Summary
Deze procedure laat zien in vivo nabij infrarood fluorescentie beeldvorming van collageen remodeling activiteiten in muizen als ex vivo kleuring van collageen in het weefsel secties met behulp van gekooid collageen mimetische peptiden die kunnen worden foto-getriggerd om te hybridiseren met gedenatureerde collageen strengen.
Abstract
Collageen is een belangrijke structurele component van de extracellulaire matrix die de vorming en instandhouding weefsel ondersteunt. Hoewel collageen verbouwen is een integraal onderdeel van de normale vernieuwing van weefsel, wordt overmatige hoeveelheid remodeling activiteit betrokken zijn bij tumoren, artritis en vele andere pathologische aandoeningen. Tijdens collageen remodelleren, wordt de drievoudige helixstructuur van collageen moleculen verstoord door proteasen in de extracellulaire omgeving. Daarnaast worden collagenen in veel histologische weefselmonsters gedeeltelijk gedenatureerd door de fixatie en conservatieproces. Daarom kunnen deze gedenatureerde collageen strengen zo effectief doelen voor biologische beeldvorming dienen. We eerder ontwikkelde een gekooide collageen mimetisch peptide (CMP) die foto-geactiveerd te hybridiseren met gedenatureerd collageen strengen door het vormen drievoudige helixstructuur, die uniek is voor collageen zijn. De algemene doelstellingen van deze procedure zijn i) op de foto gedenatureerd collageen strengen resulting van normaal remodeling activiteiten in vivo, en ii) aan collageen in ex vivo weefsel secties te visualiseren met behulp van de foto-geactiveerd gekooide CMP's. Om effectief hybridisatie en succesvol in vivo en ex vivo beeldvorming te bereiken, fluorescent gelabelde Caged CMP's zijn ofwel-foto geactiveerd onmiddellijk voor intraveneuze injectie, of worden direct geactiveerd op weefsel secties. Normaal skelet collageen omvorming in naakt muizen en collageen in vooraf vastgestelde muis cornea weefselsecties worden afgebeeld in deze procedure. De beeldvormende methode van de CMP-collageen hybridisatie technologie hier gepresenteerd kan leiden tot beter begrip van de weefselremodellering proces en zodat ontwikkeling van nieuwe diagnostica voor ziekten geassocieerd met hoge collageen remodelleren activiteit.
Introduction
Collageen, het meest voorkomende eiwit in zoogdier, speelt een cruciale rol in de ontwikkeling en regeneratie van weefsel ondersteunende proliferatie en differentiatie van cellen. Terwijl vezelig collageen (bv. type I, II), in bindweefsels geven mechanische sterkte aan de weefsels, de netwerk-achtige collageen (type IV) vormen basis steiger van het basaal membraan waar de cellen hechten en vormen georganiseerd weefsels. Collageen verbouwing omvat zowel collageen afbraak (door proteasen) en synthese (gepromoot door groeifactoren). Hoewel collageen remodelleren, bijvoorbeeld in bot, is onderdeel van het normale weefsel vernieuwingsproces overmaat remodeling activiteit, of het optreden van abnormale plaatsen, gewoonlijk aangegeven wondgenezing reactie op een letsel of chronische pathologische aandoeningen zoals kanker, osteoporose, artritis, en fibrose 1-4. De mogelijkheid om direct het imago van collageen ondergaat verbouwing in vivo zou kunnen leiden tot inzicht in de voortgangion van deze ziekten, evenals nieuwe diagnostica en therapeutica. Bijvoorbeeld, live beeldvorming informaties ernst en de plaats van de ziekten en kan ook worden gebruikt om de doeltreffendheid van nieuwe therapeutische middelen te beoordelen. Multifoton laser scanning microscopie en tweede harmonische generatie zijn toegepast op de foto collagenen voor het bewaken van de extracellulaire matrix remodeling in tumor in levende muizen 5. Deze techniek vereist dieren transparante dorsale huidplooi kamers te monteren, hetgeen een invasieve procedure. Rechtstreekse en niet-invasieve beeldvorming van collageen remodeling zullen profiteren van een sonde die specifiek gericht collageen ondergaat verbouwing. Deze probe is moeilijk te bereiden, aangezien zij de verbouwing collagenen onderscheiden van de intacte en volwassen collagenen, die overvloedig in normale weefsels 6 zijn.
