Abstract
そのような大人の人間の心のような多くの組織は、十分に損傷後に再生することができません。組織工学における2,3の戦略は、回復と修復に体を支援するために技術革新を提案する。例えば、TEアプローチは、心筋梗塞（MI）後の心臓リモデリングを減弱、おそらくほぼ正常プレMIレベルに総心臓機能を高めることができるかもしれません。4、心臓組織の正常な再生がの適切な送達を含む任意の機能的な組織と同様に移植された細胞/組織移植片の統合と生存に有利な環境合図で複数の細胞タイプ。送達ビヒクル、細胞の生存に及ぼす影響、材料強度、及び細胞 - 組織組織の促進として評価可溶性シグナル、細胞間相互作用、およびマトリックス材料：操作された組織が含む複数のパラメータに対処すべきである。のみこれらの必須要素を無視し、移植片細胞の直接注入を利用する研究。2,5,6これらの成分を組み合わせた組織の設計は、まだ開発されなければならない。ここでは、「組織」における新たな血管の形成を増強するための標的臓器の細胞型および内皮細胞を含む生物学的由来の材料の2つの異なる種類のパターン化された細胞シートの積層を使用して統合された設計の例を提示する。これらの研究は、心臓のような組織の発生に焦点を当てているが、この組織の設計は、最小限の設計および材料の変更と心臓以外の多くの臓器に適用することができ、再生治療のための既製品であることを意味する。プロトコルは5詳細な手順が含まれています。温度感受性ポリ（N -isopropylacrylamide）（PNIPAAM）が被覆組織培養皿に使用される。その後、組織特異的細胞は強い横癒着による細胞シートを形成するためにコーティングされたプレート/マイクロパターン表面の表面上で培養される。第三に、ベースマトリックスは、血管新生permissiを多孔性マトリックスを組み合わせることにより、組織のために作成されヒドロゲルおよび内皮ve細胞。最後に、細胞シートは、完全な構築物を作るPNIPAAM被覆皿から持ち上げ、ベース要素に転送される。
Protocol
PNIPAAMコーティングされたプレートの1。作成
- 60％トルエン/ 40％ヘキサン溶液2ml中のPNIPAAmを2.6g溶解する。
- PNIPAAMが溶解するまで、撹拌を10分間60℃に混合物を加熱する。
- ブフナー漏斗中の直径60mmの円と場所紙にろ紙をカット。
- 予め秤量したガラスビーカーにブフナー漏斗を通して溶液を濾過（ヘキサンは、プラスチックを溶かすように、プラスチックを使用しないでください）。
- ベル真空（24 psi）でO / N（16時間）にビーカーと内容を配置します。注：残留物をイソプロピルと反応させるまでは、それが酸素と接触しないことを確認しますので、酸化する。
- PNIPAAMの重量を確立するためにビーカーを秤量する。
- w / w溶液50:50の作成、のPNIPAAmにイソプロピルアルコールを追加します。
- UV光の下で組織培養プレートの表面に溶液2mlを置き、5分間コート。
- 二回温PBS 2mlでプレートを洗浄し細胞培養に使用する前に。
細胞シートの2。作成
注：標的器官の一次細胞の細胞シートは、多数の異なる方法を使用して作成することができ、または、ここで説明したように、熱応答性ポリマーを用いて組織培養表面をコーティングすることにより。プリコーティングされた感熱プレートはまた、多くのベンダーによって提供されています。
注：このプロトコルは、35mmディッシュを用いて培養するためのものである。簡単に述べると、細胞をまず、隣接セル間の横方向の接続を確立するためにコンフルエンスで24時間、最低37℃でインキュベートする。細胞シートを解放するために、プレートは32°C以下の温度にさらされる。細胞シートは、その後、血管内皮細胞と血管新生許容ヒドロゲルを含む強塩基繊維マトリックスに転送される。
- 細胞集団を分離します。注：この方法は、個別の導出手順や細胞の種類に依存している。ラットの大動脈平滑ムーSCLE細胞（RASMC）は、この例で使用されている。これらは、ラットの腹部大動脈から単離した初代平滑筋細胞である。
- 温かい2mlのPBSで細胞を洗浄する。
- 5分間、細胞にトリプシン（または他の切断/解離溶液）3mlのを追加します。
- 10％ウシ胎児血清（FBS）を含む培地、またはリン酸緩衝溶液（PBS）を3mlの添加によりトリプシンを阻害する。
- 円錐管中の細胞を収集し、アリコートを数える。
- 5分間1000rpmで（228×g）で細胞をスピン。
- 上清を吸引し、その増殖培地中で細胞を再懸濁（SmGM2プラス弾丸キット培養液をRASMCに使用されます）。
