Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Doğallığı Kollajen Tellerinin Görüntüleme Published: January 31, 2014 doi: 10.3791/51052
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 1,3
1Department of Bioengineering, University of Utah, 2Department of Radiology and Radiological Science, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Institute for NanoBiotechnology, Johns Hopkins University

Summary

Bu prosedür, IR floresan in farelerde kollagen yeniden faaliyetleri görüntüleme hem de denatüre edilmiş kolajen sarmalları ile melezleşmek için verilmedi tetiklenen olabilir kafesli kollajen mimetik peptitler kullanılarak, doku kesitlerinde kolajenlerin ex vivo boyanması yakın in vivo gösterilmiştir.

Abstract

Kollajen doku oluşumu ve bakım destekleyen hücre dışı matrisin önemli bir yapısal bileşendir. Kollajen yeniden normal doku yenilenmesi ayrılmaz bir parçası olmasına rağmen, yeniden aktivitesinin aşırı miktarda tümörler, artrit ve diğer birçok patolojik şartlarda yer almaktadır. Kollajen yeniden sırasında, kollajen moleküllerinin üçlü sarmal yapının hücre dışı ortamda proteazlar tarafından bozulur. Buna ek olarak, pek çok histolojik doku numuneleri içinde bulunan kollajen kısmen sabitleme ve muhafaza işlemleri ile denatüre edilir. Bu nedenle, bu denatüre kolajen iplikler biyolojik görüntüleme için etkin hedefler olarak hizmet edebilir. Daha önce verilmedi tetiklenen kolajenlerin özgüdür üçlü sarmal yapı oluşturarak denatüre kollajen şeritler ile hibridize olabilir kafesli bir kollajen peptidini mimetik (CMP) geliştirdi. Bu işlemin genel hedefler denatüre kollajen iplikçikler r görüntüye) i vardırin vivo olarak, normal yeniden faaliyetlerinden esulting ve ii) verilmedi tetiklenen kafesli cmps kullanılarak ex vivo doku kesitlerinde in kolajenleri görselleştirmek için. Etkili melezleme ve in vivo ve ex vivo görüntüleme başarılı elde edilmesi için, floresan etiketli Kafesli CMPS verilmedi-aktif ya da damar içi enjeksiyon hemen önce, ya da doğrudan doku bölümleri üzerinde aktif hale gelir. Sabitlenmiş bir fare kornea doku kesitlerinde çıplak fareler ve kollajen liflerin normal iskelet kollajen remolding bu prosedürde görüntülenmiş. Burada yer alan CMP-kollajen hibridizasyon teknolojisine dayalı bir görüntüleme yöntemi, doku yeniden modelleme süreci daha iyi anlaşılmasına yol açan, hem de yüksek bir kollajen yeniden aktivitesi ile bağlantılı hastalıklar için yeni teşhis geliştirilmesini izin verebilir.

Introduction

Kollajen, memelide en bol bulunan protein, proliferasyonunu ve hücre farklılaşmasını destekleyerek doku gelişimi ve rejenerasyonda önemli bir rol oynar. Lifli kolajenler (örneğin tip I, II), bağ dokularda dokulara mekanik mukavemet verirken, ağ-benzeri kolajen (IV tipi) hücreleri takmak ve organize dokulardan bazal membran temel iskelesi oluşturur. Kolajen kollajen yeniden bozulmasını (proteazlar tarafından) ve sentez (büyüme faktörleri tarafından teşvik) hem de içerir. Kollajen yeniden, kemik, örneğin, normal doku yenileme işlemi, fazla yeniden aktivitesi veya anormal yerlerde oluşun bir parçası olmasına rağmen, genellikle yara gösteren bir yaralanma ya da kanser, osteoporoz, artrit gibi kronik patolojik koşullara yanıt iyileştirici ve fibroz 1-4. Doğrudan görüntü kollajenleri in vivo biçimlenme geçiyor yeteneği ilerleme anlaşılmasına neden olabilirBu hastalıkların iyon, hem de yeni teşhis ve tedavi. Örneğin, canlı bir görüntüleme şiddeti ve hastalıkların konumu hakkında bilgi sağlar ve aynı zamanda yeni terapötik ajanların etkinliğini değerlendirmek için de kullanılabilir. Multiphoton lazer tarama mikroskobu ve ikinci harmonik üretimi canlı farelerde 5 tümör hücre dışı matris yeniden izlenmesi için görüntü fibril kolajenlerin uygulanmıştır. Ancak, bu teknik invaziv bir işlemdir ki, şeffaf dorsal deri kıvrım odaları ile monte edilecek hayvanlar gerektirir. Kollajenin yeniden Doğrudan ve noninvaziv görüntüleme özellikle biçimlenme geçiyor kolajen hedefleyen bir prob yararlanacaktır. Bu prob bu da normal dokular 6 bol olan sağlam ve olgun kolajenlerin gelen yeniden kolajenleri ayırt etmek gerekir çünkü hazırlamak zordur.

