Abstract
Muchos tejidos, tales como los corazones humanos adultos, no son capaces de regenerarse adecuadamente después de un daño. 2,3 Estrategias en la ingeniería de tejidos proponen innovaciones para ayudar al cuerpo en la recuperación y reparación. Por ejemplo, los enfoques de TE pueden ser capaces de atenuar la remodelación cardiaca después de infarto de miocardio (MI) y, posiblemente, aumentar la función total del corazón a un nivel casi normal pre-MI. 4 Como con cualquier tejido funcional, regeneración exitosa del tejido cardíaco implica la correcta entrega de los múltiples tipos de células con señales ambientales que favorecen la integración y la supervivencia del injerto de células / tejido implantado. Tejidos reconstituidos deben abordar varios parámetros, entre ellos: señales solubles, interacciones célula a célula, y materiales de matriz evaluados como vehículos de administración, sus efectos sobre la supervivencia celular, la resistencia del material, y la facilitación de la organización de la célula a los tejidos. Los estudios que emplean la inyección directa de células del injerto sólo ignorar estos elementos esenciales. 2,5,6Un diseño tejido combinando estos ingredientes todavía no se ha desarrollado. A continuación, presentamos un ejemplo de diseños integrados que utilizan capas de láminas de células estampadas con dos tipos distintos de materiales de origen biológico que contenga el tipo de células de órganos diana y las células endoteliales para la mejora de la formación de nuevos vasos en el "tejido". Aunque estos estudios se centran en la generación de tejido de corazón-como, este diseño de tejido se puede aplicar a muchos otros órganos además de corazón con diseño y el material cambios mínimos, y está destinado a ser un producto fuera de la plataforma para las terapias regenerativas. El protocolo contiene cinco pasos detallados. Una temperatura de poli sensible (N -isopropylacrylamide) (PNIPAAm) se utiliza para platos de cultivo de tejidos abrigo. Luego, las células específicas de tejidos se cultivan en la superficie de las placas recubiertas / superficies micropatrón para formar láminas de células con fuertes adherencias laterales. En tercer lugar, se crea una matriz de base para el tejido mediante la combinación de matriz porosa con admisible que neovascularhe hidrogeles y células endoteliales. Finalmente, las láminas de células se levantan de los platos recubiertos PNIPAAm y se transfieren al elemento de base, por lo que la construcción completa.
Protocol
1. Creación de placas recubiertas con PNIPAAm
- Disolver el 2,6 g de PNIPAAm en 2 ml de una solución de hexano 60% de tolueno / 40%.
- Se calienta la mezcla a 60 ° C durante 10 min con agitación, hasta que se disuelva el PNIPAAm.
- Cortar el papel de filtro en un círculo de diámetro 60 mm y coloque el papel en el embudo Buchner.
- Se filtra la solución a través de un embudo Buchner en el vaso de vidrio previamente pesado (no utilice plásticos, como el hexano se derretirá plásticos).
- Colocar el vaso y su contenido en un vacío de campana (24 psi) O / N (16 horas). Nota: Hasta que el residuo se hace reaccionar con isopropílico se oxidará así que asegúrese de que no entre en contacto con el oxígeno.
- Pesar el vaso de precipitados para establecer el peso de la PNIPAAm.
- Añadir alcohol isopropílico a la PNIPAAm, la creación de un 50/50 w / w solución.
- Coloque 2 ml de la solución en la superficie de la placa de cultivo de tejidos, y el abrigo durante 5 minutos bajo luz UV.
- Lavar la placa con 2 ml de PBS caliente dos vecesantes de usar para el cultivo celular.
2. Creación de láminas de células
Nota: láminas de células de células primarias para el órgano diana pueden ser creados usando un número de diferentes métodos, o mediante el recubrimiento de superficies de cultivo de tejidos con el polímero termosensible tal como se describe aquí. Placas termo-sensible Pre-recubiertos también son ofrecidos por varios proveedores.
