Summary
גישת פער זלין החתך פתוח משמשת להשגת הקלטות רעש נמוכות של זרמים יוניים וgating מתעלות יונים מתח תלוי מבוטאים בביציות Xenopus עם רזולוציה גבוהה של קינטיקה ערוץ מהר. עם שינוי קל, fluorometry מהדק מתח יכול להיות מצמידים את פרוטוקול ביצית החתך פתוח.
Abstract
פער זלין ביצית החתך פתוח (COVG) טכניקת מהדק מתח מאפשרת ניתוח של מאפייני אלקטרו והקינטית של תעלות יונים Heterologous בביציות. הקלטות מהגדרת החתך פתוח הן שימושיות במיוחד לפתרון זרמים נמוכים gating הגודל, הפעלה נוכחית יונית מהירה, ושחרור משרות. היתרונות העיקריים על פני מהדק מתח שתי אלקטרודות טכניקה (TEVC) כוללים מהירות מוגברת מהדק, יחס אות לרעש משופר, והיכולת לווסת את תאית וסביבה תאית.
כאן, אנחנו מעסיקים ערוץ נתרן לב האנושי (HNA V 1.5), הביע ב ביציות Xenopus, כדי להדגים את הגדרת החתך פתוח ופרוטוקול, כמו גם שינויים דרושים כדי להוסיף את יכולת fluorometry מהדק מתח.
המאפיינים של ערוצים מהירים להפעלת יון, כגון HNA V 1.5, לא ניתן לפתור באופן מלא ליד טמפרטורת חדר באמצעות TEVC, באשרשעות השלמות של קרום הביצית הוא הידק, מה שהופך את בקרת מתח קשה. עם זאת, בטכניקת החיתוך פתוח, בידוד של רק חלק קטן מקרום התא מאפשר להידוק המהיר יידרש לרשום במדויק קינטיקה מהירה תוך מניעת ערוץ מוזנח הקשורים לטכניקות תיקון מהדק.
בשילוב עם טכניקת COVG, קינטיקה ערוץ יון ומאפייני אלקטרו ניתן assayed נוסף באמצעות fluorometry מהדק מתח, שבו תנועת חלבון היא מעקב באמצעות נטיית ציסטאין של fluorophores מיושם extracellularly, החדרה של חלבוני ניאון מקודדים גנטי, או שילוב של חומצות אמינו לא טבעיות לאזור של עניין 1. נתונים נוספים זה מניב מידע קינטית על שחלופי קונפורמציה מתח תלוי של החלבון באמצעות שינויים בmicroenvironment המקיף את מולקולת הניאון.
Introduction
טכניקות הידוק מתח מיוחדות תאפשר ההקלטה של זרמים יוניים בפוטנציאל קרום מבוקר. שימוש נרחב מהדק שתי אלקטרודות מתח (TEVC) וטכניקות תיקון מהדק לספק מידע אלקטרו אמין על המאפיינים של תעלות יונים רבות. עם זאת, שתי שיטות אלה יש חסרונות שמונעים הרכישה של נתונים מהימנים לערוצים במהירות מתח מגודרת נתרן וערוצים להפעלה מהירה אחרים בממברנות כגון אלה של ביציות Xenopus. מעבדות Bezanilla וסטפאני וכתוצאה מכך פיתחו את טכניקת החיתוך פתוח מהדק מתח פער זלין (COVG) לביציות 2. הטכניקה כבר מיושמת באופן נרחב כדי להקליט, Na +, K +, וCa 2 ערוצים + 3-8.
במהלך הקלטת COVG, קרום ביצית-לבטא חלבון Heterologous מחולק לשלושה אזורים. הנתונים הנוכחיים היוניים נרשם מהאזור העליון של הביצית כאמבטיה המקיפה את האזור העליון מהודקת לפוטנציאל פקודה, אשר ניתן לשנות בקלות ובמהירות. האזור האמצעי שומרים נגד זרמי זליגה על ידי שהדק את אותו פוטנציאל כמו של האזור העליון 9. האזור התחתון הוא שבו פתיחת ביצית (לחתוך פתוח) מתרחשת באמצעות השימוש בפתרון saponin או צינורית. כימי או פתיחה ידנית של הקרום באזור התחתון מאפשרת שליטה של הפוטנציאל הפנימי, שהוא הידק לאדמה, והופך את רציף התא הפנימי עם פתרון התא התחתון. טפטוף של פתרונות לתא התחתון ניתן להתאים את המאפיינים של הסביבה הפנימית, ואילו מטבע פתרון בתא העליון משנה את הסביבה החיצונית. 
איור 1. ביצית Cut-Open תרשים התקנת מתח-קלאמפ אמבט. () למעלהלמטה תצוגה של שלוש האמבטיות מופרדות אחד מהשני. ממדיהם של התאים לCOVG מוצגים באיור. (ב) להציג צד של התקנת האמבטיות בעמדת בדיקה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
היתרונות של טכניקת COVG כוללים רעש נמוך הנוכחי (1 NA ב3 קילוהרץ), שליטה על הרכב היוני של מדיה החיצונית, היכולת לווסת את התקשורת הפנימית, ברזולוציה זמן מהיר (20-100 המתמיד של דעיכה של μsec זמן קיבולת חולפת), והקלטות יציבים במשך כמה שעות 9. החסרונות הם שזה דורש ציוד מיוחד וקשה יותר לביצוע בהשוואה לשני הידוק מתח האלקטרודה (TEVC) 10.