Kollajen olan üçlü helis adlandırılan son derece nadir protein yapısı oluşurörneğin kollajen yeniden sırasında matris metaloproteinaz (MMP) olarak proteazlar tarafından ayrılır. Ayrıldı, kollajen fragmanlarının kendi üçlü sarmal yapısını kaybeder ve daha özel olmayan proteazlar tarafından sindirilir 1 katlanmamış şeritler (jelatin) hale gelir. Yakın zamanda, üçlü sarmal yapısına katlanması için bir eğilime sahip olması, kollajen taklit peptid (CMP) özel olarak bir ya da ısı denatürasyonu ile ya da enzimatik bozulmaya 1.7 tarafından üçlü sarmal durumundan ayrışmış kollajen ipliklerini hedef olabilir keşfedilmiştir. Bağlanma, birincil olarak monomerik cmps ve denatüre edilmiş kolajen şeritlerin arasındaki üçlü sarmal hibridizasyonu ile tahrik edilir. CMPS kollajen melezleme, bir kafes CMP için biraz itici kuvvet ile oda sıcaklığında homotrimeric üçlü sarmaldan içine kendini monte çünkü [(GPO) 4 NB GPO (GPO) 4, NB (GPO) 9 olarak belirlenmiş, O: hidroksiprolin] geliştirildi hangi fotoğraf bölünebilir nitrobenzili içeriyorgrubu (NB) peptidin merkezi glisin eklenmiş. NB kafes grubu sterik olarak üçlü sarmal içine katlanır gelen CMP önler, ama UV ışınlaması ile kafes grubunun çıkarılması hemen üçlü sarmal kollajen katlama ve hibridizasyon 1 tetikler. Yakın kızılötesi (NIR) flüoroforlar ile etiketlenmiş monomerik CMPS sistemik fareler model teslim edilir, onlar özellikle hedef ve normal (örneğin kemik ve kıkırdak) geçiren dokularda ve patolojik (örn. tümörlerde) 1 remodellinglerinde denatüre kolajenlerin in vivo görüntüleme izin verebilir .

Floresan etiketli CMPS, aynı zamanda histolojik doku kesitlerinde in kolajenleri görüntülenmesi için kullanılabilir. Histolojik çalışmada, hasat dokusu sık sık hücresel bileşenleri ve bozulmalara karşı genel doku morfolojisi tutmak için tespit ile korunur. Isı ve organik çözücüler ile tedavi, kimyasal çapraz linkin içerir sabitleme işlemleri,g reaktifler (örneğin paraformaldehit), kolajen 8'deki üçlü sarmal yapısını denatüre. Bu, denaturasyon CMP hibridizasyon için bölgeler oluşturur. O floresan etiketli cmps spesifik olarak, hatta daha etkili bir fibrotik karaciğer dokularında 9 patolojik koşulların belirlenmesi kolay izin verilen bir anti-kollajen antikoru, daha sabit bir doku kesitlerinde in kolajenlerin için (örneğin, deri, kornea, kemik ve) bağlanabildiği gösterilmiştir. CMP kolajenlerin her türlü için ortak olan üçlü helis motifi amino asit sekansını ihtiva eden denatüre kolajen şeritleri hedefliyor. Bu nedenle CMP geniş spektrumlu bir kolajen boyama madde olarak kabul edilebilir. Burada, floresan etiketli kafesli cmps kullanılarak in vivo denatüre kolajen şeritleri ve ex vivo doku kesitlerinde in ii) görselleştirme kolajenleri görüntüleme i) için ayrıntılı deneysel prosedürler mevcut. A NUR etiketi, IR680, canlı görüntüleme, whil için kafesli CMP konjuge edildiE carboxyfluorescein (CF), standart floresan mikroskoplar ile uyumluluk için doku boyama çalışmalarında kullanılmıştır. Bu protokol kollajenin yeniden ile ilgili olarak CMPS görüntüleme uygulaması üzerinde duruluyor. CMP sentezi için yöntemler, daha önceki raporlarda 1,7,9-15 bulunabilir. Bu ekran raporda, normal farelerde ve fare kornea dokusu bölümlerinde görüntüleme iskelet dokular gösteri amacıyla seçilmiştir, burada sunulan yöntemler hali hazırda olduğu gibi, kollajen yeniden (örneğin, tümörler, yara iyileşmesi) içeren pek çok patoloji ve biyolojik modeller uygulanabilir Ancak iyi kolajenleri içeren hemen hemen her öneki doku numunesi olarak.