Nota: Este protocolo es para la cultura utilizando una placa de 35 mm. Brevemente, las células se incubaron primero a 37 ° C durante un mínimo de 24 horas a confluencia de establecer conexiones laterales entre las células adyacentes. Para separar las hojas de células, las placas se someten a temperaturas inferiores a 32 ° C. La lámina de células se transfiere a continuación a la fuerte matriz fibrosa de base que contiene un hidrogel permisiva neovascular con las células endoteliales vasculares.
- Aislar la población celular. Nota: Este método depende de los procedimientos de derivación individuales y el tipo de células. Rata mu lisa aórticacélulas SCLE (RASMC) se utilizan en este ejemplo. Estos son células musculares lisas primarias aisladas de la aorta abdominal de una rata.
- Lavar las células con 2 ml de PBS caliente.
- Añadir 3 ml de tripsina (u otra solución de escisión / disociar) a las células durante 5 min.
- Inhibir la tripsina mediante la adición de 3 ml de los medios de cultivo, o una solución de tampón fosfato (PBS) que contenía 10% suero bovino fetal (FBS).
- Recoger las células en un tubo cónico y contar una alícuota.
- Girar las células a 1.000 rpm (228 xg) durante 5 min.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en su medio de crecimiento (medio de cultivo SmGM2 más kit de bala se utiliza para RASMC).
- Coloque el soporte que contiene las células en un termo-sensible placa de 35 mm - PNIPAAm placa recubierta con una concentración que permitirá alcanzar el 100% de confluencia. Nota: Para RASMCs ese número se determinó que era de 100.000 células / cm 2. Sin embargo, debido a la pérdida de células durante el paso, 120% de que va se utiliza Lue.
- Coloque en una incubadora a 37 ° CO / N. Nota: Es importante mantener las células a 37 ° C para mantener la adhesión de células a la placa.
3 Preparación de Matrix Foundational
Nota: Varias matrices fibrosas 3D se pueden utilizar para la capa matriz fibrosa fuerte entre las láminas de células delicadas. Algunos ejemplos incluyen: espuma de gel, bioglass, materiales naturales acellularized 26 o nanospun materiales 27,28 La matriz de la vejiga urinaria porcino (UBM) utilizado en estos estudios fue proporcionado generosamente de nuestro colaborador, el Dr. Badylak 29.
- Antes de usar, determinar las características de la matriz, incluyendo la falta de contenido celular si se utiliza matriz descelulariza, 27,28 viabilidad de células específicas, y el espacio vacío. 22
- Cortar la matriz de pre-esterilizados en un tamaño y forma deseados. Nota: Aquí, una perforadora se utiliza para cortar un círculo de diámetro 4 mm.
Nota: Las células endoteliales se pueden obtener de una variedad de fuentes, incluyendo la diferenciación de las células madre o progenitoras. En este caso, se utilizan las HUVEC.
- Utilice cualquier hidrogel permisiva (fibrina, geles de colágeno), siempre y cuando el tiempo de reticulación es suficientemente corto como para permitir que las células permanecen viables. Nota: En este caso, un gel de ácido hialurónico (HA), basado reticulado se utiliza con un puente disulfuro.
- Preparar el hidrogel HA de acuerdo con el protocolo de empresa.
- Recoger las células endoteliales y se dispersan en una solución de una sola célula utilizando tripsina 1x. Nota: Accutase o tampón de disociación celular también podrían utilizarse para la dispersión de células individuales.
- Desactivar la enzima tripsina mediante el uso de una cantidad igual de inhibidor de tripsina de soja (si es importante que las células no entran en contacto con suero) o 10% de FBS en PBS, recogiendo la solución / células en un tubo cónico de 15 ml.
- Cporte de las células, y calcular el volumen necesario para las dimensiones del parche (previamente cuantificados). Nota: Para obtener un parche de 4 mm, se utilizan aquí de 2 millones de células endoteliales.
- Extraer 2 millones de células, y colocarlo en un nuevo tubo cónico de 15 ml.