בעוד גישת COVG דורשת ציוד מיוחד מאוד ואלמנטים פרוצדורליים מורכבים, זה יכול לאפשר לרכישת valuנתונים אלקטרו מסוגלים. נתונים אלה, כגון gating זרמים עם קינטיקה מהירה וזרמי זנב 4, ניתן להקליט בלי חלק מהנושאים הקשורים לפרוטוקולי הידוק מתח אחרים, כולל ערוץ מוזנח. שינויים קלים להתקנת COVG יכולים לאפשר את השימוש בבקרי הטמפרטורה וfluorometry מהדק מתח (VCF). הכללתם של אלמנטי fluorometry מהדק מתח בתוך ההרכבה COVG יכול להגדיל את תפוקת נתונים על ידי המקנה את היכולת לעקוב אחר שינויי קונפורמציה חלבון בעת הקלטת 11-13 הנוכחי בו זמנית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. התקנת ציוד ראשונית
- מניחים את הבמה ומניפולטור microelectrode על מערכת רטט בידוד (למשל שולחן אוויר) עם כלוב פאראדיי המקיף כדי למנוע רעש חשמלי ומכאני.
- הלחמה שישה כדורי Ag / AgCl לאורכים של שישה סנטימטר של 24 חוט AWG. לאחד מהאורכים האלה (להיות מחוברים לP1), אחוי בחוט שני כדי ליצור "Y". בקצוות של כל חוט להלחים סיכת BNC זהב, אשר כלולה במגבר.
- חברו חמישה כדורי Ag / AgCl מולחם ל24 חוט AWG לheadstage אמבט / המשמר (P1, P2, CC, GS1, וGS2). חבר את "אני" גלולה Ag / AgCl לheadstage "אני" והחוט השני מגיע הנחה של P1 לheadstage V2.
- חברו את המגבר ליחידת רכישת נתונים בהתאם להנחיות במדריכי הציוד.
- מקום ואפוקסי thermistors בקר הטמפרטורה. השחל את תרמיסטור הבלוק דרך חור בפיגומי המתכתd ישירות מעל מרכז גוף החימום / קירור. מקום ואפוקסי תרמיסטור האמבטיה בחור שנקדח בגוף של החדר התחתון ניצוח הטמפרטורה קרוב מאוד, אבל לא ליצור קשר עם הפתרון.
2. ביצית והכנה ראשונית
- כדי להקליט ערוץ הביע heterologously כגון HNA V 1.5, לסנתז mRNA (הנגזר מhSCN5a) ומזריק אותו לתוך ביצית Xenopus סביב 4-5 ימים לפני ביצוע 4 לפרוטוקול. לhSCN5a, ביטוי שיא מתקבל לאחר דוגרים במשך 4-5 ימים ב19 ° C. עיין ריצ'רדס וDempski 14 וכהן et al. 15 להוראות מפורטות על ביצית, הכנת ה-mRNA, והזרקת ביצית.
- כלוריד חוט AgCl וכדורי AgCl לפני תחילת פרוטוקול 4. כדי לעשות זאת, הנח את הקצה אחד של החוט ואת כדורי לתוך אקונומיקה לפחות 20 דקות וכל עוד O / נ ברגע שהכדורים כבר chlorided, יצמיד אותם לסעפת באמצעות דבק.
שים לב: גם נהיגה זרם דרך החוטים יכולים לשמש כדי כלוריד החוט וכדורים. טכניקה זו תגביר את המהירות של chloridation אלא גם דורשת יותר ציוד. ראה טכניקות לChloriding חוטי כסף להמשך הוראה 16.
3. אגר גשר הכנה
- להפוך לפחות שישה גשרים אגר על ידי חימום קצה אחד של צינור נימי ורוסיליקט בלהבה בינונית. ודא כי בסופו של צינור הנימים הוא בחלק העליון של הלהבה הכחולה. הפוך נוספים גשרים במקרה של נזק למקור.
- ברגע שצינור הנימים כבר התחמם, להשתמש במלקחיים כדי להפוך את עיקול זווית של ° 90 בצינור. לשאוף לעיקול עם עקמומיות חלקה ולא פינה פתאומית או שהוא עשוי להפחית את הקוטר הפנימי של הזכוכית, מה שהופך את המילוי קשה יותר ומגבירה את ההתנגדות של הגשר באופן משמעותי.
- הפוך עיקול 90 ° שניבאותו הכיוון 25 מ"מ במורד צינור הנימים מהעיקול הראשון באמצעות אותם השלבים.
הערה: אורכו של הגשר המדויק לא משנה, כל עוד את גודל הגשר עולה בקנה אחד, אבל בסופו של האורכים צריכים להיות מתאימים למתקן שהם ישמשו ב. יש לזכור כי התנגדות גשר היא פרופורציונלית לאורכה וצריכה להיות ממוזערת. - ברגע שצינורות הנימים התקררו, השתמש חותך זכוכית יהלום שקצה לקצץ את "הרגליים" של הגשר כ 5 מ"מ.
- הכנס אורכים של חוט פלטינה לתוך צינורות הנימים של שלושה גשרים "הנוכחי באספקת" כדי לשפר את ביצועים על ידי הפחתת התנגדות ב17 אגר. חותכים את כל חוט פלטינה עודף, כך שאין שום חוט החשוף מחוץ לצינור.
הערה: בשל העלות הגבוהה של פלטינה, לאחזר ולעשות שימוש חוזר בכל חוט מגשרים שבורים. - דחוף את חוט הפלטינה יותר לתוך צינור הנימים עם קנס שקצהו ליישם כגון t micropipetteה-IP, כך שהתיל הוא 1 מ"מ קצר יותר מהזכוכית בשני הקצוות של צינור הנימים.
- הפוך של 1 M NMDG 100 מיליליטר שנאגרו עם 1.2 גרם של HEPES. השתמש במד pH ולהוסיף אבקת מימה MES עד pH של 7.4 מושגת (~ 10 ז). ברגע שכבר הגיעה לרמת חומציות של 7.4, להסיר את אלקטרודת. מניח בצד 40 מיליליטר של הפתרון כדי לשמור על כפתרון אחסון.
- להוסיף אגר מגורען לייצר תערובת אגר 2-3%. מערבבים וחום עד לפתרון אגר נמס וברור. לא לחמם יותר מדי או להרתיח את הפתרון כפי שהוא יהפוך יתר על המידה צמיג ומילוי הגשרים יהיו קשים.
