Summary
הליך זה מדגים in vivo ליד ההדמיה IR הקרינה של פעילויות שיפוץ קולגן בעכברים, כמו גם vivo מכתים לשעבר של collagens בסעיפי רקמות באמצעות פפטידים כוזב קולגן בכלוב שיכול להיות מופעל על תמונה ללהכליא עם גדילי קולגן מפוגלים.
Abstract
קולגן הוא מרכיב מבני עיקרי של מטריקס תאי התומך בהקמה ובתחזוקת רקמות. למרות שיפוץ קולגן הוא חלק בלתי נפרד מהתחדשות רקמות נורמלית, כמות מוגזמת של פעילות שיפוץ עוסקת בגידולים, דלקת פרקים, ומצבים פתולוגיים רבים אחרים. במהלך שיפוץ קולגן, מבנה הסליל המשולש של מולקולות קולגן מופר על ידי פרוטאזות בסביבה תאית. בנוסף, collagens נוכח בהרבה דגימות רקמה היסטולוגית הם מפוגל באופן חלקי על ידי תהליכי הקיבוע ושימור. לכן, גדילי קולגן מפוגל אלה יכולים לשרת מטרות יעילות באותה מידה להדמיה ביולוגית. אנחנו פיתחנו בעבר פפטיד בכלוב כוזב קולגן (CMP) שיכול להיות ללהכליא עם גדילי קולגן מפוגלים על ידי יצירת מבנה סליל משולש, אשר הוא ייחודי לcollagens-מופעל על תמונה. מטרות העל של הליך זה הם אני) לתמונת גדילי קולגן מפוגלים resulting מפעילות שיפוץ נורמלית in vivo, וii) כדי להמחיש collagens בסעיפי רקמות vivo לשעבר באמצעות CMPs בכלוב-מופעל על התמונה. כדי להשיג הכלאה ומוצלחת in vivo לשעבר vivo הדמיה אפקטיביות, CMPs בכלוב שכותרתו fluorescently הם או מייד לפני הזרקה תוך ורידית הופעל צילום, או מופעלים ישירות על חלקי רקמות. remolding קולגן שלד הנורמלי בעכברים בעירום וcollagens בסעיפי רקמת קרנית עכבר קידומת הם צילמו בהליך זה. שיטת ההדמיה המבוססת על טכנולוגית הכלאת CMP-קולגן המוצגת כאן עלולה להוביל להבנה עמוקה יותר של תהליך שיפוץ רקמות, כמו גם לאפשר פיתוח של כלי אבחון חדשים למחלות הקשורות לפעילות שיפוץ הגבוה קולגן.
Introduction
קולגן, החלבון הנפוץ ביותר ביונקים, משחק תפקיד קריטי בהתפתחות והתחדשות רקמות על ידי תמיכה בריבוי והתמיינות של תאים. בעוד collagens הסיבי (לדוגמא מהסוג I, II), ברקמות חיבור נותן חוזק מכאני לרקמות, קולגן כמו הרשת (סוג IV) בצורת פיגום בסיסי של הקרום במרתף שבו תאים לצרף וליצור רקמות מאורגנות. שיפוץ קולגן כרוך גם השפלה קולגן (על ידי פרוטאזות) וסינתזה (מקודם על ידי גורמי גדילה). למרות שיפוץ קולגן, למשל בעצמות, הוא חלק מהתהליך הנורמלי התחדשות רקמות, פעילות שיפוץ עודפת, או המופע שלה במקומות לא נורמלים, בדרך כלל מצביע על ריפוי פצע תגובה לפציעה או למצבים פתולוגיים כרוניים כגון סרטן, אוסטיאופורוזיס, דלקת פרקים, ו סיסטיק 1-4. היכולת ישירות collagens תמונה עובר שיפוץ in vivo יכולה להוביל להבנה של ההתקדמותיון של מחלות אלו, כמו גם כלי אבחון ותרופות חדשים. לדוגמא, הדמיה חיה יכולה לספק מידע על החומרה והמיקום של המחלות, והוא יכול לשמש גם כדי להעריך את היעילות של סוכנים טיפוליים חדשים. מיקרוסקופ סריקת לייזר multiphoton ודור שני הרמוני הוחלו collagens סיבי תמונה לניטור שיפוץ מטריצה תאית בגידול בעכברים חיים 5. עם זאת, טכניקה זו דורשת בעלי חיים כדי להיות מותקנת עם תאי skinfold הגב שקופים, שהוא הליך פולשני. הדמיה ישירה ולא פולשנית של שיפוץ קולגן תיהנה מבדיקה שבמיוחד מטרות קולגן שעבר שיפוץ. בדיקה כזו היא קשה להכין מאז שהוא צריך להבחין collagens שיפוץ מcollagens שלם ובוגר, הנמצא בשפע ברקמות נורמליות 6.