- 100％コンフルエンスを達成する濃度でPNIPAAM塗装板 - 35mmの感熱プレート上の細胞を含む培地を配置します。注：のRASMCの場合その数は/ cm 2の 100,000個の細胞であると決定された。しかし、通過中の細胞の喪失に起因し、そのバージニア州の120％ LUEが使用されます。
- 37℃のCO / Nにおけるインキュベーターに置きます。注意：プレートへの細胞接着を維持するために、37℃で細胞を維持することが重要である。
ファウンマトリックスの調製
注：さまざまな3D繊維状マトリックスは、繊細な細胞シートとの間に強い繊維状マトリックスの層に使用することができる。いくつかの例には、これらの研究に使用ゲルフォーム、バイオガラス、天然の無細胞化材料26またはnanospun材料27,28ブタ膀胱マトリックス（UBM）は寛大に私たちの共同研究者、博士Badylakから提供された29。
- 使用前に、脱細胞化マトリックスが使用される場合、細胞内容物の欠如を含むマトリックスの特性を決定し、27,28、細胞特異的生存率、および空隙22
- 所望のサイズおよび形状に予め滅菌行列をカット。注：ここでは、ホールパンチが4mmの直径の円を切断するために使用される。
注：内皮細胞は幹細胞または前駆細胞からの分化を含む多様な供給源から得ることができる。ここで、HUVECを使用している。
- 架橋時間がある限り、任意の許容性ヒドロゲル（フィブリン、コラーゲンゲル）を使用して、細胞が生存留まるように十分に短い。注：ここでは、ジスルフィド架橋で架橋されたヒアルロン酸（HA）ベースのゲルが使用される。
- 会社のプロトコルに従って、HAハイドロゲルを準備します。
- 内皮細胞を回収し、1×トリプシンを用いて、単一細胞溶液中に分散。注：のAccutaseまたは細胞解離緩衝液はまた、単一の細胞分散のために使用することができる。
- 15ミリリットルの円錐チューブに溶液/細胞を回収、PBSでFBS（これは、細胞が血清に接触しないことが重要である場合）、大豆トリプシン阻害剤の等量を用いて、トリプシン酵素を失活または10％。
- C言語細胞をount、パッチ寸法（以前に定量化）するために必要な体積を計算する。注：4mmのパッチについては、こちらを200万内皮細胞が使用される。
- 200万細胞を抽出し、新たな15ミリリットルコニカルチューブに入れる。
- 5分間（228×g）でスピン。
- コニカルチューブ中のペレットとして細胞を残し、上澄み液を吸引。
- 1比：1でHAとゼラチン液体材料を混ぜる。その後、ペレットを含むコニカルチューブに全体積の80％を追加します。
- 1 HA /ゼラチン混合物：1の内皮細胞を再懸濁
- ステップ2からベースの繊維状マトリックスにHA /ゼラチン混合物中に懸濁した細胞を配置します。
- 架橋剤の所望の総体積の5分の1（20％）を追加
- 37℃で1時間インキュベートする。
細胞シートの5の単離
- で細胞培養フード内インキュベーターと場所からの細胞を含む35ミリメートルPNIPAAM処理プレートを外しRT。
- すぐに細胞から培地を吸引し、37℃に加熱された6％の通常のゼラチンの2ミリリットルを追加します。
- ゼラチンはまだ暖かいですが、通常のゼラチン（ムービー1）の表面下に沈め、ゼラチン中に金属格子を配置します。
- ゼラチンを硬化させること、5〜7分間氷の上にプレート全体を置きます。
- 7分後、慎重にプレートの側からゼラチンエッジを分離するために、スパチュラを使用し、その後、プレート（注）から金属格子持ち上げるために鉗子を使用します。6％のゼラチンを、そして細胞シートは、格子を持ち上げる必要があります。
- 皿に細胞シートを移動し、慎重に構造物の上に格子を設定し、ベース繊維マトリックスヒドロゲルの組み合わせの上に置きます。注：細胞シートの頂端側は、まだトップの位置になります。
- 温かいメディア（37℃）の2ミリリットルを追加します。
- O / Nがヒドロゲル表面に付着した細胞のシートを可能にインキュベートする。
- Tを削除する解決策は（約1時間）、または翌日を温めた後、彼は金属格子。
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Representative Results
フロー図（ 図1）は 、多層パッチを製造する全体的な方法を示している。細胞シートは、32℃以下の温度をドロップすることによってPNIPAAM処理プレートから剥がれた。その後、細胞シートは、下層繊維性マトリックス（ 図1）に播種した内皮細胞を含有する架橋されたヒドロゲルの上に配置される。前処理された感熱プレートは、細胞シートを作成するために使用することができる。特別トポロジカル表面は、特にパターンのセル30（ すなわち、整列させる）ために使用されます。