- הזז את הפתרון אגר לכוס חדשה ולהוסיף סרגל מערבבים קטן. המשך חימום וערבוב במהירות בינונית.
- מוסיף את גשרי נימים אחד בכל פעם עם הרגליים כלפי מעלה. במשך זמן הגשרים ימלאו עם אגר. לחלופין, למלא את הגשרים על ידי דחיפת פתרון אגר באמצעות מזרק המצורף לקצה פיפטה קטן.
- ברגע שאין בועות בBRIdges, לאחזר את הגשרים מהפתרון אגר ולמקם את הגשרים על מגבת נייר לייבוש. כל גשרים עם בועות שיורית יכולים להיות נסערים עם מלקחיים כדי להקל על יציאת בועה.
הערה: אגר התיישבו עם בועות ניתן להסיר לחלוטין על ידי טבילת הגשרים לתוך מים רותחים. ברגע שאגר מוסר, להשתמש בקו ואקום כדי להסיר מים שיורית. גשרים לאחר מכן ניתן לעשות שימוש חוזר לטיפול אגר. - הסר אגר עודף מהגשרים כאשר יבשים. הוסף 60 מיליליטר מים לפתרון המילואים 40 מיליליטר ולמקם את הגשרים בפתרון האחסון.
4. הכנת המתקן חיתוך פתוח
- הפעל את מקור המים עבור בקר הטמפרטורה ולאחר מכן את מתג ההפעלה לבקר הטמפרטורה. חכה עד שטמפרטורת האמבטיה מגיעה לטמפרטורה המסוימת (19 מעלות צלזיוס).
- משוך microelectrodes מצינור נימי ורוסיליקט עם חולץ microelectrode להתנגדות של 0.2-0.5 MΩ.
הערה: PIP הורדההתנגדות ette משפרת את מהירות הידוק. עם זאת, טפטפות התנגדות נמוכה יותר יש סיכוי גבוה יותר לגרום נזק לביצית. ניסויים הנדרש כדי לקבוע את ערך התנגדות פיפטה הטוב ביותר עבור כל יישום. - הכן את פתרון saponin ידי ערבוב 0.125 גרם של saponin היבש עם 50 מיליליטר של תמיסה פנימית. זה יוביל לפתרון 0.25%. היפוך בעדינות לתערובת.
- תחת מיקרוסקופ לנתח להחיל כמות קטנה של וזלין מסביב לקצה של החור בצד העליון של החדר באמצע והצד התחתון של החדר העליון עם אובייקט קנס שקצהו מאוד.
הערה: "הסופגנייה" של וזלין תעזור לשמור על הביצית במקום מעל החור ותסייע ביצירת את החותם. עם זאת, יותר מדי וזלין יהיו בועות מלכודת ולמנוע את הפתרונות מלהגיע לפני שטח הביצית. - הוסף 3 פתרון M KCl לתוך חריצי הסעפת מחזיקים כדורי Ag / AgCl כך שאין גלישה מהחריצים אבל כדורים וקצות רגל גשר הם מפרצוןאדום. לנקות טיפות KCl נוספות כדי למנוע חיבורי חשמל בלתי רצויים בין חריצים.
- הוספת פתרון חיצוני לתאי האמבטיה הנמוכים ובינוניים.
- הנח את אגר גשרים לתוך החריצים בסעפת גלולה AgCl כך שרגל אחת לגשר היא בכל חריץ. הרגל השנייה של הגשרים תהיה מאוחר יותר להיות ממוקמת לתאים המתאימים (P1, P2, ראש CC; GS1, באמצע GS2 (שומר); למטה). ודא כי גשרי חוט פלטינה נמצאים בGS2, P2, ואני חריצים.
הערה: ודא גשרים נשטפים עם מים מזוקקים ויבש לחלוטין לפני הכנסה לחדר אמבטיה. - הפעל את מערכת רכישת נתונים והמחשב האישי. הפעל את תוכנת ההקלטה.
5. נוהל חתך פתוח
- התקן את תאי הביצית העליונים באמצע ללא ביצית. חלק את התא העליון מחוץ למרכז, כך שהחורים בשני תאים אינם חופפים. למלא את כל התאים עם פתרון חיצוני ולמקם את כל האלקטרודות בתאים שלהם בהתאמה.
שים לב: אין לדחוף את התא העליון כל הדרך למטה בעת התקנת התאים. ודא פער קטן מאוד נותר בין שני החדרים. ההסדר מחוץ למרכז מגביר את ההתנגדות של מערכת התא כדי לדמות את נוכחותם של תאים טובים יותר. תהליך זה, המכונה "איזון הגשרים", מפצה על פוטנציאלי קיזוז שיכול לנבוע מinhomogeneity בקרב אגר הגשרים.- כבה את הפיקוד החיצוני ושני מלחציים. בדוק את הקריאה הנוכחית על המגבר. התאם עם מברג קטן P קוזז בחלק האחורי של הראש בשלב אמבטיה / שומר לאפס נוכחית.
- העבר את מתג אמבטיה / שומר על המגבר לפעיל ולהתאים את GS לקזז להשיג אפס נוכחית.
- חזור על פעולה בין "פעיל" ואת "פסיבי", עד ששניהם סבירים קרובים לאפס (<100 Na).
- הסר את התא העליון ולהעביר את ביצית אל תוך חדר האמבטיה הבינוני באמצעות משאבת פיפטה. ודא oocyte ממוקם מעל לחור במרכזה של האמבטיה.
שים לב: בעת ההכנה לביצית VCF, למקם את התא שכותרתו לתוך התא עם קוטב החיים (צד אפל) יפנה כלפי מעלה. נטייה תא לא משנה אם VCF לא מתבצע. - הסר פתרון חיצוני עודף מהאמבטיה התחתונה באמצעות aspirator ליצור חותם בין הביצית ומשטח אמבטיה.
- מניחים את חדר האמבטיה העליון מעל הביצית כך שהחור בתא מרוכז בחלק העליון של הביצית. באמצעות אגודל ואמה, להחיל לאט לחץ כלפי מטה על החדר עד שהוא לחץ בחוזקה נגד הביצית כדי לחשוף רק חלק קטן מהקרום לאמבטיה העליונה דרך החור.