קולגן מורכב ממבנה הנדיר ביותר חלבון הנקרא סליל משולש, שהואביקע ידי פרוטאזות כגון metalloproteinases מטריקס (MMP) במהלך שיפוץ קולגן. ברי קולגן ביקע לאבד את מבנה הסליל המשולש שלהם ולהפוך לגדילי פרש (ג'לטין), אשר מתעכלים נוספת על ידי פרוטאזות ספציפיות 1. הוא התגלה לאחרונה כי פפטיד קולגן כוזב (CMP) שבה יש הנטייה להתקפל למבנה סליל משולש במיוחד יכול למקד גדילי קולגן שהם ניתקו ממדינת הסליל המשולשת שלה או על ידי denaturation חום או על ידי פירוק אנזימטי 1,7. המחייב הוא מונע בעיקר על ידי הכלאה משולש סליל בין CMPs monomeric וגדילי קולגן מפוגלים. בגלל CMPs עצמי להרכיב לתוך סלילים משולשים homotrimeric בטמפרטורת חדר עם כוח מניע קטן לכלת קולגן, CMP בכלוב [(לע"מ) 4 NB-GPO (לע"מ) 4, המיועד כNB (לע"מ) 9, O: hydroxyproline], פותח , אשר מכיל nitrobenzyl צילום cleavableקבוצה (NB) שצורף לגליצין של הפפטיד המרכזי. קבוצת כלוב NB sterically מונעת CMP ממתקפל לתוך סליל משולש, ובכל זאת, להסרת מקבוצת הכלוב על ידי קרינת UV מעוררת את קיפול הסליל המשולש וכלת קולגן 1 באופן מיידי. כאשר CMPs monomeric שכותרתו עם אינפרא אדום הקרוב fluorophores (NIR) מערכתי מועברים למודל עכברים, הם יכולים באופן ספציפי למקד ולאפשר בתחום ההדמיה vivo של collagens מפוגל ברקמות עוברות רגיל (למשל בעצמות וסחוס) ופתולוגיים (למשל בגידולים) שיפוץ 1 .
גם CMPs שכותרתו fluorescently יכולה לשמש להדמית collagens בסעיפי רקמות היסטולוגית. במחקר היסטולוגית, רקמות שנקטפו לעתים קרובות נשמרו על ידי קיבוע כדי לשמור על המרכיבים התאיים ומורפולוגיה רקמה הכוללת מהידרדרות. נהלי תיקון, הכוללים חום, וטיפול בממסים אורגניים, ולינקין הצולב הכימיריאגנטים g (למשל paraformaldehyde), לפגל מבנה הסליל המשולש של הקולגן 8. denaturation זה יוצר אתרים עבור הכלאה CMP. הוכח שCMPs שכותרתו fluorescently במיוחד יכול להיקשר collagens בסעיפי רקמות קבועים (למשל עור, קרנית, ועצם) אפילו בצורה יעילה יותר מאשר נוגדנים נגד קולגן, אשר אפשרו זיהוי קליל של תנאים פתולוגיים ברקמות כבד fibrotic 9. CMP מטרות גדילי קולגן מפוגלים המכילים רצף חומצות אמינו של מוטיבים סליל משולשים, שהוא משותף לכל סוגי collagens. לכן יכול להיחשב CMP סוכן מכתים קולגן ספקטרום רחב. כאן, אנו מציגים הפרוצדורות מפורטות עבור i) הדמיה גדילים מפוגלים קולגן in vivo ו collagens ii) באופן חזותי בסעיפי רקמות vivo לשעבר באמצעות CMPs בכלוב שכותרתו fluorescently. תג ניר, IR680, היה מצומדת לCMP בכלוב עבור הדמיה חיה, whilcarboxyfluorescein דואר (CF) שימש בעבודת צביעת רקמות לתאימות שלה עם מיקרוסקופים הקרינה סטנדרטיים. פרוטוקול זה מתמקד ביישום ההדמיה של CMPs כקשור לשיפוץ קולגן. ניתן למצוא שיטות לסינתזת CMP בדוחות קודמים 1,7,9-15. בדו"ח זה וידאו, הדמיה רקמות שלד בעכברים נורמלים וחתכים רקמה של קרנית עכבר נבחרו למטרה הפגנה, אולם השיטות שהוצגו כאן יכולות להיות מיושמות בקלות לפתולוגיות רבות ומודלים ביולוגיים מעורבים שיפוץ קולגן (למשל גידולים, ריפוי פצעים), כמו גם כמעט לכל דגימת רקמת התחילית המכילה collagens.