ベース繊維状マトリックスは、天然組織マトリックスまたはエレクトロを脱細胞化から生成することができる。ここでは、繊維性材料シートは、パッチベース（ 図2A）のために直径4mmに切断した。この材料の特徴付けは、空隙を充填するために使用することができるハイドロゲルの量を決定するために重要である。ここで使用される行列はpreviouされましたずるいことを特徴と発表した。22
内皮細胞を含有するヒドロゲルは、架橋された繊維マトリックスにHAヒドロゲルの液体成分を適用した後である。蛍光/透過顕微鏡検査は、架橋されたヒドロゲル内に捕捉されたカルセインAM（ 図2B）で染色した生きた細胞を示す。
細胞シートを作成するプロセスは、ベンダーから購入した当社独自のPNIPAAm被覆プレートとプレコーティングしたプレートとの比較を含めて、（ 図3）に結像される。 RASMCは、37℃で少なくとも16時間PNIPAAM処理された表面上にメッキされている。この最小時間は、細胞が隣接する細胞（ 図3A）と、その横ボーダーの癒着を確立することができます。注：細胞は、これらの横方向の寮生を確立するために、合流点でなければなりません。少なくとも16時間培養後、細胞のプレートを32°C以下に降下し、氷fを用い、室温まで移動させなければならないまたは5-8分冷却プロセス（ 図3B）を高速化します。温度降下は、細胞シート、プレートのリフトオフを可能にする材料コーティングのコンフォメーションの接触角を変化させる。 図3Cは、プレートから細胞シートの持ち上げを示している。
実験室でコーティングされたプレートを作成し、細胞シートを移動させるために、いくつかの最適化の後に、うまくいった。4Dは移送前RASMCのコンフルエントな単層を示しています。細胞が持ち上げるさせたときに、シートはそれ自体に折り畳ま固執する傾向があった（ 図3E）。実際には、社内のPNIPAAmを作成または購入したものは困難であったと、多くの場合、シートの裂けが生じます（ 図に細胞シートを操作する3F）。したがって、シートを移送するためのソリューションを開発した。細胞は、インキュベーターから取り出し、冷却を開始したら、6％のゼラチンは追加の金属lのセルをカバーするために使用されたゲル（ 図3G）内に埋め込 まattice。プレートが冷却されるように、細胞を持ち上げ、そしてゼラチンが硬化する。鉗子を用いて、ゼラチン - 格子及び細胞シートを培養プレートから一緒に除去することができる。すべて同じ時間（ 図3H）で。次に、これらの3成分基づく構築物（ 図3I）の上に配置されている。ここでは、細胞シート（ピンク）は、基礎となるベースマトリックス（ピンク細胞シートの下に厚い白マトリックス）よりもはるかに大きい。細胞シートは、簡単にサイズにトリミングすることができる。
最終的な細胞パッチ（ 図4）は 、パッチベースと寛容なヒドロゲルの予め形成された複合体に細胞シートを積層して作成されます。下から上に、パッチは繊維マトリックスで構成され、内皮細胞を含むヒアルロン酸ヒドロゲルを播種した後、細胞シートは、この行列の上に階層化されている。ゼラチン/格子明朝を使用せずに細胞シートを操作するための初期の試みのATUは、多くの場合、折り畳まれた（ 図4A-Dは上から見て）引き裂かれた非常に小さな細胞シートが得られた。 図4（a）は、早期のパッチを表すことのMitoTracker赤を組み合わせた合成写真をデザインRASMC（ 図4B）、カルセインAM緑色蛍光HUVECS（ 図染め図4（c））、及び透過光画像（ 図4D）。クローサー10倍の画像は、細胞シートのために供給され、HA /ハイドロゲルは、マトリックス（ 図4E-H）せず。 図4Eは mitotrakerレッド（ 図4F）の複合体である、カルセインAM緑のHUVEC（ 図4G）と透過光（ 図4H）。 （ベースマトリックス、HA / HUVEC）、および各コンポーネントの細胞シート画像の下からの眺めは、図4I-Lでのショーです。合成画像を図4J-Lで表され、個別部品を有する図4I、図4J SHで細胞シート（赤）、内皮細胞（緑色）は、 図4Kにあり、透過画像（ 図4L）OWS合成画像（ 図4M）は、行列の全領域を覆う均一な細胞シートを有するパッチを示していいずれの折り畳みまたは引裂き。なしで4M-Pはマトリックスに見上げ下からでもある図 。 図4Nは、ニュートラルレッドを含む、細胞シートである。シートはこれらの分野でのマトリックスのエッジに直接隣接ひだので繰り返しますが、太い赤ストリップはマトリックスの周りに表示されます。透過光画像化（ 図40）は、細胞の形態、およびマトリックスの構造を示している。最後に（ 図4P）は 、マトリックスは、DAPIと同じ波長で蛍光を発する特別な品質を有する。そのため、マトリックスの紫外線励起は、それが細胞シート（明るい赤）とは別に、明らかに表示するために使用されている。パッチのエッジはにトリミングすることができるマトリックスの縁の上にぶら下がっているシートのいずれかのエッジを削除します。