הערה: הביצית עלולה לתפוח בלחץ מהתא העליון. אין להפעיל כוח מוגזם לתא העליון, שכן הדבר יגרום לביצית להתפקע. פינצטה טיפים ממוקמים בפינות אלכסוניות של התא העליון יכולים לשמש כתחליף לאצבעות לApplלחץ כלפי מטה y. - הוספת פתרון חיצוני לאמבטיות העליונים ותחתונים עד שהם כמעט מלאים.
- הנח את הרגליים חופשיות של אגר גשרים לפתרון החיצוני של כל אמבטיה כפי שניתן לראות באיור 2 (מיקום גשר). ודא כי כל גשר נח באמבטית המיקום הנכון שלה. (אני לגשר באמבטיה תחתונה, גשרי GS1 וGS2 באמבטיה באמצע, וP1, P2, וגשרי CC בעליון אמבטיה). העבר את מתג אמבטיה / שומר על המגבר לפעיל.
הערה: ודא כי אין 3 חיבורי M KCl בין הגשרים, הבארות שלהם, וחדרי ההקלטה. יתר על כן, ודאו גשרים הם נושן, כך שהם גדלים מעל פתרונות תא הקלטה.
איור 2. מקומות תרשים מיקום ההתקנה אגר גשר. מיקום של הקצוות חופשיים של אגר הגשריםבאמבטיות השונות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. - התחל פרוטוקול בדיקה בתוכנת הצריבה. אם הדופק מראה תזוזה אנכית של הסעיף האופקי בין שתי הפסגות על החלת דופק mV 100 שהוא גדול יותר מ100 NA (המקביל ל 0.3 MΩ עם האמבטיה / השומר בפסיבי) ולאחר מכן להגדיל את אטימות של כיסוי האמבטיה. ראה איור 3 לדוגמא של דופק בדיקה אידיאלי.
הערה: פרוטוקול הבדיקה פולט דופק מתח כדי לראות אם כיסוי האמבטיה הוא מספיק חזק וכל הרכיבים הורכבו בצורה נכונה. לחלופין, ניתן להשתמש בפונקצית הבדיקה של המגבר.
איור 3. דופק אידיאלי מבחן מתוכנת הצריבה. דופק המבחןצריך להיראות דומה לדופק מעל בהתאם לפרוטוקול מיושם. הנוכחי ההחזקה (בסיס במרכז) צריך להיות קרוב לאפס. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. - הסר את הפתרון החיצוני באמבטיה התחתונה ולהחליף עם פתרון saponin. להיות זהיר, כדי למנוע יצירת בועות תוך הוספת saponin. כדי להבטיח החלפה המרבית, להחיל יניקה בקצה השני של האמבטיה התחתונה תוך הוספת הפתרון.
- לאחר פתרון saponin כבר הוסיף, לבחון את דופק הבדיקה החוזר. אם שיאו של פרוטוקול הבדיקה מפחית או נעלם אז זה סימן שיש בועה הממוקמת מתחת לביצית. במקרה זה, להסיר לחלוטין את פתרון saponin ולאחר מכן להחליף אותו.
הערה: permeabilization הוא בדרך כלל מלא תוך 30 שניות עם פתרון saponin טרי. ייתכן שיש הפתרונות מתקשים להגיע לתא אם יש בועות לכודיםאו אם שכבת הזקיקים נשארת על ביצית מתעכל בצורה גרועה. הביצית כבר permeabilized (נפתח) כאשר השיפוע של ספייק המתח יורד (עלייה המתמדת של ריקבון זמן).
איור 4. דופק בדיקת עקבות במהלך הביצית permeabilization. עקבות נבחרות מפרוטוקול דופק הבדיקה לאחר פתרון saponin 0.25% הוכנס לתא הביצית התחתון. הגידול של בליה קבועה ראתה את עקבות הזמן מדגים גידול של permeabilization ביצית. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. - ברגע שהתא permeabilized, להסיר את פתרון saponin ולמלא האמבטיה עם פתרון פנימי. עצור את פרוטוקול הבדיקה.
הערה: למרות שsaponin מאפשר גישה לפנים של התא על ידי permeabilizing הקרום, איזון של ריכוזי יון בין האמבטיה וציטופלסמה של הביצית על ידי דיפוזיה הנמוכה הוא תהליך איטי מאוד. תהליך זה עשוי לדרוש עשרות דקות, תלוי בתנאים (איור 5). - הגעה לכל רמות גבוהות של פתרון באמבטיות והתגבש KCl בין הבארות של הסעפת כמו אלה יכולים לגרום לקצרים והתנהגות בלתי יציבה.
- השתמש במזרק שונה כדי להזריק 3 M KCl לתוך microelectrode. פליק microelectrode מספר פעמים באצבע אחת תוך מרענן עם אצבעות האחרות.
הערה: צעד זה נדרש כדי להסיר כל בועות אוויר שנלכדו בתוך microelectrode. - הר את האלקטרודה מולא-KCl על זרוע micromanipulator על ידי החדרת חוט התיל לתוך סוף microelectrode הפתוחה. דחוף את סוף microelectrode לבעל נימה ולוודא את האלקטרודה היא לא משוחררת. להדק את אטב האלקטרודה.
הערה: מאKe בטוח שיש לו את החוט אפילו AgCl ציפוי לאלקטרודה לתפקד כרגיל. - סובב את הזרוע לתנוחה על אמבטיות הביצית ולהדק את מהדק כדי למנוע תנועת זרוע נוספת.
- באמצעות כפתורי מניפולטור, ללכת האלקטרודה לתוך האמבטיה. יש לוודא שאין דופק מבחן מוחל ושתכונת בדיקת הקרום לא מופעלת בשלב זה.