Protocol
כל המחקרים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לתקנות ועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש בג'ונס הופקינס.
1. אינפרא אדום קרוב (NIR) דימות פלואורסצנטי של שלד קולגן שיפוץ בvivo
- צילום והפעלה של ההזרקה לוריד CMP וזנב בכלוב
- הכן 110 μl של פתרון CMP בכלוב לכל עכבר (במשקל 20-30 גרם עכבר): פתרון למינון 100 μl, עם כרית μl 10 נוספת עבור האובדן האפשרי במהלך העברה וזריקה. מערבבים 11 μl של IR680-AHX-NB פתרון 9 מניות (400 מיקרומטר) עם 11 μl של 100 ציסטאין מיקרומטר בפתרון PBS סטרילי (לע"מ), ואז להביא את הנפח הכולל עד 110 μl עם חיץ 1x PBS. פתרון פפטיד הסופי מכיל 4 nmol של IR680-AHX-NB (לע"מ) 9 ו1 nmol של ציסטאין בפתרון של 1x PBS 100 μl.
- לאט withdraw פתרון פפטיד לתוך מזרק אינסולין 0.5 מיליליטר עם חבית שקופה ומד קטן (28-30 G) מחט, ובזהירות להסיר את בועות האוויר. הדלק את מנורת UV כדי לאפשר למנורה להתחמם במשך 2-5 דקות.
- הנח את המזרק המכיל פפטיד ישירות תחת מנורת UV (365 ננומטר,> 25 mW / cm 2) במשך 5 דקות, כדי לאפשר צילום הפעלה.
- בינתיים, מקם את העכבר בעוצר מתחת לפנס מחומם; לתייג את העכבר עם סמן קבע על הזנב או שיטות זיהוי אחרות כגון תג אוזן או קעקוע הבוהן, ולחטא את הזנב עם אלכוהול 70%.
- מייד לאחר הפעלת UV, להזריק של הופעל-UV IR680-AHX-NB (לע"מ) 9 פתרון לוריד הזנב 100 μl, מעדיפים בחלק האחורי של הזנב. מניחים את העכבר חזרה לכלוב לאחר הזרקה.
- דימות פלואורסצנטי ניר פעילות שיפוץ קולגן
- ערכהצלחת מחמם מיטת ההדמיה של תרמי דחף 37 מעלות צלזיוס באמצעות פרל אימפולס 2.0 תוכנה.
- שים את העכבר בעירום או מגולח לתא האינדוקציה הרדמה המכיל 2% isoflurane בחמצן. ודא עומק של מטוס הרדמה על ידי חוסר תנועת עכבר במהלך טיפול ועל ידי ניטור תדירות הנשימה (~ 1/sec).