Protocol

Tüm hayvan çalışmaları, Johns Hopkins Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu düzenlemelerine uygun olarak yapılmıştır.

1.. In vivo İskelet Kollajen Yaptırma Infrared (NIR) Floresans Görüntüleme civarında

  1. Kafesli CMP ve kuyruk ven enjeksiyon Foto-aktivasyon
    1. Transferi ve enjeksiyon sırasında muhtemel kaybı için ilave bir 10 ul yastık, dozlama için solüsyonun 100 ul: Her bir fare için kafesli CMP çözeltisinin 110 ul (20-30 g fare ağırlığı) hazırlayın. IR680-Ahx-NB (GPO) steril PBS çözeltisi içinde 100 uM sisteinin 11 ul 9 stok çözeltisi (400 uM) ve 11 ul karıştırın, daha sonra 1 x PBS tamponu ile 110 ul toplam hacmi getirmek. Nihai peptid solüsyonu IR680-Ahx-NB (GPO) 9 4 nmol ve 1x PBS çözeltisi 100 ul sisteinin 1 nmol içerir.
    2. Yavaşça withdradikkatli bir şekilde peptit şeffaf varil ve küçük bir ölçüsü (G 28-30) iğne ile bir 0.5 ml şırıngaya insülin çözeltisi ve w hava kabarcıklarını çıkarmak. Lamba 2-5 dakika boyunca ısınmasını sağlamak için UV lambası açın.
    3. Foto-aktivasyonuna izin doğrudan 5 dakika için UV lambası (365 nm,> 25 mW / cm 2) altında peptit içeren şırınga yerleştirin.
    4. Bu arada, ısıtılmış bir lambanın altında bir süzgeç içinde fare konumunu, kuyruk veya kulak etiketi veya ayak dövme gibi diğer tanımlama yöntemleri kalıcı bir kalem ile fare etiket, ve% 70 alkol ile kuyruk dezenfekte.
    5. Hemen UV aktivasyonundan sonra, tercihen kuyruk arka kısmında, UV-aktif IR680-Ahx-NB (GPO) kuyruk damarına 9 çözeltisi 100 ul enjekte edilir. Enjeksiyondan sonra geri kafesine fare yerleştirin.
  2. Kollajen yeniden aktivite flüoresan NIR görüntüleme
    1. SetPearl Impulse 2.0 yazılımı kullanılarak 37 ° C darbe görüntüleyici görüntüleme yatağının ısıtıcı plaka.
    2. Oksijen% 2 izofluran içeren anestezi indüksiyon odasına çıplak ya da traş fare koyun. Taşıma sırasında ve respirations sıklığını (~ 1/sn) izleyerek fare hareketinin olmaması ile anestezi düzlemde derinliği olun.
    3. Fare anestezi sonra, İnci görüntüleyici çekmeceyi açın ve görüntüleme yatakta hayvan. Çabuk burun konisi kapağı çıkarıp, görüntüleme işlemi sırasında (burun konisi ile / dak 2 L teslim oksijen izofluran% 2 ile) anestezi altında fare tutmak için burun konisi içine fare namlu kaydırın. Fare yerleştirildikten sonra, çekmeceyi kapatın.
    4. Enstrüman Image yazılımı panelde "hazır" gösterdiğinde, görüntü elde "düğme" ardından kutuları "" 700 kanal "," beyaz ışık "ve" 85 mikron tıklayın. NUR (eksitasyon 685 nm, emisyon 720 nm) bird beyaz ışık fotoğraflar daha sonra otomatik odaklama ve pozlama kullanılarak alınacaktır.
    5. Kayıt tamamlandığında, çekmeceyi açmak fare açın ve başka bir açıdan görüntü kazanır. Fare geri ön (ventral), (dorsal) ya da kamera bakan yanları ile yerleştirilebilir. Sınırlamalar ilgi bölgesi (örneğin göğüs kafesi, ayak bilekleri ve bilekler) en iyi görünümü elde etmek için onun bacaklarda germek gibi bant dar şeritler kullanılabilir.
    6. IR680-CMP iskelet alımını gözlemlemek için uygun bir zaman dozda (~ 4 nmol / fare) dayalı, 24-96 saat sonrası enjeksiyon (HPI) arasındadır. , Yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde 72 hpi sonra, cerrahi forseps ve makas kullanılarak cilt (ve saç) kaldırmak derin anestezi altında iken servikal dislokasyon ile fare kurban, ve yukarıda anlatıldığı gibi NUR floresan tarafından görüntü o kadar.
    7. Edinilen NUR floresan görüntüleri analiz.