- Haga girar al (228 xg) durante 5 min.
- Aspirar el sobrenadante, dejando las células como sedimento en un tubo cónico.
- Mezclar los materiales líquidos de HA y gelatina en una ración de 1: 1. A continuación, añadir 80% del volumen total en el tubo cónico que contiene el sedimento.
- Resuspender las células endoteliales en la 1: / mezcla de gelatina 1 HA
- Colocar las células en suspensión en la mezcla de HA / gelatina en la base de matriz fibrosa de la Etapa 2.
- Añadir un quinto (20 por ciento) del volumen total deseado de la reticulante
- Incubar durante 1 hora a 37 ° C.
5. Aislamiento de láminas de células
- Retire las placas tratadas con PNIPAAm 35 mm que contienen las células de la incubadora y el lugar en una campana de cultivo celular aRT.
- Aspirar rápidamente el medio de las células, y añadir 2 ml de 6% de gelatina normal que se ha calentado a 37 ° C.
- Mientras que la gelatina está todavía caliente, coloque la retícula de metal en la gelatina, sumergiéndolo debajo de la superficie de la gelatina normal (Película 1).
- Toda la placa sobre hielo durante 5 a 7 minutos, lo que permite que la gelatina se endurezca.
- Después de 7 min, utilizar una espátula para separar cuidadosamente los bordes de gelatina desde el lado de la placa, y luego usar fórceps para levantar la retícula de metal de la placa Nota: La gelatina 6%, y la lámina de células debe levantar con la red.
- Mueva la lámina de células a la placa y se coloca en la parte superior de la combinación de matriz de hidrogel de base fibroso, estableciendo cuidadosamente la red en la parte superior de la construcción. Nota: El lado apical de la lámina de células todavía estará en la posición superior.
- Añadir 2 ml de medio caliente (37 ° C).
- Incubar O / N permitiendo que la lámina de células para adherirse a la superficie del hidrogel.
- Retire tretícula de metal después de que la solución se calienta (aproximadamente 1 hora), o al día siguiente.
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Representative Results
El diagrama de flujo (Figura 1) muestra el método general de hacer que el parche de varias capas. Láminas de células se separan de la placa tratada PNIPAAm dejando caer la temperatura por debajo de 32 ° C. A continuación, la lámina de células se coloca en la parte superior del hidrogel reticulado que contiene las células endoteliales sembradas en la matriz fibrosa subyacente (Figura 1). Las placas termo-sensible pretratados también se pueden utilizar para crear las láminas de células. Superficies topológicas especiales se utilizan para específicamente patrón (es decir, alinear) las células 30.
La matriz fibrosa de base puede ser generada a partir decellularizing matriz de tejido nativo o electrospun. Aquí, la lámina de material fibroso se cortó a un diámetro de 4 mm para la base del parche (Figura 2A). La caracterización de este material es importante para determinar la cantidad de hidrogel que puede ser utilizado para llenar los espacios vacíos. La matriz utilizada aquí se ha Penúltastuto caracterizado y publicado. 22
Los hidrogeles que contienen células endoteliales se reticulan después de la aplicación de los componentes líquidos de hidrogel HA a la matriz fibrosa. Microscopía de fluorescencia / transmisión muestra células teñidas con calceína AM (Figura 2B) que han sido capturados en el hidrogel reticulado vivir.
El proceso de creación de la capa celular se forma la imagen (Figura 3), incluyendo la comparación entre nuestras propias placas recubiertas con PNIPAAm y placas pre-recubiertas comprados a un proveedor. RASMC se siembran en la superficie PNIPAAm tratada durante al menos 16 horas a 37 ° C. Este tiempo mínimo permite que las células establecen sus adherencias Boarder laterales con las células vecinas (Figura 3A). Nota: Las celdas deben estar en la confluencia de establecer estas fronteras laterales. Después de cultivar durante al menos 16 h, la placa de células se debe mover a TA durante la una caída por debajo de 32 ° C, y el uso de hielo fo 5-8 min acelera el proceso de enfriamiento (Figura 3B). La caída de temperatura cambia el ángulo de contacto conformacional del recubrimiento de material que permite la lámina de células que levantar el pie de la placa. Figura 3C muestra el levantamiento lámina de células de la placa.