- לאחר העכבר הוא הרדים, פתח את מגירת תרמי פרל, ולמקם את בעלי החיים על מיטת ההדמיה. להסיר במהירות את תקע חרטומו, והחלק את פרצופו של העכבר בתוך חרטומו כדי לשמור על העכבר תחת הרדמה (על ידי 2% isoflurane בחמצן מועבר ב2 ליטר / דקה בחרטומו) במהלך תהליך ההדמיה. ברגע שהעכבר נמצא במקום, לסגור את המגירה.
- כאשר המכשיר מצביע על "מוכן" בלוח תוכנת תמונה, לחץ על "הערוץ 700", "אור לבן" ו "85" קופסות ואחריו "מיקרון הכפתור לרכוש תמונה". ניר (עירור 685 ננומטר, פליטת 720 ננומטר)צילומי אור לבנים ד יובאו לאחר מכן באמצעות מיקוד וחשיפה אוטומטיים.
- כאשר ההקלטה הושלמה, פתח את המגירה, להפוך את העכבר, ולרכוש תמונות מזווית אחרת. העכבר יכול להיות ממוקם בחזיתו (הגחון), גב (גב) או בצדדים מול המצלמה. רצועות צרות של סרט יכולות לשמש כמעצורים למתוח את איבריו כדי לקבל את התצוגה הטובה ביותר של האזור של עניין (לדוגמא: כלוב צלעות, קרסוליים ופרקי ידות).
- זמן נכון לקיים ספיגת שלד של IR680-CMP הוא בין 24-96 הודעה שעה הזרקה (HPI), המבוסס על המינון (~ 4 nmol / עכבר). לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהות, להקריב את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם בזמן תחת הרדמה עמוקה אחרי 72 HPI, להסיר את העור (ושיער) באמצעות מלקחיים ומספריים כירורגיות, ואת תמונתו על ידי הקרינה ניר כפי שתואר לעיל.
- לנתח את תמונות הקרינה ניר הנרכשות.
2. ויזואליזציה של collagens בEx vivoסעיפים רקמות; 0
- הכנת חומר
- הכן 1 מיליליטר של 10% (w / v) פתרון BSA במי deionized. להפשיר 1 מיליליטר של סרום עז באמבט מים בטמפרטורת חדר. חותכים כמה חתיכות של Parafilm בגודל של כ -2 ס"מ x 5 סנטימטר.
- הכן 10 מיליליטר של חיץ חסימה על ידי ערבוב 500 μl של סרום עז, 1 מיליליטר של 10x PBS ו8.5 מיליליטר של מים deionized. הכן 5 מיליליטר של חיץ דילול CMP ידי דילול 50 μl של 10% (w / v) BSA עם 4.45 מיליליטר של מים deionized ו500 μl 10x PBS.
- לדלל פתרונות מניות של CMP כותרת carboxyfluorescein בכלוב, CF NB (לע"מ) 9 (480 מיקרומטר), עד 5 מיקרומטר באמצעות חיץ דילול CMP. ריכוז CMP אופטימלי משתנה 2.5-30 מיקרומטר, תלוי בסוג של רקמות ואת האופי של דגימות רקמה. נפח 100 μl מומלץ למכתים שקופיות קטע רקמה אחת. אחסן את solut CMP גובשיונים בחושך.
- בואו שקופיות רקמת קרנית העכבר לאזן לטמפרטורת חדר. דגירה השקופיות בPBS חיץ 1x למשך 5 דקות. רקמות קרנית העכבר המשמשות בהפגנה זו כבר התחילית עם paraformaldehyde 4% בפתרון PBS עבור שעה 1, cryopreserved ברקמות-Tek אוקטובר בינוני, cryosectioned עד 8 עובי מיקרומטר, רכוב על שקופיות זכוכית טעונות.
- צביעת רקמות והדמיה
- מניחים את השקופיות בתא humidified. לכל שקופית, להחיל 0.5 מיליליטר של פתרון חסימת דגירה השקופיות במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. הסר את פתרון החסימה ידי סופג את השקופיות על מגבת נייר.
- החל כ 100 μl של CF NB (לע"מ) 9 פתרונות כדי לכסות את חלקי רקמות של כל שקופית. דגירה השקופיות במשך 2 דקות, כדי לאפשר פתרון CMP לחלחל רקמות.