2. Ex vivo kolajenlerin Görselleştirme0; Doku Bölümler

  1. Malzeme hazırlığı
    1. % 10 1 ml deiyonize su (w / v) BSA çözeltisi hazırlayın. , Oda sıcaklığında bir su banyosu içinde keçi serumu içinde 1 ml çözülme. X 5 cm, yaklaşık 2 cm büyüklüğünde Parafilm birkaç parça kesin.
    2. Keçi serumu ve 500 ul PBS 10x 1 mi ve iyonu giderilmiş su, 8.5 ml karıştırılarak blokaj tamponu 10 ml hazırlayın. Iyonu giderilmiş su ve 4.45 ml 500 ul PBS ile 10 kat (a / h) BSA,% 10, 50 ul seyreltilmesiyle CMP seyreltme tamponu içinde 5 ml hazırlayın.
    3. CMP seyreltme tamponu ile 5 mcM, carboxyfluorescein etiketli kafesli CMP, CF NB (GPO) 9 (480 mM) stok çözümleri sulandırmak. Optimal konsantrasyon CMP dokuların tipi ve doku örneklerinin doğasına bağlı olarak 2.5-30 uM arasında değişmektedir. 100 ul'lik bir hacmi, bir doku kesiti slayt lekeleme için tavsiye edilir. Formüle CMP solut MağazaKaranlıkta iyonları.
    4. Fare kornea dokusu slaytlar oda sıcaklığına muvazene edelim. 5 dakika boyunca 1x PBS tamponu içinde kuluçkaya bırakın. Bu tasvirde kullanılan fare kornea dokular 8 um kalınlığa cryosectioned Tissue-Tek OCT içinde cryo-korunmuş bir ortamda 1 saat, PBS çözeltisi içinde% 4 paraformaldehit ile öneki ve yüklü cam slaytlar üzerine monte edilmiştir.
  2. Doku boyama ve görüntüleme
    1. Nemlendirilmiş bir odada slaytlar yerleştirin. Her bir slayt için, bloke etme çözeltisi, 0.5 ml uygulanır ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca slaytlar inkübe edin. Bir kağıt havlu üzerinde kurutma kağıdı ile slaytlar bloke çözüm çıkarın.
    2. Her slayt doku bölümleri kapsayacak şekilde CF NB (GPO) 9 çözümler yaklaşık 100 ul uygulayın. CMP çözelti dokulara nüfuz izin vermek için 2 dakika boyunca kuluçkaya bırakın.
    3. UV lambasını açmak. Lamba ısınmış olduğunda, CMP-kaplı doku ortaya seKafesli CMPS korumasını kaldırmak amacıyla, 6 dakika (365 nm, ~ 8 mW / cm 2) için, UV ışığına seksiyonlar. UV maruz kaldıktan sonra, kurumasını önlemek için Parafilm bir parça ile, her slaydın doku bölümleri kapsamaktadır. Nemli bir bölmede slaytlar yerleştirin ve 2 saat boyunca 4 ° C'de inkübe.
    4. 1x PBS DAPI çözeltisinin bir 1:3,000 seyreltme hazırlayın. CMP boyama sonra, forseps ile yavaşça Parafilm kaldırmak ve aşırı CMP çözüm kaldırmak için bir kağıt havlu üzerine slaytlar kurulayın. Her bir doku slayta seyreltildi DAPI çözeltiler, yaklaşık olarak 100 ul uygulanır ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca inkübe edin.
    5. Boyama işleminden sonra, 5 dk için bir boyama kavanoza 1x PBS tamponu içinde slaytlar bırakın. Ilişkisiz boyama ajanları yıkayın taze 1x PBS içinde bu 3x tekrarlayın.
    6. Doku bölümünde montaj orta bir damla ekleyin ve hava kabarcıklarını yakalama kaçınarak bir cam kapak slip ile örtün. Işıktan korumak için bir karton slayt tepsiye slaytlar koyun.
    7. Görüntü kolajen şeritleri (FITC kanal) ve hücre çekirdekleri (DAPI kanalı), bir floresans mikroskobu kullanılarak doku slaytlar.

