 주위 바셀린의 소량을 적용한다.
참고 : 바셀린의 "도넛"구멍을 통해 장소에 난자를 유지하는 데 도움이되며, 씰의 형성에 도움이됩니다. 그러나, 너무 많은 바셀린 트랩 거품되고 난자의 표면에 도달하는 솔루션을 방지합니다. - 이 슬롯에서 오버 플로우가 없지만 펠릿 및 교량 다리 끝 코브 수 있도록 자세 / AgCl을 알약을 들고 매니 폴드 슬롯에 3 M의 KCl 솔루션을 추가빨강. 슬롯 사이의 원치 않는 전기 연결을 방지하기 위해 별도의 KCl 방울을 정리.
- 낮은 중간 목욕 챔버 외부 솔루션을 추가합니다.
- 다리 당 하나의 다리가 각 슬롯에 있도록 AgCl을 펠릿 매니 폴드의 슬롯에 한천 다리를 놓습니다. 교량의 다른 다리는 나중에 각각의 챔버에 배치됩니다 (P1, P2, CC 탑, GS1, GS2 중간 (가드), I 아래). 백금 철사 다리가 GS2, P2에, 그리고 슬롯이 있는지 확인합니다.
주 : 확인 교량은 챔버 욕조에 삽입하기 전에 증류수로 완전히 건조 세척. - 데이터 수집 시스템과 PC를 켭니다. 레코딩 소프트웨어를 시작합니다.
5. 절개 절차
- 난자없이 상단과 중간 난자 챔버를 설치합니다. 두 챔버의 구멍이 겹치지 않도록 중심을 벗어난 상단 챔버를 밀어 넣습니다. 외부 솔루션을 모두 실을 입력하고 각각의 챔버에있는 모든 전극을 배치.
참고 : 챔버를 설치할 때 모든 방법을 위에서 아래로 실을 넣지 마십시오. 아주 작은 차이가 두 챔버 사이에 남아 있는지 확인합니다. 중심에서 벗어난 배열 나은 셀의 존재를 시뮬레이션하도록 챔버 시스템의 저항을 증가시킨다. "브리지 균형"이라고하는이 프로세스는, 한천 교량 간의 불균일성으로 인해 발생할 수있는 오프셋 전위 보상한다.- 외부 명령 및 두 클램프를 끄십시오. 앰프의 현재 기록을 확인합니다. 제로 전류에 목욕 / 가드 머리 단계의 뒷면에 작은 오프셋 드라이버 P로 조정합니다.
- 활성에 앰프의 목욕 / 가드 스위치를 전환하고 제로 전류를 얻기 위해 오프셋 GS를 조정합니다.
- 둘 다 (<100 NA) 제로에 합리적으로 가까운 때까지 "활성화"와 "수동"사이에 반복합니다.
- 상단 챔버를 제거하고 피펫 펌프를 사용하여 중간 목욕 챔버에 난자를 전송합니다. 확인 oocy 확인TE는 욕실의 중심에있는 구멍을 통해 배치된다.
참고 : VCF에 대한 난자를 준비 할 때, 위쪽으로 향하게 동물 극 (어두운면)에 실에 표시된 셀을 배치합니다. VCF가 수행되지 않는 경우 셀 방향은 중요하지 않습니다. - 난자와 목욕 표면 사이의 씰을 만들 흡입기를 사용하여 아래 화장실에서 여분의 외부 솔루션을 제거합니다.
- 챔버 내의 구멍이 난 모세포의 상단 중앙에 있도록 난자 위에 베스트 욕 챔버를 배치. 구멍을 통해 상부 조에 멤브레인의 작은 부분만을 노출하는 정도로는 난자에 대해 단단히 가압 될 때까지 천천히 챔버에 압력을 적용하고, 엄지 손가락과 가운데 손가락을 사용.
참고 : 난자 베스트 챔버의 압력 아래에 부풀어있다. 이 난자가 파열 원인이됩니다, 상단 챔버에 무리한 힘을 가하지 마십시오. 상부 챔버의 대각선 모서리에 배치 핀셋 팁의 APPL 손가락의 대안으로 사용할 수 있습니다Y 하향 압력. - 그들은 거의 풀 때까지 상단과 하단 화장실 외부에 솔루션을 추가합니다.