- הדלק את מנורת UV. כאשר הנורה התחממה, לחשוף את רקמת CMP המכוסה sections לאור UV במשך 6 דקות (365 ננומטר, ~ 8 mW / 2 סנטימטר) לdeprotect CMPs בכלוב. לאחר חשיפה לקרינת UV, לכסות את חלקי רקמות של כל שקופית עם חתיכת Parafilm כדי למנוע התייבשות. מניחים את השקופיות בתא humidified דגירה אותם ב-C ° 4 לשעה 2.
- הכן דילול 1:3,000 של פתרון DAPI ב 1x PBS. לאחר צביעת CMP, בעדינות להסיר את Parafilm עם מלקחיים, ולמחוק את השקופיות על מגבת נייר כדי להסיר את פתרון CMP עודף. החל כ 100 μl של פתרונות DAPI מדוללים לכל שקופית רקמות דגירה במשך 1 דקות בטמפרטורת חדר.
- לאחר צביעה, לטבול את שקופיות PBS חיץ 1x בצנצנת מכתים למשך 5 דקות. חזור 3x זה בטרי 1x PBS כדי לשטוף את הסוכנים מכתים מאוגדים.
- הוסף ירידה של מדיום גובר על קטע הרקמה ולכסות אותו עם להחליק את מכסה זכוכית, תוך הימנעות לכידת בועות אוויר. שים את השקופיות במגש שקופיות קרטון כדי להגן עליהם מפני אור.
- תמונת גדילי קולגן (ערוץ FITC) וגרעין תא (ערוץ DAPI) בשקופיות הרקמות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
Representative Results
איור 1 מציג תוצאה אופיינית של איך IR680-AHX-(לע"מ), מופעל על תמונה 9 מפיצה בעכבר עירום SKH1 הנשי בריא לאחר הודעה 24-96 שעה הזרקה. זה מראה הצטברות CMP לכאורה בשלד לאחר 24 HPI, ובשלב זה רוב פפטידים מאוגדים כבר פינה במידה רבה. התהליך של CMP והכלאה עם גדילי קולגן שיפוץ נראה איטי יחסית, במיוחד בניגוד לבדיקות אחרות הדמיה פפטיד (למשל RGD 16). זה ככל הנראה בגלל שיעור הקיפול האיטי של הסליל המשולש קולגן 17,18. עם זאת, לאחר הכלאה, גדילי CMP הם קשורים מאוד לרקמות collagenous, כמו שרק הפחתת אות קלה נתפס לאחר 24 HPI (איור 1). ב96 HPI, תמונת הקרינה NIR של העכבר לאחר הסרת העור מדגימה בבירור את ספיגת השלד של IR680-AHX-(לע"מ) 9 בעמוד השדרה וצלעות, כמו גם בתוך הברכיים, קרסוליים,פרקי ידיים, ולסתות התחתונות (איור 2 א).
בvivo לשעבר צביעת רקמות, CMPs כלוב fluorescently שכותרת-מופעל על תמונה במיוחד להכליא גדילי קולגן מפוגלים בסעיפי רקמות. באיור 3, מכתים CMP מגלה בבירור סיבי הקולגן במקביל הקנס בסטרומה של הקרנית, אשר מדגימה את השימוש בו כסוכן מכתים ספציפי קולגן.
איור 1. תמונות הקרינה ניר סידוריים של עכבר בעירום בהזרקה לווריד עם תמונה-decaged IR680-AHX-(לע"מ) 9 מראים ספיגת שלד על פני ארבעה ימים. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. תמונות הקרינה NIR של עכברים מנוהלים עם צילום decaged IR680-AHX-(לע"מ) 9 (א), בכלוב IR680-AHX-NB (לע"מ) 9 ללא חשיפה לקרינת UV (ב '), prefolded משולש סליל [IR680-AHX-(לע"מ ) 9] 3 (ג), או ניתק חום חד גדיל IR680-AHX-(לע"מ) 9 (ד ') בשעה 96 HPI לאחר הסרת עור. מיקוד שלד על ידי CMP ניתן לצפות רק בA ו-D. אותות הקרינה ניר מוצגים בקנה מידת קשת בענן. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. micrographs הקרינה של שיתוף עכברקטע רקמת rneal התחילית בparaformaldehyde, ומוכתם עם DAPI וCF-מופעל על תמונה (לע"מ) 9 באמצעות פרוטוקול 2, בו מוצגות stroma הצפוף collagenous (מוכתם על ידי CMP, בירוק), כמו גם אפיתל הסלולרי והאנדותל (מוכתם על ידי DAPI, בכחול ) (סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר).