Representative Results

Şekil 1 fotoğraf tetiklenen IR680-Ahx-(GPO) 9 24-96 saat sonrası enjeksiyondan sonra sağlıklı bir kadın SKH1 fareye nasıl dağıtır tipik bir sonucu gösterir. Bu bağlanmamış peptidler en büyük ölçüde temizlendi edildiği noktada, 24 hpi sonra iskelette belirgin CMP birikimini gösterir. Kollajen yeniden şeritlerin ile hibridize CMP bir işlem, özellikle, diğer peptid görüntüleme problar (örneğin, RGD 16) aksine olarak, nispeten düşük görünmektedir. Bu, büyük ihtimalle, çünkü üçlü sarmal kollajen 17,18 yavaş katlama oranına sahiptir. Sadece hafif bir azalma sinyal HPI 24 (Şekil 1) sonra görüldüğü gibi Ancak, bir kez hibridize, CMP şeritler güçlü, kollajen dokularının bağlanmıştır. 96 hpi anda, deri çıkarıldıktan sonra fare NUR floresan görüntü net IR680-Ahx-(GPO) ve iskelet alımım omurga ve kaburga de, yanı sıra dizlerinin içindeki 9, ayak bilekleri,Bilekler ve alt çene kemiklerini (Şekil 2A).

Ex vivo doku lekeleme olarak verilmedi tetiklenen floresan etiketli kafesli cmps özellikle doku kesitlerinde in denatüre kollajen şeritlerin hibridize olur. Şekil 3'te, CMP boyama açık bir şekilde spesifik boyama kolajen ajan olarak kullanımını gösterir kornea stroma, en ince paralel kolajen fibrilleri ortaya koymaktadır.

Şekil 1
Şekil 1. Çıplak fare Seri NUR floresan görüntüler 9 dört gün boyunca iskelet alımını gösteren fotoğraf-decaged IR680-Ahx-(GPO) ile intravenöz. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 2, Şekil 2. Fotoğraf-decaged IR680-Ahx-(GPO) uygulanan farelerin NUR floresan görüntüleri 9 (A), UV ışınlarına maruz kalma (B) olmadan IR680-Ahx-NB (GPO) 9 kafesli, üçlü sarmal [IR680-Ahx-(GPO önceden katlanmış CMP ile çıkarılmasından sonra cilt 96 HPI at) 9] 3 (C), ya da ısı ayrışmış tek kordonlu IR680-Ahx-(GPO) 9 (D). İskelet hedefleme sadece A ve D'de gözlemlenebilir. NUR floresan sinyalleri gökkuşağı cetvelinde gösterilir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 3,
Şekil 3,. Fare co Floresan mikrograflarrneal doku bölümünde paraformaldehitte öneki ve DAPI ve fotoğraf tetiklenen CF (GPO) ile boyandı 9, Protokolü 2 kullanılarak (yeşil CMP ile boyandı) yoğun kollajen dokudan görüntüleme yanı sıra mavi hücresel epitel ve endotel (DAPI ile boyanmış, ) (ölçek çubuğu: 100 mikron).