הערה: לפני קצה האלקטרודה מוחדר לתוך הנוזל, V1-V2 במהדק המתח ייקרא מתח חיובי. ברגע שקצה האלקטרודה מוחדר לתוך הנוזל, מד המתח על מהדק המתח צריך לשנות לערך קרוב לאפס. עבור הקלטות VCF, אלקטרודה צריכה גישה לתא בזווית רדודה למדי להשאיר מקום לאובייקטיבי. משפד את התא עם האלקטרודה מחוץ למרכז, קרוב יותר לקצה של תיקון הקרום המבודד גם עוזר למנוע את ההתנגשות של אובייקטיבי עם אלקטרודה. - תפסיק ללכת במורד האלקטרודה. הגדר את האלקטרודה לקזזפוטנציאל אפס על ידי לחיצה על כפתור V1 ולאחר מכן להפחית את מתח V1 לאפס על ידי התאמת V1 לקזז. בנוסף, לבצע את אותה ההתאמה לV2. V1-V2 ההבדל הפוטנציאלי צריך לקרוא 000 mV.
- לעבור בחזרה לV1 ולהפוך Z-בדיקה על מנת למדוד התנגדות האלקטרודה. הערך ייפול בהדרגה ומתקרב להתנגדות של ממש. לשאוף לערך התנגדות של 0.2-0.5 MΩ.
- המשך ללכת במורד לכיוון האלקטרודה התיקון הגלוי של הביצית באמבטיה העליונה. ברגע שmicroelectrode היא קרובה מאוד לביצית, לצפות בקריאת V1-V2 כדי לראות מתי האלקטרודה נכנסה לביצית; מתח V1-V2 יהפוך שלילי כאשר microelectrode נכנסה לתא.
הערה: הערך המוצג בשלב זה הוא את פוטנציאל הקרום של התא ויושפע מערוצי ביטוי והפתרונים בשימוש. הכנסת microelectrode רחוקה מדי תפגע בקרום התא. - פתח את פרוטוקול איסוף הנתונים בתוכנת הקלטה.
- הדליק את מתג המהדק על מהדק המתח ולהתאים את הפוטנציאל כדי להתאים את הפקודה (mV למשל -100) על ידי התאמת הידית ממוקמת על headstage "אני".
- הדליק את מתג הקיבוליות ופיצוי התנגדות.
- להעיף את "המבחן" לעבור על באזור "פקודות" של מהדק המתח. השתמש באוסצילוסקופ כדי להמחיש את האות. כוון את ידיות פיצוי ס"מ בקטע אות האוויר כדי להפחית את ארעיים קיבולי על אוסצילוסקופ. אל תפצה מעל הפסגות לנקודה שבה פסגות הפוכה נוספות, או שהפסגות להתחיל לפתח עקמומיות sigmoidal, אשר יכולות להציג את החפץ להקלטה.
- ברגע שהקיבול צומצם באופן ידני לרמת משביעת רצון, לכבות את מתג הבדיקה.
- להתחיל את פרוטוקול הקלטת נתונים בתוכנת הצריבה.
6. ניקוי
- כאשר יש לי הקלטות דבורהn הושלם, כבה את כל המתגים השונים על מהדק המתח כוללים המהדק והאמבטיה / מתגי שומר.
- שימוש במלקחיים כדי להסיר את אגר גשרים מהאמבטיות השונות.
- הסר את האמבטיה העליונה ולשאוב את כל פתרונות וביצית מכל האמבטיות.
- השתמש בבקבוק המים deionized כדי לשטוף את כל האמבטיות ולאחר מכן לשאוב את האמבטיות עם ואקום. חזור על שלב 3-5x זה.
- נגב KCl המגובש מהגשרים ולמקם את הגשרים בפתרון האחסון. גשרים ניתן לעשות שימוש חוזר במשך שבועות רבים, כל עוד הם מאוחסנים כראוי.
- לשאוב את פתרון KCl מהבארות הסעפת ולשטוף את הסעפת עם מים deionized מספר פעמים.
- כבה את כל הציוד השונים, כולל בקרת הטמפרטורה ותוכנת הצריבה.
7. תוספת של מתח קלאמפ Fluorometry
- בצע את השלבים בסעיף 1 עד 6 בפרוטוקול יופיטר שפורסם בעבר 16 Examining Dynamics קונפורמציה של החלבונים ממברנה באתרו עם תיוג פלואורסצנטי ביים אתר: לחץ כאן כדי לצפות בדף.
- בצע את השלבים בסעיף 4 עד 5.22 של פרוטוקול COVG האמור באמצעות מיקרוסקופ VCF להגדיר במוקד 4X.
הערה: הקלטות VCF דורשות תאי ביצית אמבטיה גדולים יותר מהנדרש במדידות COVG. (הממדים של תאי VCF המותאם אישית נמצאים ברשימת החומרים.) קאמרי VCF גדול זה חייב להיות מסוגל בו זמנית אדיב העדשה האובייקטיבית, microelectrode, וגשרים אגר. בנוסף, קוטב החיים (הצד אפל של הביצית) צריך להיות מופנה כלפי מעלה בתא להקלטות VCF רקע נמוך. - להביא את החלק העליון של הביצית אל מוקד באמצעות מטרת 40X מים טבילה.
הערה: מעבר מ4X לאובייקטיבי 40X דורש ge ספציפיometry של רכיבי חתך פתוח ותשומת לב קפדנית על מנת שלא לפגוע באלקטרודה, גשרים, או תאים בעת ההורדה אובייקטיבי 40X. כמו כן, בשל העלייה בהיקף בשומר הראש, להבטיח כי אמבטיה נפח מהשומר העליון אינו מחובר עם השומר הבינוני כאשר מטרת 40X מוגדרת במקום. - פוקוס על טבעת סביב ההיקף של השטח נחשף ביצית, כך שהחלק העליון מאוד של הביצית הוא מעט מעל למישור המוקד.
הערה: התאמה במישור XY עשויה להיות נחוצה כדי ששדה הראייה הוא בעיקר מלא בקרום ולא החדר. תרגום XY מושגת בקלות על ידי מיקום של מיקרוסקופ בשלב תרגום. - הזז את קוביית המסנן לתוך הנתיב האופטי ולעבור נתיב האור מהעינית לגלאי (דיודה).