Placas recubiertas en el laboratorio funcionaron bien, después de una optimización, para crear y mover las láminas de células. Figura 4D muestra una monocapa confluente de RASMC antes de la transferencia. Cuando se permitió que las células se levante, las hojas tienden a doblar y pegarse a sí misma (Figura 3E). De hecho, la manipulación de las láminas de células en la creación propia PNIPAAm o los adquiridos fue difícil y, a menudo como resultado el desgarro de las hojas (Figura 3F). Por lo tanto, una solución para la transferencia de las hojas fue desarrollado. Una vez que las células se retiran de la incubadora y comienzan a fresco, se usó 6% de gelatina para cubrir las células con un metal adicional lattice incrustado dentro del gel (Figura 3G). Como la placa se enfrió, las células levantadas, y la gelatina se endurece. El uso de pinzas, la red celular y la hoja gelatin- se puede quitar juntos de la placa de cultivo; todo al mismo tiempo (Figura 3H). A continuación, estos tres componentes se colocan en la parte superior de la construcción basada (Figura 3I). Aquí, la lámina de células (rosa) es mucho mayor que la matriz de base subyacente (grueso matriz blanca debajo de la lámina celular de color rosa). La capa celular se puede fácilmente recortar para ajustarla.
El parche final de células (Figura 4) se crea por capas de la lámina de células en el complejo preformado de la base del parche de hidrogel y permisiva. De abajo hacia arriba, el parche consiste en una matriz fibrosa sembradas con hidrogel de ácido hialurónico que contiene las células endoteliales, y luego la capa celular es en capas en la parte superior de esta matriz. Los primeros intentos para manipular las láminas de células sin el uso de la gelatina / celosía Apparatus resultó en láminas de células muy pequeñas que a menudo pliegan y se rasgan (Figura 4A-D se ve desde arriba). Figura 4A representa un parche en el diseño de la imagen temprana compuesto que combina el rojo MitoTracker teñido RASMC (Figura 4B), calceína AM verdes HUVECs fluorescentes (Figura 4C), y la imagen de luz transmitida (Figura 4D). Closer 10x imágenes se suministran para la capa celular y HA / hidrogel sin matriz (Figura 4E-H). Figura 4E es el compuesto de la roja mitotraker (Figura 4F), la calceína AM verde HUVEC (Figura 4G) y la luz transmitida ( Figura 4H). La vista desde abajo (matriz de base, HA / HUVEC), y las imágenes capa celular de cada componente es espectáculo en las figuras 4E-L. Las imágenes compuestas es la figura 4E, con las distintas partes representadas en la figura 4J-L, Figura 4J shOWS la transmisión de la imagen (Figura 4L) lámina de células (rojo), las células endoteliales (verde) son en la Figura 4K, y la imagen compuesta (Figura 4M) muestra el parche con una celda de hoja uniforme que cubre toda el área de la matriz sin ningún tipo de plegado o desgarro. Figuras 4M-P son también de la parte inferior mirando hacia arriba en la matriz. Figura 4N es la lámina de células, que contiene rojo neutro. Una vez más, tiras rojas gruesas aparecen alrededor de la matriz debido a que la hoja se pliega en estas áreas directamente adyacentes al borde de la matriz. Luz de transmisión de imágenes (Figura 4O) muestra la morfología de las células, y la estructura de la matriz. Por último (Figura 4P), la matriz tiene una calidad especial de fluorescencia en la misma longitud de onda que Dapi. Por lo tanto, la excitación ultravioleta de la matriz se utiliza para ver claramente separado de la lámina de células (rojo brillante). Los bordes del parche pueden ser ajustados paraeliminar cualquier bordes de la hoja que están colgando sobre los bordes de la matriz.