Discussion

Bu protokolde görülebileceği gibi kafesli cmps UV-etkinleştirme ortak kuyruk damarından enjeksiyon protokolleri 19 için tek ek bir adım olduğu için, CMP teslim basittir. Anahtar bir Uncaged ve meta-kararlı tek kordonlu halde peptit probları enjekte etmektir. Kafes grup kendi kendine düzeneğinden CMP engeller ve CMP üçlü sarmal halinde katlanmasına başladığı noktada UV ışığı ile çıkarılır kadar kolajenler (Şekil 2B) bağlanması. Enjeksiyon formülasyon hızlı bir şekilde en aza indirmek için bir toksisite şekilde UV ışınlaması sırasında yarılmış kafes grubu ile tepkimeye girebilen, sistein içerir. Farklı suşları (örneğin, SKH-1 ve DR-1) ile çok sayıda farenin bu formülasyon kullanılarak test edilmiş ve altı aya kadar bu farelerde herhangi bir davranış ya da sağlık kusurları tespit etmedi. Enjeksiyon UV ışınlarına maruz hemen sonra takip etmezse, CMPS hiçbir melezleme kapasitesine sahip olduğu, homotrimeric üçlü sarmaldan içine kat edecek. Şekil 2C enjeksiyondan önce CMPS tamamen uzun gecikme süresi (> 2 gün) ile üçlü sarmaldan takıldı edildi aşırı durum göstermektedir. Bu sorunu aşmak için, CMP solüsyon nispeten düşük bir konsantrasyonda (örneğin ~ 40 uM) hazırlandı ve hemen UV-decaging sonra farelere enjekte edilmelidir. Çünkü seyreltik koşullarda CMPS yavaş üçlü sarmal katlanır oranı (sarmallamanın yarım saati:> 50 dk) ve kısa UV ışınlarına maruz kalma ve enjeksiyon süresi (5 ~ 7 dakika toplam), CMPS çoğunda tek kan dolaşımına Bu protokol takip edildiğinde formu iplikçik. Konsantrasyon, yeniden toplama oranı 18 dramatik azalmasına yol açan, kan havuzu içinde 20 kat azaltılır gibi bir kez enjekte edilmiş, CMPS, tek şeritler olarak kalması beklenmektedir. Enjeksiyon gecikir (örn. hayvan taşıma için) ve homotrimeric doğallaşım şüpheleniliyorsa, kısmen monte peptidler 70 üzerinde ısıtılarak sokulabilir76; C istemi soğutma ve enjeksiyon ardından tek-lifler, için CMPS ayırmak. Daha az elverişli olsa da, bu tür ısı ile ayrışmış cmps da (Şekil 2B) in vivo hedeflenmesinde beklenen sonuçları göstermektedir.

NIR sinyalin% 50'ye varan saç tarafından bloke edilebilir, çünkü bu tanıtımda, çıplak farenin NIR flüoresan görüntüleme için kullanılmıştır. Saçlı fare modellerinde (siyah kıllar özellikle olanlar) ile çalışırken, biz bir elektrikli tıraş makinesi veya saç çıkarıcı kullanarak önce görüntüleme ilgi bölgesinde fareyi tıraş öneririz. Şekil 1 'de, hayvan diyet klorofil otomatik floresans neden olduğu hayvanın karın bölgesi, yanlış pozitif sinyaller vardır. Bu arka plan sinyalleri önemli ölçüde yaklaşık 4 gün önce görüntüleme saflaştırılmış diyetler için fareyi geçerek düşürülebilir. Şekiller 1 ve 2A 'de görüldüğü gibi, güçlü CMP yutaklar kuyruk spin vardıre. Bu nedenle, mükemmel olmayan bir kuyruk ven enjeksiyonları kaynaklanan sonuçları engellemek için, enjeksiyon yerinde floresan görüntü yakalanan değildir, böylece kuyruk arka kısmında enjekte önerilir.