- הפעל את מקור VCF האור.
- כבה את האורות ממעל, הפנס אור בסיבים, ומקורות אור אחרים.
הערה: באופן אידיאלי, VCFיש לבצע הקלטות בחדר חשוך לחלוטין. - הפעל פרוטוקול הקרינה בתוכנת הצריבה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 4 מציג את השינוי בחדירות של הביצית כפתרון saponin מוחל על החלק התחתון של הביצית. איור 5 מדגים את שער חליפין פתרון תאיים על ידי דיפוזיה הבאה permeabilization saponin. 20-40 דקות נדרשות להגיע למצב יציב 2,18.
עקבות מופע איור 6 א שהופקו מפרוטוקול ההקלטה. איור מציג זרמים יוניים (לאחר חיסור דליפת P/-8) בתגובה לפרוטוקול המתח (הבלעה). כל זכר בדמות מייצג מתח מיושם שונה. העקבות עם קינטיקה האיטית ביותר לייצג את הפוטנציאל הנמוך ביותר שבי ערוץ נתרן יכול לפתוח. בדרך כלל, בשיטות מסורתיות, קשה לשמור על בקרת מתח לפוטנציאל הנמוך האלה כי הזרם פנימה depolarizes הממברנה. שלילת קוטביות בתורו זה מפעילה יותר ערוצי יצירת לולאת משוב חיובי . מהירות המהדק המשופרת של טכניקת החיתוך פתוח מאפשרת שליטת מתח הנדרשת להקלטת הערוץ אפילו על פוטנציאל הקשה אלה.
איור 6 מראה את עקומת הזרם / מתח, שנוצר מהעקבות באיור 6 א. ללא בקרת המתח שצוין לעיל, השיא הנוכחי בפוטנציאלים המוקדמים ביותר (~ -60 mV) יהיה מוערך יתר על המידה. זה ימנע תיאור מדויק של מערכת היחסים הנוכחי המתח.
איור 7 מראה דוגמא של תוצאות fluorometry מהדק מתח לביצית. אותות הקרינה נרשמו מביצית שכותרתו עם MTS-טמרה בציסטאין מוכנס במיקום 805 בתחום DiI של ערוץ נתרן לב האנושי Na V 1.5.
"Width =" _upload/51040/51040fig5.jpg "/> 500px
איור 5. קינטיקה של cytoplasmic Na + שינוי ריכוז על ידי דיפוזיה. שיעור איזון פתרון הפנימי הוערכה על ידי יישום 90 מ"מ Na + לשני הצדדים החיצוניים והפנימיים של התא ולאחר מכן למדוד את פוטנציאל היפוך Na + על ידי הקלטת יחסי IV כל 2 דקות. אם הסביבה הפנימית הוחלפה בצורה מושלמת, מתניע E יהיה 0 mV. מדידות זמן היו התחילו כאשר saponin permeabilized קרום הביצית. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 6. סוג Wild v Na 1.5תוצאות ערוץ נתרן מCut-Open מתח Clamping. עקבות (א) נרשם שוטף ממתחי גירויים שונים מפוטנציאל החזקת mV -80 עד -120 mV עבור 100 אלפית שני, דופק הבדיקה (-120 mV ל+40 mV ב 10 מרווחי mV) ל200 אלפית שניים, ולבסוף repolarizing ל-120 mV. (ב) עקומת IV, המייצגת את מתח התלות של זרם השיא בא פנל הנה, זרם שיא פולסים עד +60 mV מוצג. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 7. Na v 1.5 הקלטות מהדק ערוץ מתח נתרן Fluorometry. () זרמים יוניים נרשמו מביציתשכותרתו עם MTS-טמרה בציסטאין מוכנס במיקום 805 בתחום DiI-S4 של ערוץ נתרן לב האנושי Na V 1.5. קטניות מתח החל -170 mV ל+70 mV יושמו ב20 מרווחי mV עבור משך 20 אלפיות הבאים Prepulse ל-120 mV. (ב) אותות הקרינה הכרוכות בכך. כל זכר הקרינה אחר מושמט לבהירות. ΔF / F מייצג את השינוי היחסי של עוצמת הקרינה הנגרמת על ידי דופק המתח. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טכניקת מהדק החתך פתוח וזלין ביצית מתח פער מאפשרת פתרון מהיר של נתונים, רעש נמוך, שליטה מוגברת על פתרון פנימי והרכב פתרון חיצוני, והקלטות יציבים לאורך פרוטוקולים ארוכים יחסית 19. יתרונות אלה שנקבעו בטכניקה זו מלבד המהדק הסטנדרטי שתי אלקטרודות מתח וטכניקות תיקון מהדק. למרות שנדרש ציוד מיוחד והפרוטוקול הוא קשה יחסית, מעט מאוד בעיות להתרחש ברגע שהמערכת כבר מותאמת. זה מאפשר להקלטות לשחזור של נתרן (HNA V 1.5) וערוצי הפעלה במהירות אחרים.
השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הם המיקום של החדר העליון על הביצית וimpalement עם אלקטרודה V1. אטימות של החותם בין התא ואת הקצוות של החורים קאמריים יש לו השפעה גדולה על איכות הקלטה. התא העליון צריך להידחף למטה בתא כדי להשיג מחדש הגבוה ביותר האפשרייםsistance מבלי לפגוע בביצית. זה ידרוש ביצוע בליטת הביצית ולשטח, אך יש צורך בניסיון ושיקול של איכות תא כדי לקבוע את הלחץ האופטימלי כדי למנוע קרע. הקלטה מהירה דורשת שימוש בפתיחת פיפטה הגדולה ביותר האפשרית שניתן להשתמש בם באופן עקבי מבלי לפגוע בתא. תשומת לב מיוחדת צריכה להיות משולם על להתחדד של פיפטה, שאמורה להיות רדודים מספיק כדי לא להרחיב באופן משמעותי את הפצע כקצה פיפטה מוכנס. Impalement צריך להיעשות לאט ובעדינות, עוצר קידום אלקטרודה מייד עם הופעתו של קריאת פוטנציאל הממברנה.