Discussion
כפי שניתן לראות בפרוטוקול זה, המסירה של CMP היא פשוטה מאז UV-ההפעלה של CMPs בכלוב היא הצעד נוסף רק לפרוטוקולי הזרקה לוריד זנב הנפוץ 19. המפתח הוא להזריק את בדיקות פפטיד במדינה אחת הגדיל שברחה מכלוב וmetastable. קבוצת הכלוב מונעת CMP מהרכבה עצמית ומחייבת לcollagens (איור 2) עד להסרתו על ידי אור UV ובשלב CMP מתחיל לקפל לתוך סליל משולש. ניסוח ההזרקה מכיל ציסטאין, שיכול להגיב במהירות לקבוצת הכלוב ביקע במהלך קרינת UV כדי למזער את הרעילות. עכברים רבים עם זנים שונים (למשל SKH-1 ו-DR-1) נבדקו באמצעות ניסוח זה, ואנחנו לא מזהים כל ליקויי בריאות התנהגותיות או אחרים בעכברים אלו של עד שישה חודשים. אם הזריקה לא פעל מייד לאחר חשיפה לקרינת UV, CMPs יהיה לקפל לתוך סלילים משולשים homotrimeric, אשר אין להם יכולת הכלאה. איור 2C מציג מקרה קיצוני שבו לפני זריקת CMPs היו הורכב מחדש במלואו לתוך סלילים משולשים בזמן עיכוב (> 2 ימים). כדי לעקוף בעיה זו, פתרון CMP צריך להיות מוכן בריכוז נמוך יחסית (למשל ~ 40 מיקרומטר), והזריק לעכברים מייד לאחר UV-decaging. בגלל קצב האיטי סליל משולש קיפול של CMPs בתנאים לדלל (מחצית זמן של קיפול מחדש:> 50 דק ') ואת החשיפה לקרינת UV הקצרה וזמן הזרקה (5 ~ 7 דקות בסך הכל), רוב CMPs להיכנס למחזור הדם ביחיד גדיל טופס כאשר פרוטוקול זה ואחריו. הזריק פעם אחת, CMPs צפוי להישאר כאחת גדילים, כפי הריכוז מופחת בפקטור של 20 בבריכת הדם, מה שמוביל לירידה דרמטית בשיעור הרכבת 18. אם ההזרקה מתעכבת (למשל עקב טיפול בבעלי חיים) וrefolding homotrimeric חשוד, ניתן מחדש פפטידים התאספו באופן חלקי על ידי חימום למעל 7076; C לנתק CMPs לחד גדילים, ואחריו קירור והזרקה מיידיים. אמנם פחות נוח, CMPs-ניתק חום כזה גם להראות את התוצאות צפויות של in vivo מיקוד (איור 2 ד).
בהפגנה זו, עכברים בעירום שימשו לדימות פלואורסצנטי ניר כי עד 50% מאות ניר יכולים להיחסם על ידי שיער. כאשר עובד עם מודלים שיער עכבר (במיוחד את אלה עם שערות שחורות), אנו ממליצים על גילוח בעכבר באזור של עניין לפני ההדמיה באמצעות מכונת גילוח חשמלי או מסיר שיער. באיור 1, יש אותות חיוביים כוזבים מאזור הבטן של בעלי החיים, אשר נגרמת על ידי אוטומטי הקרינה של chlorophylls בתזונת בעלי החיים. אותות רקע מסוג זה יכול להיות הוריד באופן משמעותי על ידי מעבר העכבר כדי דיאטות מטוהרים כ -4 ימים לפני ההדמיה. כפי שניתן לראות באיורים 1 ו 2A, יש uptakes CMP החזק בספין הזנבדואר. לכן, כדי להימנע מחפצים הנובעים מזריקות וריד זנב לא מושלמות, אנו ממליצים הזרקה בחלק האחורי של הזנב, כך שאתר ההזרקה הוא לא נתפס בתמונה הקרינה.