組織総会の図1のフローチャート。セル·シートは、温度応答性のPNIPAAmコーティングしたプレート上に細胞を播種し、細胞がコンフルエントに到達し、隣接するセルへの横方向の接続を確立するのに十分な時間を可能にすることによって作成される。細胞シートは、温度（黄色のディスク）を減少させることによって解放される。同時に、内皮細胞は強い塩基繊維性マトリックス、および化学的に架橋（白ディスク）のボイド空間に注入された新生血管許容HAハイドロゲルの中に埋め込まれている。必要に応じて細胞シート（黄色のディスク）の場合、内皮マトリックスの組み合わせ（白）を介して積層される。 にはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。
ベースマトリックスと内皮カプセルの2イメージ図。 （A）は強い塩基繊維状マトリックスは丸い形状に打ち抜く。ここでは直径4 mmのインビボ動物モデルに基づいて使用されている。のMitoTrackerグリーン（カルセインAM）ベースマトリックスの表面上のHAハイドロゲル中に懸濁し（10倍）で染色した（B）HUVECS。 拡大表示はこちらをクリックしてくださいこの図のバージョン。
細胞シートの3創造図。 （A）RASMC C16時間（10X）のためPNIPAAM処理した35ミリメートル、皿にultured。（B）RASMCは5-7分間氷上にプレートを配置した後に解除した。商業的に購入から解放する細胞シートのエッジ（C）画像を温度応答性細胞培養皿（10×）（DF）画像は、社内で作成PNIPAAMコートディッシュから細胞シートの生成のための同様の結果を示している。（D）コンフルエントRASMCは35ミリメートル、標準的な組織培養プレート（4X）上に成長させた。（E ）冷却した後、彼らは（4X）切り離されるように、細胞シートが収縮し、折り畳まれた。（F）により、単一細胞シートの脆さのために、細胞シートは、多くの場合、持ち上げたり、他の操作（4X）中に損傷されている。（G）で細胞シートの穿孔を軽減するためには、金属スクリーンは、細胞シートの転送を支援するために物理的な支持体として用いた。 RASMCは、6％のゼラチンおよび多孔質金属スクリーンのサポート、で覆われ、ニュートラルレッドで染色したND硬化させる。（H）画面のサポートにより、細胞シートは、最小限のダメージ（4X）で転送されます。（I） 大きなRASMC細胞シート層（ピンク色）を次に強い塩基繊維状パッチヒドロゲルの組み合わせ（矢印）の上に置いた。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
層化セルパッチ。細胞の図4。画像が pNIPPAMコーティングされた表面上で培養し、繊維マトリックスの表面にシートとして移動した。ゼラチン/金属格子で転送されなかった初期の試験では、小さなぼろぼろパッチ（AD）をもたらした。 （A）（BD）のコンポジット映像、を含む強い塩基繊維状マトリックスヒドロゲル組み合わせと組み合わせた細胞シートの（B）のMitoTracker Redにより染色された二枚のRASMCにおける、及び（C）HUVECを透過光で緑色、及び（D）で染色した。（E）複合画像Calceing AMは、ヒドロゲル中に懸濁した。強い塩基繊維状マトリックスヒドロゲル組み合わせの（H）伝送画像のHUVEC（緑）、および（F）のMitoTrackerレッドのRASMC。（G）グリーン蛍光染色したHUVEC。（I）複合画像から探し上向きに強い塩基繊維状マトリックス（染色されていない）を介してパッチの下部、HAは、それぞれのHUVEC（緑）、のRASMCの細胞シート（赤）を含む。（J）赤色蛍光のRASMCシート、ベース繊維状行列-を通して見たヒドロゲルの組み合わせ。（K）の緑色蛍光HUVECS。（L）パッチ構築物の透過像。（M）ベース繊維状マトリックスヒドロゲルの組み合わせ（自家青）オーバー細胞シート（赤）のコンポジット映像。シートカバーに（N）細胞エッジにおけるベース繊維状マトリックス、ハイドロゲルの組み合わせを示して増加した蛍光が原因です細胞のバンチング。コンストラクトの（O）伝送画像。（P）自然繊維質ベースマトリックスは、DAPI（青色波長）における自家蛍光である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ムービー1 。細胞のシートを転送するプロセスは、文書で提出された補足的な映画の中で強調表示されます。映画は、段階的なプロセスで、インキュベーターから細胞の除去を示す図である。 6％のゼラチン、目が挿入されたメディアの交換Eの金属スクリーン、氷上で細胞の萎縮、別の皿に、転送中の細胞の画像を、最後にシートから画面の除去のPNIPAAmコートディッシュからの細胞の転送。