נזק לקרום הביצית ופחות מחותמות ביצית / חדר מושלמים יכול להוביל לזרמי דליפה גבוהים. זרמי דליפה גבוהים תמיד ידרדרו את האיכות של ההקלטות. לכן, אתה צריכות תמיד יש הקלטות זרמים נמוכים דליפה (רצוי <150-200 Na). מעגל הפיצוי של המגבר, השימוש בדליפת שיתוף מקוון P / Nנהלי rrection, או off-line יכולים לפצות על דליפה נוכחית.
פתרון בעיות צריכה להתחיל על ידי שיוודא כי כל הרכיבים המחוברים בצורה נכונה או מותאם, אשר בדרך כלל לפתור את רוב הבעיות. במהלך הכנה והניסוי עצמו, תשומת לב מיוחדת צריכה להיות משולם לכל רמות נוזל שנשפכו או עולה על גדותיו והתגבשה KCl כמו אלה חשמליים יכולים להתחבר תאים שאמורים להיות מבודדים. אם מערכת מתנהגת באופן בלתי צפוי, לבדוק חיבורים חסרים או לא רצויים בין גשרים ותאים. בועות אוויר בתוך אגר הגשרים, בקצוות של אגר גשרים, או שנלכד מתחת לתא יכול גם לגרום לבעיות קישוריות שקשה לזהות.
שינויים, כפי שתואר לעיל, נדרשים לבצע fluorometry מתח המהדק (VCF) יחד עם COVG. השינוי העיקרי כרוך בשימוש בעיצוב אמבטיה שונה. על מנת להתאים את השימוש באובייקטיבי 40X מים טבילהבמיקרוסקופ, האמבטיה החדר העליונה חייבת להיות גדולה יותר ממה שזה היה צריך להיות להגדרת חתך פתוח סטנדרטית. היבטים אחרים וצרכי ציוד של הקלטת VCF במצב COVG דומים להקלטת VCF במצב המתח-clamp שתי אלקטרודות 14. כפי שהודגש בעבר, היתרון העיקרי של טכניקת COVG הוא בקרת המתח מהר יותר ומדויקת הרבה יותר בהשוואה לTEVC בתיקון קרום שמביע הרבה יותר תעלות יונים מאשר ניתן להשיג במערכות ביטוי תאים של יונקים. לכן, הטכניקה היא אידיאלית עבור VCF וgating לימודים הנוכחיים שבו הן ברזולוציה גבוהה זמנית ומספרי ערוצים גבוהים נדרשים לאותות לזיהוי.
למרות שבעיקרון חילופי פתרון שני במיוחד ותאי הם אפשריים, שלמותם והמהירות של חליפין שנקבעו כמה מגבלות על סוגים מסוימים של ניסויים. כפי שניתן לראות באיור 5, שיעור האיזון של ריכוזים יוניים בין הציטופלסמה וצ'אם הנמוךבער הוא איטי למדי הבא permeabilization saponin. שינוי ריכוזים יוניים ולכן צריך להיחשב במהלך ניסויים ארוכים לפני שהגיעו לתא במצב יציב. שעיר חליפין יכולים להשתנות במידה רבה בהתאם לתנאים. ביטוי גבוה ערוץ, כוח מניע גדול, ותוצאת טמפרטורה גבוהה יותר בקצב מהיר יותר. בניסוי שלנו התא קורר ל19 ° C, ביטוי ערוץ היה מתון, ותשלום נטו מונע על ידי פרוטוקולי IV היה מזערי עקב הכיוון הנוכחי משתנה. בהגדרות אלה טכניקת COVG הנורמלית היא נחותה לתצורות תיקון מהדק שונות. עבור יישומים הדורשים COVG החלפה מהירה של מדיום cytoplasmic ניתן להשתמש צינורית זלוף. בעתיד, תאי COVG נועדו עם יציאות מובנים זלוף עשויים לאפשר שליטה טובה יותר על מאפייני חילופי פתרונות תאיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
כל החברים של אוניברסיטת וושינגטון במעבדה להנדסה מולקולרית לב סנט לואיס. בורוז ברוכים קרן פרס קריירה בממשק המדעי - 1010299 (לJS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| External Solution | Brand | Catalog Number | [Final], weight, or volume |
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 25mM |
| MES Sodium Salt | Sigma-Aldrich | M5057 | 90mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 20mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | variable (pH to 7.4) |
| Internal Solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 105mM |
| MES Sodium Salt | Sigma-Aldrich | M5057 | 10mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 20mM |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | 2mM |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | variable (pH to 7.4) |
| Depolarizing Solution | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | 221473 | 110mM |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | 1.5mM |
| Calcium Chloride | Caisson | C021 | 0.8mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 10mM |
| Pipet Solution | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | 221473 | 3M |
| Saponin Solution | |||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | 0.125g |
| Internal Solution | See above | 50mL | |
| Agar Bridge Solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 100ml of 1M |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 1.2g |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | variable (pH to 7.4) |
| Granulated Agar | Research Products International | A20250 | 3% |
| NMDG Storage Solution | |||
| NMDG, HEPES, MES Hydrate solution | see above | 40ml | |
| Water | 60ml | ||
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| High Performance Oocyte Clamp | Dagan | CA-1B | |
| Data Acquisition System | Axon CNS | Digidata 1440A | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 210 | |
| Rack Power Filter | APC | G5 | |
| Heating/Cooling Bath Temperature Controller | Dagan | HCC-100A | |
| PC | Dell | Optiplex 990 | |
| pCLAMP 10.3 Voltage Clamp Software | Molecular Devices, LLC | pCLAMP10.3 | |
| TMC Vibration Control TableTop Platform | TMC | 64 SERIES | |
| TMC Vibration Control Air Table | TMC | 20 Series | |
| V1/I Electrode Data Collector | Dagan | part of CA-1B | |
| MX10L Micromanipulator | Siskiyou | MX10L | |
| Bath/Guard (I/V) Headstage (with appropriate connectors) | Dagan | part of CA-1B | |
| Microscope | Omano | OM2300S-JW11 | |
| Temperature Control Bath | Custom or Dagan | Custom or HE-204C | Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). Dagan also provides a prefeabricated stage (HE-204C). |