Figura 1. Gráfico de Flujo de tejido Asamblea. Cell-hojas son creados por la siembra de células sobre las placas recubiertas con PNIPAAm termosensibles, y permitiendo suficiente tiempo para que las células llegar a la confluencia y establecer conexiones laterales a las células vecinas. La lámina de células se libera mediante la reducción de la temperatura (disco amarillo). Al mismo tiempo, las células endoteliales están incrustados en una neovascular permisiva hidrogel HA, inyectado en los huecos de espacio de la matriz fibrosa base más fuerte, y químicamente reticulado (disco blanco). La lámina de células (disco amarillo) es entonces en capas con la combinación matriz endotelial (blanco), según sea necesario. Por favor haga clic aquí paraver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Imágenes de Matrix Base y endotelial encapsulación. (A) La matriz fibrosa base más fuerte se dio un puñetazo en una forma redonda. Aquí un 4 mm de diámetro se utiliza basado en el modelo animal in vivo. (B) HUVEC teñidas con MitoTracker verde (calceína AM) suspendido en hidrogeles HA en la superficie de la matriz de base (10 veces). Por favor, haga clic aquí para ver una mayor versión de esta figura.
Figura 3 Creación de láminas de células. (A) RASMC cultured en 35 mm-platos PNIPAAm tratada durante 16 horas (10X). (B) RASMC levantada después de la colocación de la placa en hielo durante 5-7 min. (C) Imagen de la borde de una lámina de células de la liberación comercialmente adquirida-la placa de cultivo celular termosensible (10X). (DF) imágenes muestran resultados similares para la generación de láminas de células de los platos en-casa creada PNIPAAm recubiertas. (D) confluentes RASMC cultiva en 35 mm placas de cultivo de tejido estándar (4x). (E ) Después de enfriar, las láminas de células contratados y dobladas, ya que desprenden (4X). (F) Debido a la fragilidad de la hoja de una sola célula, las láminas de células se dañan a menudo en el arranque o otras manipulaciones (4X). (G) En Para mitigar perforaciones en la lámina de células, se usó una pantalla metálica como soporte físico para ayudar a la transferencia de las láminas de células. RASMC se tiñeron con rojo neutro, cubierto con 6% de gelatina y un soporte de pantalla de metal poroso, unnd dejan endurecer. (H) Con el apoyo de la pantalla, láminas de células se transfieren con un daño mínimo (4X). (I) El mayor capa de lámina de células RASMC (color rosa) y luego se colocó en la parte superior de la combinación del parche de hidrogel fibroso base más fuerte (flecha). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Imágenes de Capas celular parche. Las células fueron cultivadas sobre una superficie recubierta pNIPPAM y luego se trasladó como una hoja a la superficie de la matriz fibrosa. Los primeros ensayos que no fueron transferidos con la red de gelatina / de metal resultaron en pequeños parches andrajosos (AD). (A) Imagen compuesta de (BD),(B) RASMCs en dos láminas teñidas con (C) HUVEC teñidas con verde rojo Mitotracker, y, y (D) en luz transmitida. (E) Imagen compuesta de una lámina de células se combina con la combinación de matriz de hidrogel fibroso base más fuerte que contiene Calceing AM manchada HUVECs (verde), y (F) Mitotracker Red RASMCs. (G) HUVECs verde fluorescente suspendido en un hidrogel. (H) de transmisión de imágenes de la combinación de matriz de hidrogel fibroso base más fuerte. (I) Compuesto de imagen mirando desde el parte inferior del parche hacia arriba a través de la matriz fibrosa base más fuerte (no manchado), que contiene HA HUVECs (verde), y capa celular de RASMCs (rojo), respectivamente. (J) Red hoja RASMCs fluorescentes, como se ve a través de la base de la Matriz fibrosa combinación de hidrogel. (K) HUVECs fluorescentes verdes. (L) imagen Transmisión de la construcción parche.(N) Las células de la cubierta de la hoja (M) Cuadro compuesto de hojas de células (rojo) sobre la base de la combinación de matriz de hidrogel fibroso (autofluorescente-azul). La base fibrosa combinación muestran una mayor fluorescencia matriz de hidrogel en los bordes se debe a agrupamiento de las células. (O) la transmisión de imágenes de la construcción. (P) matriz de base fibrosa natural se autofluorescentes en el DAPI (azul de longitud de onda). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película 1 . El proceso de transferencia de las capas de células se pone de relieve en la película complementaria presentada con el documento. Los espectáculos de cine, en el proceso de paso a paso, la eliminación de las células de la incubadora; sustitución de los medios de comunicación con el 6% de gelatina, la inserción de jue pantalla de metal, la refrigeración de las células en hielo, la transferencia de las células de la placa de PNIPAAm revestido a otro plato, una imagen de las células durante la transferencia, y finalmente la eliminación de la pantalla de la hoja.