- 그림 2 (다리의 위치)에서 볼 수 있듯이 각 화장실의 외부 용액에 한천 교량의 자유의 다리를 놓습니다. 각각의 다리는 올바른 화장실 위치에 놓여 있는지 확인합니다. (I 바닥 목욕, 중간 목욕 GS1 및 GS2 교량, 및 P1, P2, 상부 목욕 CC 다리에 다리). 활성에 앰프의 목욕 / 가드 스위치를 전환합니다.
주 : 확인 교량, 그들의 웰, 기록 챔버 사이에 3 M KCl을 연결은 없다. 또한, 그들은 기록 챔버 솔루션 위에 제기 될 수 있도록해야합니다 다리가 옛날되어 있는지 확인하십시오.
그림 2. 한천 교량의 자유 단의 한천 교량 설치 위치도. 배치 위치다양한 화장실에. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 . - 기록 소프트웨어에서 테스트 프로토콜을 시작합니다. 펄스 (수동에서 목욕 / 가드 0.3 MΩ에 해당)보다 큰 100 nA의 다음 욕조 덮개의 견고를 증가하는 100 MV 펄스를인가에 두 피크 사이의 수평 단면의 수직 변위를 표시합니다. 이상적인 테스트 펄스의 예를 들어 그림 3을 참조하십시오.
참고 : 테스트 프로토콜은 목욕 커버가 충분히 단단히하고 모든 구성 요소가 제대로 조립되어 있는지 확인하기 위해 전압 펄스를 방출한다. 대안 적으로, 증폭기의 테스트 기능을 사용할 수있다.
그림 3. 기록 소프트웨어에서 이상적인 테스트 펄스. 테스트 펄스적용되는 프로토콜에 따라 상기 펄스 유사합니다. 홀딩 전류 (센터 기준)는 0에 가까워 야합니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 . - 아래 욕조에 외부 솔루션을 제거하고 사포닌 용액으로 교체합니다. 사포닌을 추가하는 동안 거품을 만들지 않도록주의하십시오. 최대 교체를 보장 솔루션을 추가하는 동안 바닥 목욕의 반대쪽에 흡입을 적용합니다.
- 사포닌 용액을 첨가 한 후, 반복 테스트 펄스를 관찰한다. 시험 프로토콜의 피크가 감소하거나 사라질 경우이 난자 아래에 거품이 있다는 신호입니다. 이 경우, 완전 사포닌 용액을 제거하고 교체.
참고 : Permeabilization는 일반적으로 신선한 사포닌 용액을 30 초 이내에 완료됩니다. 포획 된 기포가 있는지 해법 어려움 세포에 도달 할 수있을또는 모낭 층이 제대로 소화 난자에 남아있는 경우. 전압 스파이크의 기울기가 (부패의 시간 상수의 증가) 감소 할 때 난자 (연) permeabilized되었습니다.
그림 4. 테스트 펄스는 난자 Permeabilization 동안 추적합니다. 테스트 펄스 프로토콜에서 선정 된 흔적을 0.25 % 사포닌 용액이 바닥 난 모세포 실에 도입 된 후. 흔적에서 볼 붕괴의 시간 상수의 증가는 난자 permeabilization의 증가를 보여줍니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 . - 셀 permeabilized되면 사포닌 용액을 제거하고, 내부 용액으로 목욕을 채운다. 시험 프로토콜을 중지합니다.
참고 : 사포닌에 대한 액세스를 허용하더라도막 permeabilizing에 의해 세포의 내부는, 낮은 목욕 및 확산에 의해 난자의 세포질의 이온 농도의 평형는 매우 느린 과정이다. 이 과정은 (그림 5) 조건에 따라 수십 분을 필요로 할 수있다. - 화장실에있는 솔루션의 높은 수준을 확인하고이 짧은 회로와 엉뚱한 행동을 일으킬 수있는 매니 폴드의 우물 사이의 KCl을 결정화.
- 미세 전극에 3 M의 KCl을 주입하기 위해 수정 된 주사기를 사용합니다. 다른 손가락으로 보강하면서 한 손가락으로 미세 전극을 여러 번 쓸어 넘기십시오.