CMP שהכותרת מאפשר מיקוד והדמיה של מיקומים ספציפיים של שיפוץ קולגן in vivo שקשה לזהות בשיטות אחרות. לדוגמא, מבחני דם ושתן מבוססי ELISA רגישים לברי telopeptide קולגן ביקע, אבל השיטה לא יכולה למקם את המקור ממחזור קולגן, משום שהיא מתמקדת באנטיגנים מסיסים. המגבלות העיקריות של in vivo טכניקת ההדמיה באמצעות ניר שכותרת CMPs הן הנחתה ומרווה בעומק של חדירה של תאים אדומים הפרוקסימלי נקווה כמו המוגלובין הוא מרווה אנדוגני של 680/710 צבעי ניר ננומטר. יישומים עתידיים של CMP בתחום ההדמיה vivo כוללים SPECT או PET הדמיה באמצעות CMPs שכותרתו עם אטומים רדיואקטיביים פולטות גמא ישירים או עם פוזיטרונים EMItters, לאבחון של מחלות מדינות מעורבים שיפוץ קולגן (לדוגמא אוסטיאופורוזיס, דלקת פרקים, טרשת עורקים, ופיברוזיס). אנלוגים CMP כותרת רדיו אלו יבטל את המגבלות של אובדן אות בשל עומק ונוכחותם של תאים אדומים ונקווה רקמות, ויאפשר מדידות כמותיות של רקמות חולות. בנוסף, הזמן מאוחר יחסית הדמיה (למשל 48-96 HPI) כתוצאה מהפינוי מחייב ואיטי של CMPs יכול לעשות את זה קשה לעקוב אחרי שינויים מהירים בשיפוץ קולגן. הגבלה כזו ניתן להתגבר על ידי הנדסה נוספת של קינטיקה והזיקה של סוכני הדמיה CMP המחייבים. מאז CMP נקשר collagens מפוגל שיש מבנה קטן, ההדמיה מבוססת קולגן CMP היא משלימה למיקרוסקופיה דור השנייה הרמוני אשר יכול רק סיבי קולגן תמונה 5.
כאשר מכתימים את חלקי רקמות עם CMPs fluorescently שכותרתו, מצאנו את זה מועיל כדי לדגורדגימות בפתרונות פפטיד הופעל-UV על 4 מעלות צלזיוס, כי הכלאת הסליל המשולשת היא הקל בטמפרטורה נמוכה 1,20. כמו כן, נמצא כי טבילת השקופיות בחיץ PBS טרי בצנצנת מכתים היא הדרך היעילה ביותר כדי לשטוף CMPs מאוגד, שעובד הרבה יותר טוב מאשר סתם pipetting מאגרי כביסה על הדגימות. הכלאת גדיל CMP-קולגן היא ספציפית מאוד וחזק, ולכן הפרוטוקול מכתים הפשוט שהוצג בסרטון הזה ניתן לשנות בקלות לcostaining סמנים ביולוגיים נוספים, ולזיהוי collagens המושפל בסעיפי רקמות מבולבל. זוהי אלטרנטיבה יעילה ונוחה לשימוש בנוגדנים נגד קולגן לאיתור collagens הסיבי בדגימות היסטולוגית שונות.