Collageen bestaat uit uiterst zeldzame eiwitstructuur genoemd drievoudige helix, diegesplitst door proteasen zoals matrix metalloproteïnasen (MMP) tijdens collageen remodeling. De gesplitste fragmenten collageen verliezen hun drievoudige helixstructuur en wordt opengevouwen strengen (gelatine), die verder worden verteerd door niet-specifieke proteasen 1. Recent werd ontdekt dat het collageen mimetisch peptide (CMP) die de neiging tot vouwen in drievoudige helixstructuur heeft specifiek kunnen richten collageenvezels die zijn losgemaakt van de triple helix toestand door een warmte denaturatie of door enzymatische afbraak 1,7. De binding wordt voornamelijk gedreven door triple-helix hybridisatie tussen monomere CMP's en de gedenatureerde collageen strengen. Omdat CMPs zichzelf assembleren tot homotrimeer triple helices bij kamertemperatuur met weinig drijfkracht voor collageen hybridisatie een gekooide CMP [(GPO) 4 NB GPO (GPO) 4, aangeduid als NB (GPO) 9, O: hydroxyproline], ontwikkeld , die bevat een foto-splitsbare nitrobenzylgroep (NB) gekoppeld aan de centrale glycine van het peptide. De NB kooi groep sterisch voorkomt dat de CMP van vouwen in triple helix, maar toch, het verwijderen van de kooi groep door UV-straling activeert onmiddellijk de triple helix vouwen en collageen hybridisatie 1. Wanneer monomeer CMPs gelabeld met nabij-infrarood (NIR) fluoforen systemisch worden geleverd om het model muizen, kunnen ze specifiek te richten en laat in vivo beeldvorming van gedenatureerd collageen in weefsels ondergaan normaal (bijvoorbeeld in bot en kraakbeen) en pathologische (bv. in tumoren) remodeling 1 .
Fluorescerend gemerkte CMP kan ook worden gebruikt voor het afbeelden van collageen in histologische weefselcoupes. In histologische studie worden geoogst weefsels vaak bewaard door fixatie aan de cellulaire componenten en algehele weefselmorfologie tegen aantasting te houden. De bevestiging procedures, die warmte, en behandeling met organische oplosmiddelen en chemische cross-linkin omvatteng reagentia (bijv. paraformaldehyde), denatureren de drievoudige helixstructuur van collageen 8. Deze denaturatie genereert sites voor CMP hybridisatie. Het is aangetoond dat fluorescerend gemerkte CMP specifiek kan binden aan collageen in vaste weefselsecties (bijv. huid, hoornvlies en bot) nog effectiever dan een anti-collageen-antilichaam, welke gemakkelijke identificatie van pathologische aandoeningen in fibrotische lever weefsels 9 toegestaan. De CMP richt gedenatureerde collageen strengen aminozuur sequentie van drievoudige helix motieven, die gemeenschappelijk is voor alle soorten collageen. Daarom CMP kan worden beschouwd als een breed-spectrum collageen kleuring middel. Hier presenteren wij gedetailleerde experimentele procedures voor i) beeldvorming gedenatureerd collageen strengen in vivo en ii) het visualiseren van collageen in ex vivo weefsel secties met behulp van fluorescent gelabelde gekooide CMP's. Een NIR-tag, IR680, werd geconjugeerd aan de gekooide CMP voor live-imaging, while carboxyfluoresceïne (CF) werd gebruikt in weefselkleuring werk voor de verenigbaarheid ervan met standaard fluorescentie microscopen. Dit protocol richt zich op de beeldvorming toepassing van CMP's als gerelateerd aan collageen remodeling. Methoden voor CMP synthese kan worden gevonden in de vorige verslagen 1,7,9-15. In deze video verslag hebben beeldvorming skeletale weefsels in normale muizen en weefselsecties van muis hoornvlies gekozen demonstratie doeleinden, maar de hier gepresenteerde werkwijzen gemakkelijk kan worden toegepast op vele pathologieën en biologische modellen waarbij collageen remodeling (bijv. tumoren, wondgenezing), zoals alsmede op bijna elk voorafgegaan weefselmonster dat collageen bevat.
Protocol
Alle dierlijke studies werden uitgevoerd in overeenstemming met de voorschriften van de Johns Hopkins Animal Care en gebruik Comite.
1. Near Infrared (NIR) fluorescentie beeldvorming van skeletal collageen Remodeling In vivo
- Foto-activering van gekooide CMP en staartaderinjectie
- Bereid 110 ul van gekooide CMP oplossing voor elke muis (20-30 g muis gewicht): 100 ul van de oplossing voor het doseren, met een extra 10 pi kussen voor het mogelijke verlies tijdens de overdracht en de injectie. Meng 11 pl IR680-Ahx-NB (GPO) 9 voorraadoplossing (400 uM) met 11 pl van 100 uM cysteïne in steriele PBS-oplossing, breng dan het totale volume 110 ui met 1 x PBS-buffer. De uiteindelijke peptide oplossing bevat 4 nmol IR680-Ahx-NB (GPO) 9 en 1 nmol van cysteïne in 100 ul 1x PBS oplossing.
- Langzaam withdraw de peptide oplossing in een 0,5 ml insuline spuit met een transparante barrel en een kleine meter (28-30 G) naald, en verwijder voorzichtig de luchtbellen. Zet de UV-lamp om de lamp op te warmen voor 2-5 minuten.
- Plaats de peptide-bevattende spuit direct onder de UV-lamp (365 nm,> 25 mW / cm 2) gedurende 5 min van de foto-activering mogelijk te maken.
- Ondertussen, de positie van de muis in een restrainer onder een verwarmd lamp, het etiket van de muis met een permanent marker op de staart of andere identificatiemethoden zoals oormerk of teen tattoo, en desinfecteer de staart met 70% alcohol.
- Onmiddellijk na de UV activatie injecteer 100 ul UV geactiveerde IR680-Ahx-NB (GPO) 9 oplossing in de staartader, bij voorkeur in het achterste gedeelte van de staart. Plaats de muis naar de kooi na injectie.
- NIR fluorescentie beeldvorming van collageen remodeling activiteit
- Reeksde verwarmingsplaat van de beeldvorming bed van de impuls imager tot 37 ° C met behulp van Pearl Impulse 2.0 software.
- Doe de naakt of geschoren muis in het anesthesie inductie kamer met 2% isofluraan in zuurstof. Controleer de diepte van de anesthesie vliegtuig door een gebrek aan muisbewegingen tijdens de behandeling en door monitoring van de frequentie van de ademhaling (~ 1/sec).
- Nadat de muis is verdoofd, opent de Pearl imager lade en plaats het dier op de beeldvorming bed. Verwijder snel de neuskegel plug en schuif snuit van de muis in de neuskegel van de muis onder verdoving tijdens de beeldvormende proces te houden (met 2% isofluraan in zuurstof bij 2 L / min geleverd via de neuskegel). Zodra de muis is op zijn plaats, sluit de lade.
- Wanneer het instrument geeft "klaar" op de afbeelding software paneel, klik op de "700-kanaal", "wit licht" en "85 micron" dozen, gevolgd door het "verwerven afbeelding" knop. NIR (excitatie 685 nm, emissie 720 nm) eend wit licht foto zal dan worden genomen met behulp van de automatische scherpstelling en belichting.
- Wanneer de opname is voltooid, opent u de lade, zet de muis, en het verwerven van beelden vanuit een andere hoek. De muis kan worden geplaatst met de voorkant (ventrale), rug (dorsale) of zijden tegenover de camera. Smalle stroken tape kan worden gebruikt als beperkingen om zijn ledematen te rekken om het beste uitzicht van de regio van belang (bijvoorbeeld ribbenkast, enkels en polsen) te krijgen.
- Een goede tijd om skeletopname van IR680-CMP observeren is tussen 24-96 uur na injectie (HPI), op basis van de dosering (~ 4 nmol / muis). Om hoge resolutie beelden te verwerven, offeren de muis door cervicale dislocatie terwijl onder diepe narcose na 72 HPI, verwijder de huid (en haar) met behulp van chirurgische pincet en schaar, en het beeld dat door NIR fluorescentie zoals hierboven beschreven.
- Analyseer de verworven NIR fluorescentie beelden.
2. Visualisatie van Collagenen in Ex vivo0; Weefselcoupes
- Materiaal voorbereiding
- Bereid 1 ml 10% (w / v) BSA-oplossing in gedeïoniseerd water. Ontdooi 1 ml geit serum in een waterbad bij kamertemperatuur. Snijd een paar stukken van Parafilm in de grootte van ongeveer 2 cm x 5 cm.
- Bereid 10 ml blokkerende buffer door het mengen van 500 ui geit serum, 1 ml van 10x PBS en 8,5 ml gedeïoniseerd water. Bereid 5 ml CMP verdunningsbuffer door verdunning van 50 ui 10% (w / v) BSA met 4,45 ml gedeïoniseerd water en 500 pi 10x PBS.
- Verdunnen voorraad oplossingen van-carboxyfluoresceïne gelabelde gekooide CMP, CF NB (GPO) 9 (480 uM), tot 5 pm met behulp van de CMP verdunning buffer. Optimale CMP concentratie varieert 2,5-30 pM, afhankelijk van het soort weefsel en de aard van weefselmonsters. Een volume van 100 ul aanbevolen voor het kleuren van een weefselsectie dia. Bewaar de geformuleerde CMP solutionen in het donker.
- Laat de muis hoornvlies weefsel dia's op kamertemperatuur komen. Incubeer de glaasjes in 1x PBS buffer gedurende 5 minuten. De muis hoornvlies weefsels gebruikt in deze demonstratie zijn voorafgegaan met 4% paraformaldehyde in PBS-oplossing gedurende 1 uur, gecryopreserveerde in Tissue-Tek oktober medium, cryosectioned tot 8 micrometer dikte, en gemonteerd op gebracht glasplaatjes.
- Weefselkleuring en imaging
- Plaats de dia's in een vochtige kamer. Aan elke dia toepassen 0,5 ml blokkerende oplossing en incubeer de dia's voor 30 min bij kamertemperatuur geroerd. Verwijder de blokkering oplossing door te deppen de dia's op een papieren handdoek.
- Solliciteer ongeveer 100 ul van CF NB (GPO) 9 oplossingen voor de coupes van elke dia te dekken. Incubeer de glaasjes gedurende 2 minuten om de CMP oplossing de weefsels doordringen.
- Schakel de UV lamp. Wanneer de lamp wordt opgewarmd, bloot de CMP-bedekte weefsel seegen het UV-licht gedurende 6 min (365 nm, ~ 8 mW / cm 2) gekooide CMP ontschermen. Na blootstelling aan UV, bedek het weefsel secties van elk glaasje met een stukje Parafilm om uitdroging te voorkomen. Zet de objectglaasjes in de vochtige kamer en incubeer ze bij 4 ° C gedurende 2 uur.
- Maak een 1:3000 verdunning van DAPI oplossing in 1x PBS. Na CMP vlekken, verwijder voorzichtig de Parafilm met een tang, en dep de dia's op een papieren handdoek om overtollig CMP oplossing te verwijderen. Breng ongeveer 100 pl verdunde DAPI oplossingen voor elk weefsel dia en incubeer gedurende 1 min bij kamertemperatuur.
- Na kleuring Dompel de objectglaasjes in 1x PBS buffer in een kleuring pot voor 5 minuten. Herhaal dit 3x in vers 1x PBS te wassen ongebonden verkleurende stoffen.
- Voeg een druppel montage medium op de sectie weefsel en bedek het met een glazen afdekplaat slip terwijl het vermijden van luchtbellen. Plaats de dia's in een diavoorstelling lade karton om hen te beschermen tegen licht.
- Afbeelding het collageen strengen (FITC kanaal) en celkernen (DAPI kanaal) in het weefsel dia met behulp van een fluorescentie microscoop.
Representative Results
Figuur 1 toont een typisch resultaat van hoe de foto-geactiveerd IR680-Ahx-(GPO) 9 verdeelt in een gezonde vrouwelijke SKH1 naakt muizen na 24-96 uur na injectie. Het toont duidelijk CMP ophoping in het skelet na 24 HPI, en op dat moment de meeste ongebonden peptiden zijn grotendeels opgeruimd. Werkwijze CMP hybridiseren met de verbouwing collageenvezels lijkt relatief langzaam, vooral in tegenstelling tot andere peptide imaging probes (bijv. RGD 16). Dit is waarschijnlijk vanwege de langzame vouwen snelheid van de collageen drievoudige helix 17,18. Echter, wanneer gehybridiseerd, de CMP strengen sterk gebonden aan de collagene weefsels, gering signaalreductie gemeten na 24 hpi (figuur 1). Op 96 HPI, het NIR fluorescentie beeld van de muis na verwijdering huid toont duidelijk het skelet opname van IR680-Ahx-(GPO) 9 in de wervelkolom en ribben, alsook binnen de knieën, enkels,polsen, en lagere kaken (Figuur 2A).
In ex vivo weefselkleuring, foto-triggered fluorescent gelabelde gekooide CMPs specifiek hybridiseren aan gedenatureerd collageen strengen in weefsel secties. In figuur 3, CMP kleuring toont duidelijk de fijne parallelle collageen fibrillen in de corneale stroma, die het gebruik als collageen specifieke kleuring middel aantoont.
Figuur 1. Serial NIR fluorescentie beelden van een naakt muis intraveneus toegediend met foto-decaged IR680-Ahx-(GPO) 9 die skeletopname over vier dagen. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. NIR fluorescentie beelden van muizen toegediend met foto-decaged IR680-Ahx-(GPO) 9 (A), gekooide IR680-Ahx-NB (GPO) 9 zonder UV blootstelling (B), voorgevouwen triple-helix [IR680-Ahx-(GPO ) 9] 3 (C), of-warmte gedissocieerd enkelstrengs IR680-Ahx-(GPO) 9 (D) op 96 hpi na verwijdering huid. Skeletal targeting door de CMP kan alleen worden waargenomen in A en D. NIR fluorescentie signalen worden weergegeven in regenboog schaal. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 3. Fluorescentie microfoto van een muis corneal weefselcoupe voorafgegaan in paraformaldehyde, en gekleurd met DAPI en foto-triggered CF (GPO) 9 gebruikend Protocol nr. 2, het weergeven van dichte collagene stroma (gekleurd door CMP, in het groen) als cellulaire epitheel en endotheel (gekleurd door DAPI, in blauw ) (schaal bar: 100 pm).
Discussion
Zoals in dit protocol, de levering van CMP is eenvoudig omdat de UV-activering van gekooide CMP is het enige extra stap het gemeenschappelijk staartader injectie protocollen 19. De sleutel is om de peptide probes injecteren een uncaged en metastabiele enkelstrengs toestand. De kooi groep voorkomt CMP van zelfassemblage en binding aan collageen (figuur 2B) totdat het wordt verwijderd door UV licht waarna de CMP begint te vouwen in drievoudige helix. De injectie formulering bevat cysteïne, die snel kan reageren met de gekliefde kooi groep tijdens UV bestraling toxiciteit minimaliseren. Tal van muizen met verschillende stammen (bijv. SKH-1 en DR-1) zijn getest met behulp van deze formulering, en we hadden geen gedrags-of andere gezondheidsproblemen gebreken in deze muizen te detecteren tot zes maanden. Als de injectie niet onmiddellijk volgen na blootstelling aan UV, zal de CMP's vouwen in homotrimeer triple helices, die geen hybridisatie capaciteit. Figuur 2C toont een extreem geval waar voorafgaand aan de injectie de CMP's werden volledig opnieuw samengesteld in triple helices door lange vertragingstijd (> 2 dagen). Om dit probleem te omzeilen, moet CMP oplossing bereid relatief lage concentratie (bijv. ~ 40 uM), en geïnjecteerd in de muizen onmiddellijk na UV-decaging. Vanwege de langzame drievoudige helix vouwen snelheid van het CMP in verdunde toestand (halfwaardetijd hervouwing:> 50 min) en de korte blootstelling aan UV en injectietijd (5 ~ 7 min totaal) meeste CMP in de bloedbaan in enkelwandige strengvorm wanneer dit protocol wordt gevolgd. Na injectie CMP verwacht als enkelvoudige strengen te kunnen behouden, de concentratie verminderd met een factor 20 in de bloedplas, waardoor drastische vermindering van het monteren tarief 18. Als injectie wordt uitgesteld (bijvoorbeeld als gevolg van dier handling) en homotrimeer refolding wordt vermoed, kan het gedeeltelijk geassembleerd peptiden worden gereactiveerd door verhitting boven 7076, C om de CMP's dissociëren om single-strengen, gevolgd door een snelle afkoeling en injectie. Hoewel minder handig, zoals warmte-gedissocieerde CMP's tonen ook de verwachte resultaten van in vivo targeting (figuur 2D).