주 :이 단계는 미세 전극 내의 갇힌 공기 방울을 제거하기 위해 필요하다. - 오픈 미세 전극의 끝 부분에 와이어 필라멘트를 삽입하여 미세 조작기의 팔에의 KCl 채워진 전극을 장착합니다. 필라멘트 홀더에 미세 전극의 끝을 밀어 넣고 전극이 흔들리지 않도록해야합니다. 전극 패스너를 조입니다.
참고 : 엄마와이어가 정상적으로 작동하는 전극조차 AgCl로 코팅되어 있는지 확인 애. - 난자 화장실에 위치로 팔을 스윙과 더 팔의 움직임을 방지하기 위해 클램프를 조입니다.
- 매니퓰레이터 노브를 사용하여, 조 내에 전극을 걸어. 더 테스트 펄스가 적용되지 멤브레인 테스트 기능이이 시점에서 활성화되지 않도록되어 있는지 확인합니다.
참고 : 전극 팁은 액체로 삽입되기 전에, V1-V2는 전압 클램프에 양의 전압을 판독한다. 전극 팁은 액체 내로 삽입되면, 전압 클램프 전압 측정기는 0에 가까운 값으로 변경한다. VCF 녹음의 경우, 전극은 목적을위한 공간을 확보하기 위해 매우 얕은 각도로 세포에 접근 할 필요가있다. 오프 센터 전극 셀을 Impaling, 절연 막 패치의 가장자리에 가까운 또한 전극과 대물의 충돌을 방지하는 것을 돕는다. - 전극을 걷고 중지합니다. 오프셋 (offset) 전극을 설정V1 버튼을 누른 후 V1을 조정하여 제로 V1 전압을 감소시킴으로써 제로 전위 오프셋. 또한, V2에 대해 동일한 조정을 수행합니다. 전위차 V1-V2는 000 MV를 읽어야합니다.
- 다시 V1로 전환하고 전극 저항을 측정하기에 Z-테스트를 켭니다. 값은 점차적으로 떨어져 실제 저항에 접근하게됩니다. 0.2 ~ 0.5 MΩ의 저항 값을 목표로하고 있습니다.
- 상단 화장실에서 난자의 가시 패치 향해 전극을 걷고 계속합니다. 미세 전극이 난자 매우 가까이되면, 전극은 난자 들어갈 때 V1-V2 판독 보시는 본다 미세 전극이 셀에 들어갈 때 V1-V2 전압은 음이 될 것이다.
주 :이 시점에서 나타낸 값은 세포의 막전위이고 표현 채널 및 사용 된 용액에 의해 영향을받을 것이다. 너무 멀리 미세 전극을 삽입하면 세포막을 손상시킬 수 있습니다. - 소재 데이터 수집 프로토콜을 열고기록 소프트웨어.
- 전압 클램프의 클램프 스위치 뒤집고 "I"headstage에있는 손잡이를 조정하여 명령 (예를 들면 -100 MV)와 일치 할 가능성을 조정한다.
- 정전 용량과 저항 보정 스위치를 플립.
- "테스트"전압 클램프의 "명령"지역에 스위치를 플립. 신호를 시각화하기 위해 오실로스코프를 사용합니다. 오실로스코프의 용량 과도 전류를 줄이기 위해 신호 컨디셔닝 세그먼트 센티미터 보상 노브를 조정합니다. 추가 역 피크가 발생하거나 피크가 기록에 유물을 소개 할 수있는 S 자형 곡선을 개발하기 위해 시작 지점으로 피크를 보상 오버하지 마십시오.
- 용량은 수동으로 만족 수준으로 감소되면, 시험 스위치를 끄십시오.
- 기록 소프트웨어에 데이터 기록을 개시 프로토콜.
6. 대청소
- 녹음은 꿀벌이있을 때N 완료, 클램프, 욕실 / 가드 스위치를 포함하는 전압 클램프의 모든 각종 스위치를 끄십시오.
- 다양한 화장실에서 한천 교량을 제거하는 집게를 사용하십시오.
- 상단 목욕을 제거하고 모든 화장실에서 모든 솔루션과 난자를 대기음.
- 모든 화장실을 헹구어 낸 후 진공 화장실을 대기음 탈 물 한 병을 사용합니다. 이 단계 3 배를 반복합니다.
- 교량 떨어져 결정화의 KCl을 닦고 스토리지 솔루션에 다리를 놓습니다. 브리지는 그들이이 제대로 저장 될 때 많은 주 동안 다시 사용할 수 있습니다.
- 수회 매니 웰로부터의 KCl 용액을 대기음 탈 이온수로 매니 폴드를 헹군다.
- 온도 제어 및 기록 소프트웨어를 포함한 모든 다양한 장비의 전원을 끄십시오.
7. 전압 클램프 형광 측정의 추가
- 이전에 게시 된 조브 프로토콜 16 E 6을 통해 제 1의 단계에 따라사이트 감독 형광 라벨과 함께 현장에서 막 단백질의 구조적 역학을 xamining하면 : 페이지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 배 초점 설정 VCF 현미경을 사용하여 상기 COVG 프로토콜의 5.22를 통해 제 4의 단계를 수행합니다.
참고 : VCF 녹음이 COVG 측정에 요구되는 것보다 더 큰 난자 목욕 챔버를 필요로합니다. (사용자 지정 VCF 챔버의 크기는 재료의 목록에 있습니다.)이 큰 VCF 실이 동시에 대물 렌즈, 미세 전극, 한천 교량을 수용 할 수 있어야합니다. 또한, 동물 극 (난자의 어두운면)이 낮은 배경 VCF 녹음을위한 챔버를 향하도록해야합니다. - 물에 침수 40X 목표를 사용하여 초점 난자의 상단 부분을 가져옵니다.
참고 : 40X 목적으로 배에서 전환하면 특정 GE가 필요합니다절개 구성 요소와 세심한주의의 ometry 40X 목적을 내릴 때 전극, 교량, 또는 챔버에 충돌하지 않도록. 또한, 때문에 최고 가드의 증가 볼륨, 40X 목적이 곳에서 설정하면 상단 가드에서 해당 목욕 볼륨이 중간 가드와 연결되지 않도록. - 난자의 맨 위에 약간 초점의 평면 위에 있도록 노출 된 난자 표면의 주위에 반지에 초점을 맞 춥니 다.
참고 : 시야가 주로 막하지 챔버 가득되도록 xy 평면의 조정이 필요할 수 있습니다. XY 번역 가장 쉽게 번역 무대에서 현미경의 배치에 의해 달성된다. - 광 경로로 필터 큐브를 이동하고 검출기 (다이오드)에 접안 렌즈에서 빛의 경로를 전환합니다.
- VCF 광원을 켜십시오.
- 머리 위의 조명, 광섬유 광 조명, 빛의 다른 소스를 끕니다.
참고 : 이상적으로, VCF녹음은 완전히 어두운 방에서 수행되어야한다. - 레코딩 소프트웨어에 형광 프로토콜을 실행합니다.
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Representative Results
도 4는 디스플레이 사포닌 용액으로서 난자의 투과성의 변화는 난자의 바닥 부에인가된다. 5 사포닌 permeabilization 다음 확산에 의해 세포 내 용액의 교환 율을 보여 도표. 20 ~ 40 분은 정상 상태 2,18에 와서해야합니다.
기록 프로토콜에서 생성 된 그림 6A 쇼 흔적. 그림은 전압 프로토콜 (삽입)에 대한 응답 (P/-8 누출 공제 후) 이온 전류를 보여줍니다. 그림의 각 트레이스는 다른인가 전압을 나타냅니다. 느린 반응 속도와 흔적은 나트륨 채널을 열 수있는 가장 낮은 전위를 나타낸다. 일반적으로, 기존의 방법을 사용하여, 그것을 안쪽 전류 막 탈분극 때문에 이러한 낮은 전위에 대한 전압 제어를 유지하는 것이 곤란하다. 차례로이 탈분극은 긍정적 인 피드백 루프를 만들어 더 많은 채널을 활성화 . 절개 기술의 향상 클램프 속도에서도 이러한 어려운 전위 채널을 녹화에 필요한 전압 제어를 가능하게한다.
도 6b는도 6a의 트레이스에서 생성 된 전류 / 전압 곡선을 보여준다. 전압 제어하지 않고 초기 전위에서의 피크 전류 (~ -60 MV)가 과대 평가 될 것이다, 위에서 언급 한. 이 전류 - 전압 관계의 정확한 설명을 방지한다.
도 7은 난 모세포에 대한 전압 클램프 형광 측정 결과의 예를 나타낸다. 형광 신호는 인간의 심장 나트륨 채널 나 V 1.5의 DII 도메인에 위치 (805)에 삽입 시스테인에서 MTS-TAMRA으로 표시 난자에서 기록되었다.
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그림 5. 내부 솔루션 평형의 세포질 나 + 확산에 의해 농도 변화. 속도의 반응 속도는 세포의 모두 외부 및 내부 측면에 90 밀리미터 나 +를 적용하고 IV 관계마다 2 분을 기록하여 나 + 반전 가능성을 측정하여 평가 하였다. 내부 환경이 완벽하게 대체 된 경우, E 레브 0 MV 것입니다. 사포닌은 난자의 막을 permeabilized 때 시간 측정이 시작되었다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 6. 야생형 나상욱 V 1.5절개 전압 클램핑에서 나트륨 채널의 결과.의 (A) 추적 100 밀리 초에 대한 -120 MV, +40 MV에서의 테스트 펄스 (-120 MV 아래로 -80 값의 유지 가능성과 다른 자극의 전압에서 전류 기록 200 밀리, 그리고 마지막으로 -120 MV에 repolarizing 10 MV 단위). (B) 다음 패널 A의 피크 전류의 전압 의존성, 측정 값이 표시됩니다 +60 최대 펄스의 피크 전류를 나타내는 IV 커브. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 7. 난자에서 기록 나상욱 v 1.5 나트륨 채널 전압 클램프 형광 측정 녹음. (A) 이온 전류인간의 심장 나트륨 채널 나 V 1.5의 DII-S4 도메인의 위치 (805)에 삽입 시스테인에서 MTS-TAMRA으로 표시. -170 MV에서 +70 MV에 이르기까지 전압 펄스는 -120 MV에 전 진동을 다음과 같은 20 밀리의 기간 동안 20 MV 단위로 적용되었다. (B) 관련 형광 신호. 다른 모든 형광 추적은 명확성을 위해 생략된다. ΔF / F는 전압 펄스에 의해 유도 된 형광 강도의 상대적 변화를 나타냅니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
절개 난자 바셀린 갭 전압 클램프 기술은 데이터의 신속한 해결이 가능, 낮은 노이즈, 상대적으로 긴 프로토콜 19을 통해 내부 솔루션 및 외부 용액 조성물을 제어하고, 안정된 레코딩을 증가했다. 이러한 장점 떨어져 표준 두 전극 전압 클램프 및 패치 클램프 기술에서이 기술을 설정합니다. 전문 장비가 필요하고 프로토콜이 상대적으로 어려운 있지만 시스템이 최적화되면, 아주 몇 가지 문제가 발생합니다. 이것은 나트륨 (HNA V 1.5) 및 기타 빠르게 활성화 채널의 재현 녹음 할 수 있습니다.
프로토콜에서 가장 중요한 단계는 V1 전극과 난자와 말뚝으로 찌르는 형벌에 최고 실의 배치입니다. 셀과 실 구멍의 가장자리 사이의 밀착되어 레코딩 품질에 큰 영향을 미치고 있습니다. 상부 챔버는 가장 높은 재를 달성하기 위해 셀을 푸시 다운 할 수 있어야합니다난자를 손상시키지 않고 sistance. 이것은 난자 부푼 만들기 요구하고 평평하지만, 셀 품질의 경험과 대가는 파열을 방지하는 최적의 압력을 결정하기 위하여 필요한 것이다. 패스트 기록 일관 세포를 손상시키지 않고 이용 될 수있는 가장 큰 가능한 피펫 개구부의 사용을 필요로한다. 특별한주의는 피펫 팁이 삽입으로 크게 상처를 확장하지 않을 정도로 얕은해야 피펫의 테이퍼에 지불해야한다. 꿰 즉시 막 잠재적 인 독서의 모양에 따라 전극의 발전을 중지, 천천히 그리고 조심스럽게 수행해야합니다.
난자의 세포막에 손상과 완벽한 난자 / 실 물개보다 높은 누설 전류가 발생할 수 있습니다. 높은 누설 전류는 항상 레코딩의 품질을 저하. 따라서, 녹음은 항상 낮은 누설 전류 (바람직하게는 <150 ~ 200 nA의)가 있어야합니다. 앰프의 보상 회로, P / N 온라인 누설 공동 사용rrection, 또는 오프 - 라인 절차는 누설 전류를 보상 할 수있다.
문제 해결은 일반적으로 대부분의 문제를 해결 할 모든 구성 요소가 올바르게 연결 또는 조정을 두 번 검사에 의해 시작해야한다. 준비와 실험 자체 동안 특별한주의는 유출 또는 넘쳐 유체 수준으로 지급하고이 전기적으로 절연되는 것을 의미하는 구획을 연결할 수의 KCl을 결정화해야합니다. 시스템이 예기치 않게 동작하는 경우, 다리와 챔버 사이의 누락 또는 원치 않는 연결을 확인합니다. 에어 한천 교량의 단부에, 한천 교량 내에 기포 또는 셀 아래에 갇혀도 감지하기 어려운 연결 문제를 일으킬 수있다.
수정은, 전술 한 바와 같이, COVG 함께 전압 클램프 형광 측정 (VCF)를 수행하도록 요구된다. 주요 변경은 변경된 목욕 디자인을 사용하는 것입니다. 물 침지 40X 대물 렌즈의 사용을 수용하기 위해현미경, 상부 챔버 욕은 표준 절개 셋업 될 필요보다 커야한다. 다른 측면과 COVG 모드에서 VCF 녹화 장비의 요구는 두 개의 전극 전압 클램프 모드 14 VCF 기록과 유사하다. 앞서 강조한 바와 같이, COVG 기술의 주요 장점은 포유 동물 세포 발현 시스템에서 달성 될 수있는 것보다 훨씬 더 많은 이온 채널을 표현 멤브레인 패치 TEVC에 비해 훨씬 빠르고 정확한 전압 제어이다. 따라서,이 기술은 VCF 높은 시간 해상도와 높은 채널 번호가 모두 검출 신호에 필요한 현재의 연구를 게이팅에 이상적입니다.
원칙적으로 여분의 세포 내 두 솔루션 교환을 할 수 있지만, 환율의 완성도와 속도는 실험의 특정 유형에 대한 몇 가지 제한 사항을 설정합니다. 도 5 및 세포질 하부 참 이온 농도 사이의 평형의 비율에 나타낸 바와 같이BER은 매우 느린 사포닌 permeabilization을 따르고있다. 이온 농도를 변경하는 것은, 따라서 정상 상태에 도달하기 전에 셀 긴 실험에서 고려되어야한다. 환율은 조건에 따라 큰 범위로 변화 할 수있다. 높은 채널 표현, 큰 추진력, 그리고 빠른 속도의 높은 온도의 결과. 우리의 실험에서 세포는 19 ° C로 냉각시키고, 채널 표현은 적당하게, 그리고 IV 프로토콜에 의해 구동되는 순 비용으로 인해 변화하는 현재의 방향을 최소화했다. 이러한 설정에서 일반 COVG 기술은 다양한 패치 - 클램프 구성 열등하다. 세포질 매체의 빠른 교체를 요구하는 COVG 응용 프로그램의 관류의 정맥을 사용할 수있다. 미래에, 내장 된 관류 포트 설계 COVG 챔버 세포 솔루션의 교환 특성을보다 효과적으로 제어 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
모든 세인트 루이스 심장 분자 공학 연구실에있는 워싱턴 대학의 구성원. 버로우즈는 과학 인터페이스에서 기금 경력 상을 오신 것을 환영합니다 - 1010299을 (JS에).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| External Solution | Brand | Catalog Number | [Final], weight, or volume |
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 25mM |
| MES Sodium Salt | Sigma-Aldrich | M5057 | 90mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 20mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | variable (pH to 7.4) |
| Internal Solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 105mM |
| MES Sodium Salt | Sigma-Aldrich | M5057 | 10mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 20mM |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | 2mM |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | variable (pH to 7.4) |
| Depolarizing Solution | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | 221473 | 110mM |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | 1.5mM |
| Calcium Chloride | Caisson | C021 | 0.8mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 10mM |
| Pipet Solution | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | 221473 | 3M |
| Saponin Solution | |||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | 0.125g |
| Internal Solution | See above | 50mL | |
| Agar Bridge Solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 100ml of 1M |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 1.2g |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | variable (pH to 7.4) |
| Granulated Agar | Research Products International | A20250 | 3% |
| NMDG Storage Solution | |||
| NMDG, HEPES, MES Hydrate solution | see above | 40ml | |
| Water | 60ml | ||