Disclosures
המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מודים גילברט ירוק לקבלת סיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מNIAMS / NIH (R01-AR060484) ומשרד ההגנה אמריקאי (W81XWH-12-1-0,555) הוענק לSMY, ומ-NIH (CA92871 U24 וU54 CA151838) הוענקו לMGP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IRdye 680RD Maleimide (IR680) | LI-COR | 929-71050 | Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere1. |
| 5(6)-Carboxyfluorescein | Sigma | 21877-5G-F | Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere12. |
| Cysteine | Advanced Chemtech | YC2200 | |
| Isoflurane | Butler Veterinary Supply | 4/4/5260 | |
| Goat Serum | Sigma | G9023-10ML | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma | A9647 | |
| DAPI | Roche Applied Science | 10236276001 | |
| Fluoroshield mounting medium | Sigma | F6182-20ML | |
| Syringes | BD | 329461 | |
| UV lamp | McMaster-Carr | 1447T17 | |
| Pearl impulse imager | LI-COR | 9400 | |
| Surgical forceps and scissors | |||
| EasyDip slide staining system | Light Labs | M900-12B | |
| 20-place cardboard microscope slide tray | Light Labs | ||
| Cover glasses | Fisher | 12-545-c | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE2000-E |
References
- Li, Y., et al. Targeting collagen strands by photo-triggered triple-helix hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14767-14772 (2012).
- Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nat. Med. 18, 1028-1040 (2012).
- Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment. Cell. 141, 52-67 (2010).
- Costa, A. G., Cusano, N. E., Silva, B. C., Cremers, S., Bilezikian, J. P. Cathepsin K: its skeletal actions and role as a therapeutic target in osteoporosis. Nat. Rev. Rheumatol. 7, 447-456 (2011).
- Perentes, J. Y., et al. et al. In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts. Nat. Methods. 6, 143-145 (2009).
- Breurken, M., Lempens, E. H. M., Meijer, E. W., Merkx, M. Semi-synthesis of a protease-activatable collagen targeting probe. Chem. Commun. 47, 7998-8000 (2011).
- Wang, A. Y., et al. Spatio-temporal modification of collagen scaffolds mediated by triple helical propensity. Biomacromolecules. 9, 1755-1763 (2008).
- Bächinger, H. P., Morris, N. P. Analysis of the thermal stability of type II collagen in various solvents used for reversed-phase high performance chromatography. Matrix. 10, 331-338 (1990).
- Li, Y., et al. Direct detection of collagenous proteins by fluorescently labeled collagen mimetic peptides. Bioconjugate Chem. 24, 9-16 (2013).
- Li, Y., Mo, X., Kim, D., Yu, S. M. Template-tethered collagen mimetic peptides for studying heterotrimeric triple-helical interactions. Biopolymers. 95, 94-104 (2011).
- Stahl, P. J., Cruz, J. C., Li, Y., Yu, S. M., Hristova, K. On-the-resin N-terminal modification of long synthetic peptides. Anal. Biochem. 424, 137-139 (2012).
- Wang, A. Y., Mo, X., Chen, C. S., Yu, S. M. Facile modification of collagen directed by collagen mimetic peptides. J. Am. Chem. Soc. 127, 4130-4131 (2005).
- Wang, A. Y., et al. Immobilization of growth factors on collagen scaffolds mediated by polyanionic collagen mimetic peptides and its effect on endothelial cell morphogenesis. Biomacromolecules. 9, 2929-2936 (2008).
- Mo, X., An, Y. J., Yun, C. S., Yu, S. M. Nanoparticle-assisted visualization of binding interactions between collagen mimetic peptide and collagen fibers. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 2267-2270 (2006).
- Chan, T. R., Stahl, P. J., Yu, S. M. Matrix-bound VEGF mimetic peptides: design and endothelial cell activation in collagen scaffolds. Adv. Funct. Mater. 21, 4252-4262 (2011).
- van Hagen, P. M., et al. Evaluation of a radiolabelled cyclic DTPA-RGD analogue for tumour imaging and radionuclide therapy. Int. J. Cancer. 90, 186-198 (2000).
- Boudko, S., et al. Nucleation and propagation of the collagen triple helix in single-chain and trimerized peptides: transition from third to first order kinetics. J. Mol. Biol. 317, 459-470 (2002).
- Ackerman, M. S., et al. Sequence dependence of the folding of collagen-like peptides. J. Biol. Chem. 274, 7668-7673 (1999).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- Brodsky, B., Persikov, A. V. Molecular structure of the collagen triple helix. Adv. Prot. Chem. 70, 301-339 (2005).