| Custom AgCl Pellet Container | Custom | Custom | Custom machined |
| Ag/AgCl electrode, pellet, 2.0 mm | Warner | E-206 | |
| External Oocyte Bath | Custom or Dagan | Custom or CC-1-T-LB | Custom machined or purchased from Dagan |
| Internal Oocyte Bath | Custom or Dagan | Custom or CC-TG-ND | Custom machined or purchased from Dagan |
| Capillaries for Agar Bridges and Pulled Electrodes | Warner | G150T-4 | |
| Rotatable Mounts for the Microscope, Micromanipulator, and Bath | Siskiyou | SD-1280P | |
| Fiber-Lite | Dolan-Jenner | LMI-600 | |
| Regular Bleach | Clorox | 470174-764 | |
| Xenopus laevis Oocytes | Nasco | LM535M (sexually mature females) | |
| 90 Na+ External Solution | See Solutions sheet | ||
| 10 Na+ Internal Solution | See Solutions sheet | ||
| 3 M KCL | See Solutions sheet | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| NMDG Storage Solution | See Solutions sheet | ||
| 5mL transfer pipets | SciMart | GS-52 | |
| Modified KCl electrode injector | BD | 309659 | Plastic syringe tip melted to allow for injection of solution into electrodes. Alternatively, a Microfil by WPI can be purchased. |
| Microvaccum | Custom | Custom | |
| Forceps | VWR | 63040-458 | |
| Oocyte Handling Tools (Pipette Pump) | VWR | 53502-222 | |
| Deionized Water Squirt Bottle | VWR | 16649-911 | |
| Vaseline Petroleum Jelly | Fisher Scientific | 19-086-291 | |
| Additional Materials Required for VCF Recordings: | |||
| VCF Microscope | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Nikon CFI APO 40XW NIR Objective | Nikon | N40X-NIR | |
| X-Y Translator System for Fixed-Stage Upright Microscopes | Sutter Instruments | MT500-586 | |
| External VCF Oocyte Bath | Custom | Custom machined. The chamber dimensions are 2.7 x 1.9 x 0.4 cm. | |
| Internal VCF Oocyte Bath | Custom | Custom machined. The chamber dimensions are 1.6 x 1.6 x 0.4 cm. | |
| Modified Temperature Control Bath | Custom | Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). The chamber dimensions of the modified temperature controller bath are 2.7 x 1.9 x 0.3 cm for the horizontal chamber, and 1 x 2.5 x 0.5 cm for the vertical chamber. |
References
- Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in KV channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8272-8277 (2013).
- Stefani, E., Bezanilla, F. Cut-open oocyte voltage-clamp technique. Methods Enzymol. 293, 300-318 (1998).
- Muroi, Y., Chanda, B. Local anesthetics disrupt energetic coupling between the voltage-sensing segments of a sodium channel. J. Gen. Physiol. 133, 1-15 (2009).
- Stefani, E., Toro, L., Perozo, E., Bezanilla, F. Gating of Shaker K+ channels: I. Ionic and gating currents. Biophys. J. 66, 996-1010 (1994).
- Wang, S., Liu, S., Morales, M. J., Strauss, H. C., Rasmusson, R. L. A quantitative analysis of the activation and inactivation kinetics of HERG expressed in Xenopus oocytes. J. Physiolt. 502 (Pt 1), 45-60 (1997).
- Neely, A., Garcia-Olivares, J., Voswinkel, S., Horstkott, H., Hidalgo, P. Folding of active calcium channel beta(1b) -subunit by size-exclusion chromatography and its role on channel function. J. Biol. Chem. 279, 21689-21694 (2004).
- Silva, J. R., Goldstein, S. A. Voltage-sensor movements describe slow inactivation of voltage-gated sodium channels I: wild-type skeletal muscle. Na(V)1.4. J. Gen. Physiol. 141, 309-321 (2013).
- Silva, J. R., Goldstein, S. A. Voltage-sensor movements describe slow inactivation of voltage-gated sodium channels II: a periodic paralysis mutation in Na(V)1.4 (L689I). J. Gen. Physiol. 141, 323-334 (2013).
- Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes. Biophys. J. 61, 78-82 (1992).
- Clare, J. J., Trezise, D. J. Expression and analysis of recombinant ion channels : from structural studies to pharmacological screening. , Wiley-VCH. (2006).
- Susan, G. A. Methods in enzymology. 296, Academic Press. 566-578 (1998).
- Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd edn. , Springer. (2006).
- Cha, A., Bezanilla, F. Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence. Neuron. 19, 1127-1140 (1997).
- Richards, R., Dempski, R. E. Examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling. J. Vis. Exp. , (2011).
- Cohen, S., Au, S., Pante, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. J. Vis. Exp. , (2009).
- Techniques for Chloriding Silver Wires. , Available from: http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/chloriding_wire.pdf (1999).
- Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. The silver-silver chloride electrode: a possible generator of offset voltages and currents. J. Neurosci. Methods. 19, 249-255 (1987).
- Gagnon, D. G., Bissonnette, P., Lapointe, J. Y. Identification of a disulfide bridge linking the fourth and the seventh extracellular loops of the Na+/glucose cotransporter. J. Gen. Physiol. 127, 145-158 (2006).
- Pantazis, A., Olcese, R. Cut-Open Oocyte Voltage-Clamp Technique. In: Roberts G. (Ed.) Encyclopedia of Biophysics: SpringerReference. Roberts, G. , Springer-Verlag Berlin Heidelberg. New York. (2013).