Etiketli CMP başka yöntemler kullanılarak tespit edilmesi zor olan in vivo kolajen yeniden belirli konumların hedefleme ve görüntüleme sağlar. Örneğin, ELISA-temelli kan ve idrar analizleri yarılmış telopeptid kollajen fragmanları için duyarlıdır ancak bu Çözülebilir antijenleri hedef için bir yöntem olup, kolajen devir kaynağını tespit edemez. NIR kullanarak in vivo görüntüleme tekniğinin temel sınırlamalar hemoglobin 680/710 nm NIR boyaların bir endojen söndürücü olarak CMPS yakın toplanmış kırmızı hücreleri tarafından derinliği penetrasyon zayıflama ve söndürme işaretlenmiştir. In vivo görüntüleme CMP geleceği uygulamaları doğrudan gama yayan radyoaktif ya da pozitron emi ile etiketlenmiş cmps kullanılarak SPECT veya PET görüntüleme dahiltters, kollajen remodeling (örneğin osteoporoz, artrit, ateroskleroz, ve fibrozis) ilgili hastalık durumlarının teşhis için. Bu radyo-etiketli CMP analoglan doku derinliği ve toplanmış kırmızı hücrelerin varlığı nedeniyle sinyal kaybı sınırlamaları ortadan kaldırır ve hastalıklı dokuların niceliksel ölçümler sağlayacaktır. Buna ek olarak, görece geç görüntüleme süresi (örneğin 48-96 HPI) CMPS yavaş bağlanma ve açıklık kaynaklanan zor kollajenin yeniden hızlı değişimleri takip yapabilir. Böyle bir sınırlama bağlayıcı kinetik ve CMP görüntüleme ajanları afinite daha mühendisliği ile aşılabilir. CMP küçük bir yapıya sahip denatüre kolajenlerin bağlanan bu yana, CMP-kollajen bazlı görüntüleme yalnızca görüntü kolajen lifleri 5 ikinci harmonik üretimi mikroskopi tamamlayıcıdır.

Floresan etiketli CMPS ile doku bölümleri boyama, biz bunu yararlı kuluçkaya bulundu4 ° C de UV-aktif peptit Çözeltilerin örnekleri üçlü sarmal melezleştirme düşük bir sıcaklıkta 1,20 da kolaylaşır çünkü. Ayrıca, boyama kavanoza taze PBS tamponu içinde slaytlar çeker sadece örnek üzerinde yıkama tamponları pipetle çok daha iyi çalıştığı, bağlanmamış cmps yıkamak için en etkili yol olduğu bulunmuştur. CMP-kollajen lif hibridizasyon çok özel ve sağlam olan ve bu nedenle bu video yer alan basit boyama protokolü kolaylıkla ilave belirteçler costaining değiştirilmiş ve sabitlenmemiş doku bölümlerinde bozulmuş kolajenleri belirlenmesi için olabilir. Bu çeşitli histolojik örneklerde lifli kolajenleri tespit etmek için bir anti-kollajen antikorların kullanıldığı için etkili ve uygun bir alternatiftir.

Disclosures

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Acknowledgments

Yazarlar, teknik yardım için Gilbert Yeşil ederiz. Bu çalışma MGP layık NIAMS / NIH (R01-AR060484) ve DOD (W81XWH-12-1-0555) SmY verilen gelen ve NIH (U24 CA92871 ve U54 CA151838) hibe tarafından desteklenmiştir

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IRdye 680RD Maleimide (IR680) LI-COR 929-71050 Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere1.
5(6)-Carboxyfluorescein Sigma 21877-5G-F Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere12.
Cysteine Advanced Chemtech YC2200
Isoflurane Butler Veterinary Supply 4/4/5260
Goat Serum Sigma G9023-10ML
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma A9647
DAPI Roche Applied Science 10236276001
Fluoroshield mounting medium Sigma F6182-20ML
Syringes BD 329461
UV lamp McMaster-Carr 1447T17
Pearl impulse imager LI-COR 9400
Surgical forceps and scissors
EasyDip slide staining system Light Labs M900-12B
20-place cardboard microscope slide tray Light Labs
Cover glasses Fisher 12-545-c
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse TE2000-E