In deze demonstratie werden naakt muizen gebruikt voor NIR fluorescentie beeldvorming omdat maximaal 50% van de NIR signaal kan worden geblokkeerd door haar. Bij het werken met haired muismodellen (vooral degenen met zwarte haren), raden wij het scheren van de muis in de regio van belang voorafgaand aan beeldvorming met behulp van een elektrisch scheerapparaat of haar remover. In figuur 1 zijn er vals positieve signalen van buikstreek het dier, die wordt veroorzaakt door auto-fluorescentie van chlorofyl in de dierlijke voeding. Dergelijke achtergrondsignalen kan aanzienlijk worden verlaagd door het schakelen van de muis gezuiverde diëten ongeveer 4 dagen vóór de beeldvorming. Zoals gezien in figuren 1 en 2A, er sterke CMP uitlaten in de staart rotatiee. Daarom, om artefacten als gevolg van imperfecte staartader injecties te voorkomen, raden we injecteren op het achterste deel van de staart, zodat de injectieplaats niet wordt gevangen in het imago van de fluorescentie.
De gelabelde CMP maakt targeting en beeldvorming van specifieke locaties van collageen remodeling in vivo die moeilijk op te sporen met behulp van andere methoden. Bijvoorbeeld, de ELISA-gebaseerde bloed en urine tests zijn gevoelig voor gesplitste collageen telopeptide fragmenten, maar de werkwijze kan de bron van het collageen omzetting niet lokaliseren, omdat het doelen oplosbare antigenen. De belangrijkste beperkingen van de in vivo beeldvormende techniek met behulp van NIR gelabeld CMP's zijn diepte-penetratie demping en blussen door proximale gepoolde rode bloedcellen hemoglobine is een endogene uitdover van 680/710 nm NIR kleurstoffen. Toekomstige toepassingen van CMP in vivo beeldvorming onder SPECT of PET beeldvorming met CMP's gelabeld met directe gammastralende radionucliden of met positron emitters, voor diagnose van ziektetoestanden waarbij collageen remodeling (bijv. osteoporose, artritis, atherosclerose en fibrose). Deze radioactief gemerkte CMP analogen zal elimineren de beperkingen van signaalverlies als gevolg van weefsel diepte en aanwezigheid van gepoolde rode bloedcellen, en de kwantitatieve metingen van zieke weefsels mogelijk te maken. Daarnaast heeft de relatief laat beeldvorming (bijv. 48-96 hpi) als gevolg van de trage binding en klaring van CMP zou het moeilijk maken om snelle veranderingen in collageen remodeling volgen. Deze beperking kan worden opgeheven door een verdere engineering van de bindingskinetiek en affiniteit van CMP beeldvorming agenten. Sinds CMP bindt aan gedenatureerde collageen die weinig structuur, de CMP-gebaseerde collageen beeldvorming is complementair aan tweede harmonische generatie microscopie die kan alleen afbeelding collageenvezels 5.
Wanneer kleuren van het weefsel secties met fluorescent gelabelde CMP's, vonden we het nuttig zijn om het broedenmonsters in het UV geactiveerde peptide oplossingen bij 4 ° C, omdat de drievoudige helix hybridisatie vergemakkelijkt bij lagere temperatuur 1,20. Ook bleek dat het onderdompelen van de dia's in verse PBS buffer in een kleuring pot is de meest effectieve manier om af te wassen ongebonden CMP's, die veel beter dan alleen maar pipetteren wasbuffers over de monsters werkt. De CMP-collageen strengs hybridisatie is zeer specifiek en robuust en daarom de eenvoudige kleuringsprotocol in deze video kan gemakkelijk worden aangepast voor costaining extra biomarkers en bepaalt afgebroken collageen in gefixeerde weefselsecties. Dit is een effectieve en gemakkelijk alternatief voor het gebruik van anti-collageen antilichamen voor het detecteren vezelachtige collagenen in diverse histologische monsters.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs danken Gilbert Groen voor technische bijstand. Dit werk werd ondersteund door subsidies van NIAMS / NIH (R01-AR060484) en DOD (W81XWH-12-1-0555) bekroond tot SMR, en van NIH (U24 CA92871 en U54 CA151838) toegekend aan MGP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IRdye 680RD Maleimide (IR680) | LI-COR | 929-71050 | Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere1. |
| 5(6)-Carboxyfluorescein | Sigma | 21877-5G-F | Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere12. |
| Cysteine | Advanced Chemtech | YC2200 | |
| Isoflurane | Butler Veterinary Supply | 4/4/5260 | |
| Goat Serum | Sigma | G9023-10ML | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma | A9647 | |
| DAPI | Roche Applied Science | 10236276001 | |
| Fluoroshield mounting medium | Sigma | F6182-20ML | |
| Syringes | BD | 329461 | |
| UV lamp | McMaster-Carr | 1447T17 | |
| Pearl impulse imager | LI-COR | 9400 | |
| Surgical forceps and scissors | |||
| EasyDip slide staining system | Light Labs | M900-12B | |
| 20-place cardboard microscope slide tray | Light Labs | ||
| Cover glasses | Fisher | 12-545-c | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE2000-E |
References
- Li, Y., et al. Targeting collagen strands by photo-triggered triple-helix hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14767-14772 (2012).
- Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nat. Med. 18, 1028-1040 (2012).
- Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment. Cell. 141, 52-67 (2010).
- Costa, A. G., Cusano, N. E., Silva, B. C., Cremers, S., Bilezikian, J. P. Cathepsin K: its skeletal actions and role as a therapeutic target in osteoporosis. Nat. Rev. Rheumatol. 7, 447-456 (2011).
- Perentes, J. Y., et al. et al. In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts. Nat. Methods. 6, 143-145 (2009).
- Breurken, M., Lempens, E. H. M., Meijer, E. W., Merkx, M. Semi-synthesis of a protease-activatable collagen targeting probe. Chem. Commun. 47, 7998-8000 (2011).
- Wang, A. Y., et al. Spatio-temporal modification of collagen scaffolds mediated by triple helical propensity. Biomacromolecules. 9, 1755-1763 (2008).
- Bächinger, H. P., Morris, N. P. Analysis of the thermal stability of type II collagen in various solvents used for reversed-phase high performance chromatography. Matrix. 10, 331-338 (1990).
- Li, Y., et al. Direct detection of collagenous proteins by fluorescently labeled collagen mimetic peptides. Bioconjugate Chem. 24, 9-16 (2013).
- Li, Y., Mo, X., Kim, D., Yu, S. M. Template-tethered collagen mimetic peptides for studying heterotrimeric triple-helical interactions. Biopolymers. 95, 94-104 (2011).
- Stahl, P. J., Cruz, J. C., Li, Y., Yu, S. M., Hristova, K. On-the-resin N-terminal modification of long synthetic peptides. Anal. Biochem. 424, 137-139 (2012).
- Wang, A. Y., Mo, X., Chen, C. S., Yu, S. M. Facile modification of collagen directed by collagen mimetic peptides. J. Am. Chem. Soc. 127, 4130-4131 (2005).
- Wang, A. Y., et al. Immobilization of growth factors on collagen scaffolds mediated by polyanionic collagen mimetic peptides and its effect on endothelial cell morphogenesis. Biomacromolecules. 9, 2929-2936 (2008).
- Mo, X., An, Y. J., Yun, C. S., Yu, S. M. Nanoparticle-assisted visualization of binding interactions between collagen mimetic peptide and collagen fibers. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 2267-2270 (2006).
- Chan, T. R., Stahl, P. J., Yu, S. M. Matrix-bound VEGF mimetic peptides: design and endothelial cell activation in collagen scaffolds. Adv. Funct. Mater. 21, 4252-4262 (2011).
- van Hagen, P. M., et al. Evaluation of a radiolabelled cyclic DTPA-RGD analogue for tumour imaging and radionuclide therapy. Int. J. Cancer. 90, 186-198 (2000).
- Boudko, S., et al. Nucleation and propagation of the collagen triple helix in single-chain and trimerized peptides: transition from third to first order kinetics. J. Mol. Biol. 317, 459-470 (2002).
- Ackerman, M. S., et al. Sequence dependence of the folding of collagen-like peptides. J. Biol. Chem. 274, 7668-7673 (1999).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- Brodsky, B., Persikov, A. V. Molecular structure of the collagen triple helix. Adv. Prot. Chem. 70, 301-339 (2005).