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| High Performance Oocyte Clamp | Dagan | CA-1B | |
| Data Acquisition System | Axon CNS | Digidata 1440A | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 210 | |
| Rack Power Filter | APC | G5 | |
| Heating/Cooling Bath Temperature Controller | Dagan | HCC-100A | |
| PC | Dell | Optiplex 990 | |
| pCLAMP 10.3 Voltage Clamp Software | Molecular Devices, LLC | pCLAMP10.3 | |
| TMC Vibration Control TableTop Platform | TMC | 64 SERIES | |
| TMC Vibration Control Air Table | TMC | 20 Series | |
| V1/I Electrode Data Collector | Dagan | part of CA-1B | |
| MX10L Micromanipulator | Siskiyou | MX10L | |
| Bath/Guard (I/V) Headstage (with appropriate connectors) | Dagan | part of CA-1B | |
| Microscope | Omano | OM2300S-JW11 | |
| Temperature Control Bath | Custom or Dagan | Custom or HE-204C | Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). Dagan also provides a prefeabricated stage (HE-204C). |
| Custom AgCl Pellet Container | Custom | Custom | Custom machined |
| Ag/AgCl electrode, pellet, 2.0 mm | Warner | E-206 | |
| External Oocyte Bath | Custom or Dagan | Custom or CC-1-T-LB | Custom machined or purchased from Dagan |
| Internal Oocyte Bath | Custom or Dagan | Custom or CC-TG-ND | Custom machined or purchased from Dagan |
| Capillaries for Agar Bridges and Pulled Electrodes | Warner | G150T-4 | |
| Rotatable Mounts for the Microscope, Micromanipulator, and Bath | Siskiyou | SD-1280P | |
| Fiber-Lite | Dolan-Jenner | LMI-600 | |
| Regular Bleach | Clorox | 470174-764 | |
| Xenopus laevis Oocytes | Nasco | LM535M (sexually mature females) | |
| 90 Na+ External Solution | See Solutions sheet | ||
| 10 Na+ Internal Solution | See Solutions sheet | ||
| 3 M KCL | See Solutions sheet | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| NMDG Storage Solution | See Solutions sheet | ||
| 5mL transfer pipets | SciMart | GS-52 | |
| Modified KCl electrode injector | BD | 309659 | Plastic syringe tip melted to allow for injection of solution into electrodes. Alternatively, a Microfil by WPI can be purchased. |
| Microvaccum | Custom | Custom | |
| Forceps | VWR | 63040-458 | |
| Oocyte Handling Tools (Pipette Pump) | VWR | 53502-222 | |
| Deionized Water Squirt Bottle | VWR | 16649-911 | |
| Vaseline Petroleum Jelly | Fisher Scientific | 19-086-291 | |
| Additional Materials Required for VCF Recordings: | |||
| VCF Microscope | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Nikon CFI APO 40XW NIR Objective | Nikon | N40X-NIR | |
| X-Y Translator System for Fixed-Stage Upright Microscopes | Sutter Instruments | MT500-586 | |
| External VCF Oocyte Bath | Custom | Custom machined. The chamber dimensions are 2.7 x 1.9 x 0.4 cm. | |
| Internal VCF Oocyte Bath | Custom | Custom machined. The chamber dimensions are 1.6 x 1.6 x 0.4 cm. | |
| Modified Temperature Control Bath | Custom | Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). The chamber dimensions of the modified temperature controller bath are 2.7 x 1.9 x 0.3 cm for the horizontal chamber, and 1 x 2.5 x 0.5 cm for the vertical chamber. |
References
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