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Discussion
プロトコルにおける重要なステップは次のとおりです。温度応答性高分子の板表面を被覆し、プレートを冷却した後、細胞シートを操作する。異なるセルは、異なる物理的特性を示すので、接着性のような、昇降時間は、各異なる細胞型について最適化されるべきである。このプロトコルの第2、及び最も重要な挑戦的な成分は、細胞シート、組織アセンブリのための方法の重要な態様での操作に集中する。細胞シート内の単一細胞層は非常に脆く、鉗子で操作した場合、容易に引き裂くことができる。細胞シートを所定の位置に保持されていない場合また、それらは収縮する傾向があり、容易に折り畳むことができる。支援画面を使用して提案された細胞シートの転送が脆弱な細胞シートの操作を補助する。
この原稿で提示設計手法は、組織工学アプリのさまざまな細胞シートを作成することはかなり低コスト·アプローチを提供していますカチオン。また、大学の研究室内PNIPAAMコーティングしたプレートを作成すると、複数の細胞型、および表面に適合させることができるプロトコルに、この方法及び修正を標準化することができる。細胞シートではなく、組織化されていない単一の細胞の使用は、組織アセンブリを助け、また、生存および移植された組織の統合の可能性を増加させることができる。しかし、これらの構築物のインビボ送達の方法は、（このプロトコールに記載されていない）は、各組織タイプのために最適化される必要がある。将来のアプリケーションは、特定の器官系用の組織を生成するための探査および最適化された方法論が含まれています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Calcein-AM | Invitrogen | C3099 | Cell tracker / live dye |
| Lysotracker Red | Invitrogen | L7528 | Cell tracker |
| Neutral Red | Sigma | N7005 | Visible Cell dye |
| pNIPAAM | Sigma Aldrich | 412780250 | Poly(N-isopropylacrylamide) |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511-1L | |
| Hexane | Sigma Aldrich | 296090-1L | |
| RAOSMC | Lonza | R-ASM-580 | Rat Aortic Smooth Muscle Cells |
| SmGM2 | Lonza | CC-4149 | Smooth Muscle Media |
| HUVEC | Invitrogen | C-003-5C | Human Venous Endothelial Cells |
| HyStem | Glycosan/Biotime | ||
| Isopropyl alcohol | VWR International | BDH1133-4LP | |
| Trypsin | Corning Cellgro | 25-053-C1 | |
| PBS | Gibco | 14287-072 | |
| FBS | Gibco | 16140-071 | |
| Specific Equipment | |||
| Filter paper | Ahlstrom | 6310-0900 | |
| Buchner Funnel | Sigma Aldrich | Z247308 | |
| UpCell Plates | Nunc | 2014-11 | |
| UV light | Jelight Company | UVO Cleaner Model No.42 | |
References
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