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Discussion
Los pasos críticos en el protocolo incluyen: el revestimiento de las superficies de la placa con el polímero termosensible y la manipulación de las láminas de células después de enfriar las placas. Debido a que diferentes células exhiben diferentes propiedades físicas, como la adhesividad, el tiempo de elevación debe ser optimizada para cada tipo celular diferente. El segundo, y más desafiante significativamente componente de este protocolo, se centra en la manipulación de la capa celular, un aspecto crítico de los métodos para el ensamblaje de tejidos. La capa de células individuales en la capa celular es muy frágil y se puede romper fácilmente si manipulados con pinzas. Por otra parte, cuando las láminas de células no se mantienen en su lugar, tienden a contraerse y se pueden plegar fácilmente. La transferencia de la hoja de células propuesto la utilización de una pantalla de apoyo ayuda a la manipulación de la lámina de células frágil.
La metodología de diseño presentado en este manuscrito proporciona un enfoque bastante bajo costo para la creación de una lámina de células para una variedad de apli ingeniería de tejidoscationes. Por otra parte, la creación de placas recubiertas PNIPAAm dentro de un laboratorio de la universidad puede ser estandarizada con este método y modificaciones en el protocolo se pueden hacer para adaptarse a múltiples tipos de células, y superficies. El uso de láminas de células, en lugar de células individuales no organizados, ayuda para el montaje de tejido, y también puede aumentar la probabilidad de supervivencia y la integración de los tejidos implantados. Sin embargo, tendrá que ser optimizada para cada tipo de tejido vivo en el método de entrega (no se menciona en este protocolo) de estas construcciones. Las aplicaciones futuras incluyen exploraciones y metodologías óptimas para la generación de tejidos para los sistemas de órganos específicos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Calcein-AM | Invitrogen | C3099 | Cell tracker / live dye |
| Lysotracker Red | Invitrogen | L7528 | Cell tracker |
| Neutral Red | Sigma | N7005 | Visible Cell dye |
| pNIPAAM | Sigma Aldrich | 412780250 | Poly(N-isopropylacrylamide) |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511-1L | |
| Hexane | Sigma Aldrich | 296090-1L | |
| RAOSMC | Lonza | R-ASM-580 | Rat Aortic Smooth Muscle Cells |
| SmGM2 | Lonza | CC-4149 | Smooth Muscle Media |
| HUVEC | Invitrogen | C-003-5C | Human Venous Endothelial Cells |
| HyStem | Glycosan/Biotime | ||
| Isopropyl alcohol | VWR International | BDH1133-4LP | |
| Trypsin | Corning Cellgro | 25-053-C1 | |
| PBS | Gibco | 14287-072 | |
| FBS | Gibco | 16140-071 | |
| Specific Equipment | |||
| Filter paper | Ahlstrom | 6310-0900 | |
| Buchner Funnel | Sigma Aldrich | Z247308 | |
| UpCell Plates | Nunc | 2014-11 | |
| UV light | Jelight Company | UVO Cleaner Model No.42 | |
References
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