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, Y., et al. Targeting collagen strands by photo-triggered triple-helix hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14767-14772 (2012).
  2. Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nat. Med. 18, 1028-1040 (2012).
  3. Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment. Cell. 141, 52-67 (2010).
  4. Costa, A. G., Cusano, N. E., Silva, B. C., Cremers, S., Bilezikian, J. P. Cathepsin K: its skeletal actions and role as a therapeutic target in osteoporosis. Nat. Rev. Rheumatol. 7, 447-456 (2011).
  5. Perentes, J. Y., et al. et al. In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts. Nat. Methods. 6, 143-145 (2009).
  6. Breurken, M., Lempens, E. H. M., Meijer, E. W., Merkx, M. Semi-synthesis of a protease-activatable collagen targeting probe. Chem. Commun. 47, 7998-8000 (2011).
  7. Wang, A. Y., et al. Spatio-temporal modification of collagen scaffolds mediated by triple helical propensity. Biomacromolecules. 9, 1755-1763 (2008).
  8. Bächinger, H. P., Morris, N. P. Analysis of the thermal stability of type II collagen in various solvents used for reversed-phase high performance chromatography. Matrix. 10, 331-338 (1990).
  9. Li, Y., et al. Direct detection of collagenous proteins by fluorescently labeled collagen mimetic peptides. Bioconjugate Chem. 24, 9-16 (2013).
  10. Li, Y., Mo, X., Kim, D., Yu, S. M. Template-tethered collagen mimetic peptides for studying heterotrimeric triple-helical interactions. Biopolymers. 95, 94-104 (2011).
  11. Stahl, P. J., Cruz, J. C., Li, Y., Yu, S. M., Hristova, K. On-the-resin N-terminal modification of long synthetic peptides. Anal. Biochem. 424, 137-139 (2012).
  12. Wang, A. Y., Mo, X., Chen, C. S., Yu, S. M. Facile modification of collagen directed by collagen mimetic peptides. J. Am. Chem. Soc. 127, 4130-4131 (2005).
  13. Wang, A. Y., et al. Immobilization of growth factors on collagen scaffolds mediated by polyanionic collagen mimetic peptides and its effect on endothelial cell morphogenesis. Biomacromolecules. 9, 2929-2936 (2008).
  14. Mo, X., An, Y. J., Yun, C. S., Yu, S. M. Nanoparticle-assisted visualization of binding interactions between collagen mimetic peptide and collagen fibers. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 2267-2270 (2006).
  15. Chan, T. R., Stahl, P. J., Yu, S. M. Matrix-bound VEGF mimetic peptides: design and endothelial cell activation in collagen scaffolds. Adv. Funct. Mater. 21, 4252-4262 (2011).
  16. van Hagen, P. M., et al. Evaluation of a radiolabelled cyclic DTPA-RGD analogue for tumour imaging and radionuclide therapy. Int. J. Cancer. 90, 186-198 (2000).
  17. Boudko, S., et al. Nucleation and propagation of the collagen triple helix in single-chain and trimerized peptides: transition from third to first order kinetics. J. Mol. Biol. 317, 459-470 (2002).
  18. Ackerman, M. S., et al. Sequence dependence of the folding of collagen-like peptides. J. Biol. Chem. 274, 7668-7673 (1999).
  19. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J. Vis. Exp. (67), (2012).
  20. Brodsky, B., Persikov, A. V. Molecular structure of the collagen triple helix. Adv. Prot. Chem. 70, 301-339 (2005).

Tags

Biyomühendislik Sayı 83 kolajen yeniden üçlü sarmal yakın kızılötesi floresan bio doku boyama
Doğallığı Kollajen Tellerinin Görüntüleme<em&gt; In vivo</em&gt; Ve<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kafesli Kollajen Mimetik Peptidlerinin Fotoğraf-tetiklenen Hybridization yoluyla
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Y., Foss, C. A., Pomper, M. G.,… More

Li, Y., Foss, C. A., Pomper, M. G., Yu, S. M. Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides. J. Vis. Exp. (83), e51052, doi:10.3791/51052 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter