Summary
Dieses Verfahren zeigt, in vivo nahen IR-Fluoreszenz-Imaging von Kollagen Umbau-Aktivitäten bei Mäusen als auch ex vivo Färbung der Kollagene in Gewebeschnitten mit Käfig Kollagen-mimetischen Peptide, die sein Foto-ausgelöst, um mit denaturierten Kollagenstränge hybridisieren.
Abstract
Kollagen ist ein Hauptstrukturbestandteil der extrazellulären Matrix, die Gewebebildung und Wartung unterstützt. Obwohl Kollagen Umbau ist ein integraler Bestandteil der normalen Gewebeerneuerung, wird eine übermäßige Menge des Remodeling-Aktivität in Tumoren, Arthritis und vielen anderen pathologischen Zuständen beteiligt. Während Kollagen Umbau wird der Dreifach-Helix-Struktur der Kollagenmoleküle durch Proteasen, die in der extrazellulären Umgebung gestört. Darüber hinaus werden in vielen histologischen Gewebeproben vorhanden Kollagene teilweise durch die Fixierung und Konservierung Verfahren denaturiert. Daher können diese denaturiert Kollagenstränge als wirksame Ziele für biologische Bildgebung dienen. Wir haben vorher entwickelte ein Käfig Kollagen mimetischen Peptid (CMP), die Foto-ausgelöst, um mit denaturierten Kollagenstränge durch Bildung von Dreifach-Helix-Struktur, die einzigartig für Kollagene ist hybridisieren können. Die allgemeinen Ziele dieses Verfahrens sind i) die Bild denaturierte Kollagenstränge resulting Umbau von normalen Aktivitäten in vivo, und ii) die Kollagene in ex-vivo-Gewebeschnitten mit Hilfe der Foto-caged ausgelöst CMPs visualisieren. Um eine wirksame Hybridisierung und in vivo und ex vivo-Bildgebung erfolgreich zu erreichen, sind fluoreszierend markierten Caged CMPs entweder photoaktivierten unmittelbar vor der intravenösen Injektion oder direkt an Gewebeschnitten aktiviert. Normale Skelett Kollagen Umformung in Nacktmäusen und Kollagene in vorangestellten Maus Hornhaut Gewebeschnitte werden in diesem Verfahren abgebildet. Die bildgebende Verfahren auf der Basis des CMP-Kollagen-Hybridisierungstechnologie hier vorge könnte zu einem tieferen Verständnis der Gewebeumbauprozess führen, sowie die Möglichkeit der Entwicklung neuer Diagnostika für Erkrankungen mit hohem Kollagenumbau Aktivität.
Introduction
Kollagen, das häufigste Protein in Säugetier, spielt eine kritische Rolle bei der Gewebeentwicklung und Regeneration durch Unterstützung der Proliferation und Differenzierung von Zellen. Während faserige Kollagen (z. B. Typ I, II), in Bindegewebe mechanische Festigkeit zu geben, um das Gewebe, das netzartige Kollagen (Typ IV) bilden Grundgerüst der Basalmembran, wo Zellen befestigen und bilden organisierten Geweben. Collagen Umbau beinhaltet sowohl Kollagenabbau (durch Proteasen) und Synthese (durch Wachstumsfaktoren gefördert). Obwohl Kollagen Umbau, beispielsweise im Knochen, ist Teil der normalen Gewebeerneuerung, Über Umbau Tätigkeit oder sein Auftreten in abnormalen Stellen, in der Regel an Wundheilungsantwort auf eine Verletzung oder chronischen pathologischen Zuständen, wie Krebs, Osteoporose, Arthritis, und 1-4 Fibrose. Die Möglichkeit, direkt Bild Kollagene Umbau in vivo unterziehen konnte, um das Verständnis des Fortschritts führenIonen dieser Krankheiten, sowie neue Diagnostika und Therapeutika. Zum Beispiel kann die Bildgebung liefern Informationen über die Schwere und den Ort der Krankheiten, und kann auch verwendet werden, um die Wirksamkeit von neuen therapeutischen Mitteln zu beurteilen. Multiphotonen-Laser-Scanning-Mikroskopie und der Erzeugung der zweiten Harmonischen haben fibrillären Kollagene Bild für die Überwachung der extrazellulären Matrix der Tumor Umbau in lebenden Mäusen 5 angewendet worden. Diese Technik erfordert jedoch Tiere mit transparenten Rückenhautkammern angebracht werden, die ein invasives Verfahren ist. Direkte und nicht-invasive Bildgebung von Kollagen Umbau wird von einer Sonde, die speziell auf Kollagen unterziehen Umbau profitieren. Solche Sonde ist schwierig herzustellen, da es braucht, um die Umbau-Kollagene von den intakten und reifen Kollagene, die reichlich in normalen Geweben 6 unterscheiden.
Collagen besteht aus extrem seltene Proteinstruktur namens Triple-Helix, die ist gemachtdurch Proteasen, wie Matrix-Metalloproteinasen (MMP), während Kollagen Umbau gespalten. Die gespaltenen Kollagenfragmente verlieren ihr Triple-Helix-Struktur und werden aufgeklappt Stränge (Gelatine), die weiter durch unspezifische Proteasen 1 verdaut werden. Es wurde vor kurzem entdeckt, dass das Kollagen-mimetischen Peptid (CMP), die die Neigung, in Triple-Helix-Struktur zu falten hat, kann gezielt Kollagenstränge, die aus ihrer Triple-Helix-Zustand entweder durch Hitzedenaturierung oder durch enzymatischen Abbau 1,7 dissoziiert sind. Die Bindung wird in erster Linie durch Triple-Helix-Hybridisierung zwischen monomeren CMPs und die denaturierten Kollagenstränge angetrieben. Da CMPs Selbstorganisation homotrimeres Dreifachhelices bei Raumtemperatur mit wenig Antriebskraft für Kollagen-Hybridisierung, ein gefangener CMP [(GPO) 4 NB GPO (GPO) 4, wie NB (GPO) 9 bezeichnet, O: Hydroxyprolin] wurde entwickelt, , die enthält eine Foto-spaltbare NitrobenzylGruppe (NB) an die zentrale Glycin des Peptids gebunden. Die NB Käfig Gruppe sterisch verhindert, dass die CMP von Falten in Dreifach-Helix, doch die Entfernung der Käfig Gruppe durch UV-Bestrahlung löst sofort die Triple-Helix-Falt-und Kollagen-Hybridisierung ein. Wenn monomere CMPs mit nahem Infrarot (NIR) Fluorophoren markiert sind systemisch geliefert Mausmodell, können sie gezielt und damit in vivo Bildgebung von denaturiertem Kollagen in Gewebe, normale (z. B. in Knochen und Knorpel) und pathologischen (z. B. in Tumoren) Umbau 1 .
Fluoreszierend markierten CMPs auch zum Abbilden Kollagene in histologischen Gewebeschnitten eingesetzt werden. In histologischen Untersuchung geerntet Gewebe oft durch Fixierung aufbewahrt, um die Zellkomponenten und Gesamtgewebemorphologie von Verschlechterung zu halten. Die Befestigungsverfahren, die Wärme, und die Behandlung mit organischen Lösungsmitteln und chemischen Quer linkin umfasseng Reagenzien (z. B. Para), denaturieren die Triple-Helix-Struktur des Kollagens 8. Diese Denaturierung erzeugt Standorte für CMP-Hybridisierung. Es hat sich gezeigt, dass fluoreszenzmarkierte CMPs spezifisch an Kollagen zu binden in Gewebeschnitten (z. B. Haut, Hornhaut und Knochen) noch wirksamer als ein Anti-Kollagen-Antikörper, der eine leichte Identifizierung von pathologischen Zuständen in fibrotischen Lebergewebe 9 erlaubt. Die CMP zielt denaturierte Kollagenstränge Aminosäuresequenz von Tripelhelix-Motive, die für alle Arten von Kollagenen ist, enthält. Daher CMP kann als Breitspektrum-Kollagen Färbemittel werden. Hier präsentieren wir detaillierte experimentelle Verfahren für i) die Abbildung denaturierte Kollagenstränge in vivo und ii) Visualisierung Kollagene in ex-vivo-Gewebeschnitten mit Fluoreszenz-markierten caged CMPs. Ein NIR-Tag, IR680, wurde der Käfig CMP für Live-Imaging, whil konjugiertE Carboxyfluorescein (CF) wurde in Gewebefärbung Arbeit für die Kompatibilität mit Standard-Fluoreszenzmikroskopen eingesetzt. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Anwendung von bildgebenden CMPs als nahe an Kollagen Umbau. Methoden für die CMP-Synthese kann in früheren Berichten 1,7,9-15 gefunden werden. In diesem Video-Bericht wurden Imaging Skelettgewebe in normalen Mäusen und Gewebeschnitten von Maushornhaut zu Demonstrationszwecken gewählt, aber die hier vorgestellten Verfahren können leicht zu vielen Krankheiten und biologische Modelle, die Kollagen-Umbau (z. B. Tumoren, Wundheilung) angewendet werden, wie sowie zu fast jedem voranGewebeProbe, die Kollagene enthält.
Protocol
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Vorschriften der Johns Hopkins Animal Care und Verwenden Ausschuss vorgenommen.
1. Nah-Infrarot (NIR)-Fluoreszenz-Imaging von Skelett Kollagen Remodeling In-vivo-
- Photo-Aktivierung der Käfig CMP und Schwanzveneninjektion
- Bereiten Sie 110 ul Käfig CMP-Lösung für jede Maus (20-30 g Mausgewicht): 100 ul Lösung zum Dosieren, mit einem zusätzlichen 10 ul Kissen für den möglichen Verlust bei der Übertragung und Einspritzung. Mischen Sie 11 ul IR680-Ahx-NB (GPO) 9 stock-Lösung (400 uM) mit 11 ul 100 uM Cystein in sterile PBS-Lösung, dann bringen Sie das Gesamtvolumen auf 110 ul mit 1x PBS-Puffer. Die endgültige Peptid-Lösung enthält 4 nmol IR680-Ahx-NB (GPO) 9 und 1 nmol Cystein in 100 ul 1x PBS-Lösung.
- Langsam withdraw der Peptid-Lösung in einer 0,5 ml Insulinspritze mit transparentem Schaft und einem kleinen Messgerät (28-30 G) Nadel und vorsichtig die Luftblasen. Schalten Sie die UV-Lampe, um die Lampe zum Aufwärmen für 2-5 min.
- Legen Sie die peptidhaltige Spritze direkt unter der UV-Lampe (365 nm,> 25 mW / cm 2) für 5 min auf Foto-Aktivierung zu ermöglichen.
- Inzwischen, positionieren Sie die Maus in einem Rückhalte unter einem beheizten Lampe; beschriften Sie die Maus mit einem Permanentmarker auf den Schwanz oder andere Identifikationsmethoden wie Ohrmarke oder Zehen Tätowierung, und desinfizieren den Schwanz mit 70% Alkohol.
- Unmittelbar nach der UV-Aktivierung, injizieren 100 ul UV-aktivierten IR680-Ahx-NB (GPO) 9-Lösung in die Schwanzvenen, bevorzugt an den hinteren Teil des Schwanzes. Platzieren Sie die Maus zurück in den Käfig nach der Injektion.
- NIR-Fluoreszenz-Imaging von Kollagen Remodeling Aktivität
- Setdie Heizplatte der Abbildungsschicht des Abbildungsimpuls bis 37 ° C unter Verwendung von Perlen Impulse 2.0-Software.
- Setzen Sie die nackt oder rasierte Maus in die Narkose Kammer mit 2% Isofluran in Sauerstoff. Verifizierung der Narkosetiefe-Ebene durch fehlende Bewegung der Maus während der Handhabung und durch Überwachen der Frequenz der Atmung (~ 1/sec).
- Nachdem die Maus narkotisiert, öffnen Sie die Perle Imager Schublade, und legen Sie das Tier auf dem Aufnahmebett. Schnelles Entfernen der Nasenkegel Stecker, und schieben Sie die Maus Mündung in der Nase Kegel, um die Maus in Narkose (um 2% Isofluran in Sauerstoff bei 2 l / min durch die Nase Kegel geliefert) während des Abbildungsprozesses zu halten. Sobald die Maus vorhanden ist, schließen Sie die Schublade.
- Wenn das Gerät zeigt "ready" auf dem Image-Software-Panel, klicken Sie auf die "700-Kanal", "weißes Licht" und "85 Mikrometer"-Boxen, gefolgt von der "Bild erwerben" klicken. NIR (Anregung 685 nm, Emission 720 nm) eind Weißlicht-Fotos werden dann mit Hilfe der automatischen Fokussierung und Belichtung genommen werden.
- Wenn die Aufnahme beendet ist, öffnen Sie die Schublade, drehen Sie die Maus, und die Bilder aus einem anderen Winkel zu erwerben. Die Maus kann mit seinem vorderen (ventralen), Rücken (dorsal) oder an den Seiten vor der Kamera platziert werden. Schmale Streifen Klebeband verwendet werden, wie Fesseln um seine Gliedmaßen strecken, um den besten Blick auf die Region von Interesse (zB Brustkorb, Knöchel und Handgelenke) erhalten werden.
- Eine richtige Zeit, um Skelett Aufnahme von IR680-CMP beobachten, ist zwischen 24 bis 96 Stunden nach der Injektion (hpi), bezogen auf die Dosierung (~ 4 nmol / Maus). Um hochauflösende Bilder zu erwerben, zu opfern, die Maus durch Genickbruch während unter tiefer Narkose nach 72 hpi, entfernen Sie die Haut (und Haar) mit chirurgischen Pinzette und Schere, und Bild es durch NIR-Fluoreszenz wie oben beschrieben.
- Analysieren Sie die erworbenen NIR-Fluoreszenzbilder.
2. Visualisierung der Kollagene in der Ex-vivo-0; Gewebeschnitte
- Materialaufbereitung
- Herstellung von 1 ml 10% (w / v) BSA-Lösung in entionisiertem Wasser. Auftauen 1 ml Ziegenserum in einem Wasserbad bei Raumtemperatur. Schneiden Sie ein paar Stücke von Parafilm in der Größe von ca. 2 cm x 5 cm.
- Vorbereitung 10 ml Blockierungspuffer durch Mischen von 500 &mgr; l Ziegen-Serum, 1 ml 10-fach PBS und 8,5 ml entionisiertem Wasser. Vorbereitung 5 ml CMP-Verdünnungspuffer durch Verdünnung von 50 ul 10% (w / v) BSA mit 4,45 ml entionisiertes Wasser und 500 &mgr; l 10 × PBS.
- Verdünnen Stammlösungen von Carboxy-markierten caged CMP, CF NB (GPO) 9 (480 uM), bis 5 uM mit dem CMP-Verdünnungspuffer. CMP optimale Konzentration variiert von 2,5 bis 30 &mgr; M, abhängig von der Art des Gewebes und der Art der Gewebeproben. Ein Volumen von 100 &mgr; l für die Färbung einer Gewebesektion Schieber empfohlen. Bewahren Sie das formuliert CMP SOLUTIonen in der Dunkelheit.
- Lassen Sie die Maushornhautgewebe gleitet ins Gleichgewicht auf Raumtemperatur. Die Folien Inkubation in 1x PBS-Puffer für 5 min. Die in diesem Beispiel verwendeten Maus Hornhaut Gewebe wurden mit 4% Paraformaldehyd in PBS-Lösung für 1 h, kryokonserviert in Tissue-Tek Oktober mittel, bis 8 um Dicke kryogeschnitten vorangestellt worden ist, und auf Glasobjektträger geladen montiert.
- Gewebefärbung und Imaging
- Objektträger in einer feuchten Kammer. Zu jeder Folie, gelten 0,5 ml Blockierlösung und Inkubation der Objektträger für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Blocking-Lösung durch Abtupfen die Folien auf einem Papiertuch.
- Bewerben etwa 100 ul CF NB (GPO) 9 Lösungen, um die Gewebeschnitte der einzelnen Folien abzudecken. Die Objektträger für 2 min inkubiert, damit der CMP-Lösung, um das Gewebe zu durchdringen.
- Schalten Sie die UV-Lampe. Wenn die Lampe aufgewärmt ist, setzen die CMP-Gewebe bedeckt sections dem UV-Licht für 6 min (365 nm, ~ 8 mW / cm 2), um die Käfig CMPs entschützen. Nach der UV-Exposition, decken die Gewebeschnitte der einzelnen Folien mit einem Stück Parafilm Austrocknen zu verhindern. Objektträger in der feuchten Kammer inkubiert und diese bei 4 ° C für 2 Stunden.
- Bereiten Sie eine Verdünnung von 1:3000 DAPI-Lösung in 1x PBS. Nach CMP-Färbung, entfernen Sie vorsichtig die Parafilm mit einer Pinzette, und tupfen Sie die Folien auf einem Papiertuch, um überschüssige CMP-Lösung zu entfernen. Gelten etwa 100 ul verdünnte Lösungen DAPI jedem Gewebe Schlitten und Inkubation für 1 min bei Raumtemperatur.
- Nach der Färbung, tauchen die Folien in 1x PBS-Puffer in einer Küvette für 5 min. Wiederholen Sie diesen 3x in frischem 1x PBS zu waschen ungebundenen Färbemittel.
- Einen Tropfen Eindeckmedium auf dem Gewebeschnitt und decken Sie es mit einem Deckglas unter Vermeidung von Luftblasen. Legen Sie die Folien in einem Karton Diamagazin, um sie vor Licht zu schützen.
- Bild die Kollagenstränge (FITC Kanal) und Zellkerne (DAPI-Kanal) in den Gewebeschnitten mit einem Fluoreszenzmikroskop.
Representative Results
Abbildung 1 zeigt ein typisches Ergebnis, wie Foto-ausgelöst IR680-Ahx-(GPO) 9 verteilt in einer gesunden weiblichen SKH1 Nacktmaus nach 24-96 Stunden nach der Injektion. Es zeigt offensichtlich CMP Akkumulation im Skelett nach 24 hpi, an welchem Punkt die meisten von ungebundenen Peptide wurden weitgehend ausgeräumt. Der Prozess der CMP Hybridisierung mit den Umbau Kollagenstränge scheint relativ langsam, insbesondere im Gegensatz zu anderen Peptid Bildgebungssonden (zB RGD-16). Dies ist wahrscheinlich wegen der langsamen Faltungsrate des Collagentripelhelix 17,18. Allerdings, wenn hybridisiert, die CMP-Stränge sind stark auf die Kollagengewebe gebunden, da nur geringe Signalreduktion nach 24 hpi (Abbildung 1) zu sehen. Bei 96 hpi, die NIR-Fluoreszenzbild mit der Maus nach Hautentfernung deutlich die Skelett Aufnahme von IR680-Ahx-(GPO) 9 in Wirbelsäule und Rippen, sowie in den Knie, Knöchel,Handgelenke und Unterkiefer (Abbildung 2A).
In Ex-vivo-Gewebefärbung, Foto ausgelöst fluoreszenzmarkierten caged CMPs spezifisch hybridisieren an denaturierte Kollagenstränge in Gewebeschnitten. In Fig. 3 zeigt CMP Färbung deutlich die feinen parallelen Kollagenfasern in der Cornea-Stroma, die seine Verwendung als Kollagen spezifischen Färbemittel zeigt.
Abbildung 1. Serielle NIR-Fluoreszenzbilder einer nackten Maus intravenös mit Foto decaged IR680-Ahx-(GPO) verabreicht 9, die Skelettaufnahme über vier Tage. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
2. NIR-Fluoreszenzbilder von Mäusen mit Foto-decaged IR680-Ahx-(GPO) verabreicht 9 (A), Stuben IR680-Ahx-NB (GPO) 9 ohne UV-Bestrahlung (B), vorgefaltet tripelhelicalen [IR680-Ahx-(GPO ) 9] 3 (C), oder Wärme dissoziiert Einzelstrang-IR680-Ahx-(GPO) 9 (D) bei 96 hpi nach Hautentfernung. Skeletal Targeting von der CMP kann nur in A und D beobachtet werden. NIR-Fluoreszenzsignale werden in den Regenbogen Maßstab dargestellt. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
3. Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen einer Maus Corneal Gewebeschnitt in Paravorangestellt und mit DAPI und Foto ausgelöst CF (GPO) gefärbt 9 unter Verwendung des Protokolls Nr. 2, zeigt dichten kollagenen Stroma (CMP befleckt, in grün) sowie zelluläre Epithel und Endothel (von DAPI gefärbt, in blau ) (Maßstab: 100 um).
Discussion
Wie in diesem Protokoll zu erkennen ist, ist die Lieferung von CMP einfach, da die UV-Aktivierung der photoaktivierbaren CMP ist die einzige zusätzliche Schritt den gemeinsamen Schwanzveneninjektion Protokolle 19. Der Schlüssel ist, um die Peptid-Sonden in einem metastabilen uncaged und Einzelstrang-Zustand zu injizieren. Der Käfig verhindert, dass CMP Gruppe von Selbstorganisation und der Bindung an Kollagene (2B), bis sie durch UV-Licht, an welcher Stelle der CMP beginnt, in Dreifach-Helix falten wird entfernt. Die Injektion Formulierung enthält Cystein, das schnell mit der Gruppe gespalten Käfig bei UV-Bestrahlung reagieren können, um die Toxizität zu minimieren. Zahlreiche Mäuse mit verschiedenen Stämmen (zB SKH-1 und DR-1) wurden unter Verwendung dieser Formulierung getestet und wir konnten keine Verhaltens-oder andere gesundheitliche Mängel in diesen Mäusen erkennen, bis zu sechs Monate. Wenn die Injektion nicht unmittelbar nach UV-Exposition zu folgen, wird die CMPs in homotrimeres Dreifachhelices falten, die keine Hybridisierung Kapazität. 2C zeigt einen extremen Fall, in dem vor der Injektion die CMPs wurden vollständig in Triple-Helices durch lange Verzögerungszeit (> 2 Tage) wieder zusammengesetzt. Um dieses Problem zu umgehen, sollte CMP-Lösung in relativ niedriger Konzentration (z. B. ~ 40 &mgr; M) hergestellt werden, und unmittelbar nach der UV-decaging in die Mäuse injiziert. Aufgrund der langsamen Dreifachhelix Klapprate der CMPs in verdünnter Bedingungen (Halbzeit der Rückfaltung:> 50 min) und der kurzen UV-Exposition und Einspritzzeit (5 ~ 7 Minuten insgesamt), die meisten der CMPs in die Blutbahn im Einzel Strang bilden, wenn dieses Protokoll gefolgt. Nach der Injektion CMPs werden erwartet, um als Einzelstränge bleiben, da die Konzentration um den Faktor 20 in der Blut-Pool reduziert, was zu dramatischen Reduzierung der Zusammenbau Rate 18. Wenn Einspritzung verzögert wird (z. B. durch Behandlung der Tiere) und homotrimeren Rückfaltung vermutet wird, die teilweise zusammengesetzten Peptide können durch Erwärmen über 70 reaktiviert76; C, um die CMPs um Einzelstränge, gefolgt von Aufforderung Kühlung und Einspritzung zu distanzieren. Obwohl weniger bequem, wie Wärme-dissoziiert CMPs zeigen auch die erwarteten Ergebnisse der in-vivo-Targeting (2D).
In dieser Demonstration wurden Nacktmäusen für NIR-Fluoreszenzbildgebung verwendet werden, da bis zu 50% des NIR-Signals durch Haar blockiert werden. Bei der Arbeit mit haarige Maus-Modellen (vor allem die, die mit schwarzen Haaren), empfehlen wir Rasieren der Maus in die Region von Interesse vor der Bildgebung mit einem elektrischen Rasierer oder Haar Entferner. In Fig. 1 sind falsch positive Signale von Bauchbereich des Tieres, die von Autofluoreszenz der Chlorophylle in der Tierernährung verursacht wird. Solche Hintergrundsignale können durch Umschalten der Maus gereinigt Diäten etwa 4 Tage vor der Bilderzeugung erheblich gesenkt werden. Wie in den 1 und 2A zu sehen ist, gibt es starke CMP Aufnahmen im TrudelnE. Deshalb, um Artefakte aus unvollkommenen Schwanzvene Injektionen zu vermeiden, empfehlen wir die Injektion am hinteren Teil des Schwanzes, so dass die Injektionsstelle nicht im Fluoreszenzbild eingefangen.
Das markierte CMP ermöglicht Targeting und Bildgebung von bestimmten Orten von Kollagen Umbau in vivo, die schwer zu erkennen, mit anderen Methoden. Zum Beispiel die ELISA-basierten Blut-und Urintests sind empfindlich für Kollagen-Telopeptid gespaltenen Fragmente, aber das Verfahren kann die Quelle des Kollagen Umsatz nicht lokalisieren, da es zielt löslichen Antigenen. Die Haupteinschränkungen der in vivo Bildgebungsverfahren unter Verwendung von NIR-markierten CMPs sind Tiefenpenetrationsdämpfung und Dämpfung durch proximale gepoolt Erythrozyten Hämoglobin ist ein endogener Quencher von 680/710 nm NIR-Farbstoffe. Zukünftige Anwendungen von CMP in-vivo-Bildgebung sind SPECT-oder PET-Bildgebung mit CMPs mit direktem gamma-emittierende Radionuklide oder Positronen mit emi beschriftettters für diagnostische Krankheitszuständen, die Kollagen Umbau (z. B. Osteoporose, Arthritis, Atherosklerose und Fibrose). Diese radioaktiv markierten CMP-Analoga werden die Grenzen der Signalverlust durch Gewebetiefe und Präsenz von gepoolten roten Zellen zu beseitigen, und die quantitativen Messungen von erkranktem Gewebe zu ermöglichen. Darüber hinaus ist die relativ spät Belichtungszeit (zB 48-96 hpi), die aus dem langsamen Bindungs und die Räumung von CMPs könnte es schwierig machen, auf schnelle Veränderungen in Kollagen Umbau folgen. Diese Einschränkung könnte durch weitere Engineering der Bindungsaffinität von Kinetik und CMP-Bildgebungsmittel überwunden werden. Seit CMP bindet an denaturierte Kollagene, die wenig Struktur haben, ist der CMP-basierten Kollagen Bildgebung zur Erzeugung der zweiten Harmonischen Mikroskopie, die nur Bildkollagenfasern können 5 komplementär.
Wenn Färbung Gewebeschnitte mit fluoreszenzmarkierten CMPs, fanden wir es von Vorteil, die InkubationProben für die UV-aktivierte Peptidlösungen bei 4 ° C, weil der dreifach helikalen Hybridisierung bei niedriger Temperatur 1,20 erleichtert. Es wurde auch festgestellt, dass das Eintauchen der Objektträger in frischem PBS-Puffer in einer Küvette ist der effektivste Weg, um abzuwaschen ungebundenen CMPs, die viel besser als nur Pipettieren Waschpuffer über die Proben funktioniert. Die CMP-Kollagen-Strang-Hybridisierung ist sehr spezifisch und stabil, daher die in diesem Video präsentiert einfache Färbeprotokoll leicht für costaining weitere Biomarker modifiziert werden, und zum Identifizieren abgebauten Kollagen in unfixierten Gewebeschnitten. Dies ist eine wirksame und praktische Alternative zur Verwendung von Anti-Kollagen-Antikörpern zum Nachweis von Faser Kollagene in verschiedenen histologischen Proben.
Disclosures
Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich Gilbert Grün für technische Hilfe. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus NIAMS / NIH (R01-AR060484) und DOD (W81XWH-12-1-0555), um SMY ausgezeichnet und vom NIH (U24 und U54 CA92871 CA151838) zu vergeben MGP unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IRdye 680RD Maleimide (IR680) | LI-COR | 929-71050 | Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere1. |
| 5(6)-Carboxyfluorescein | Sigma | 21877-5G-F | Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere12. |
| Cysteine | Advanced Chemtech | YC2200 | |
| Isoflurane | Butler Veterinary Supply | 4/4/5260 | |
| Goat Serum | Sigma | G9023-10ML | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma | A9647 | |
| DAPI | Roche Applied Science | 10236276001 | |
| Fluoroshield mounting medium | Sigma | F6182-20ML | |
| Syringes | BD | 329461 | |
| UV lamp | McMaster-Carr | 1447T17 | |
| Pearl impulse imager | LI-COR | 9400 | |
| Surgical forceps and scissors | |||
| EasyDip slide staining system | Light Labs | M900-12B | |
| 20-place cardboard microscope slide tray | Light Labs | ||
| Cover glasses | Fisher | 12-545-c | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE2000-E |
References
- Li, Y., et al. Targeting collagen strands by photo-triggered triple-helix hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14767-14772 (2012).
- Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nat. Med. 18, 1028-1040 (2012).
- Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment. Cell. 141, 52-67 (2010).
- Costa, A. G., Cusano, N. E., Silva, B. C., Cremers, S., Bilezikian, J. P. Cathepsin K: its skeletal actions and role as a therapeutic target in osteoporosis. Nat. Rev. Rheumatol. 7, 447-456 (2011).
- Perentes, J. Y., et al. et al. In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts. Nat. Methods. 6, 143-145 (2009).
- Breurken, M., Lempens, E. H. M., Meijer, E. W., Merkx, M. Semi-synthesis of a protease-activatable collagen targeting probe. Chem. Commun. 47, 7998-8000 (2011).
- Wang, A. Y., et al. Spatio-temporal modification of collagen scaffolds mediated by triple helical propensity. Biomacromolecules. 9, 1755-1763 (2008).
- Bächinger, H. P., Morris, N. P. Analysis of the thermal stability of type II collagen in various solvents used for reversed-phase high performance chromatography. Matrix. 10, 331-338 (1990).
- Li, Y., et al. Direct detection of collagenous proteins by fluorescently labeled collagen mimetic peptides. Bioconjugate Chem. 24, 9-16 (2013).
- Li, Y., Mo, X., Kim, D., Yu, S. M. Template-tethered collagen mimetic peptides for studying heterotrimeric triple-helical interactions. Biopolymers. 95, 94-104 (2011).
- Stahl, P. J., Cruz, J. C., Li, Y., Yu, S. M., Hristova, K. On-the-resin N-terminal modification of long synthetic peptides. Anal. Biochem. 424, 137-139 (2012).
- Wang, A. Y., Mo, X., Chen, C. S., Yu, S. M. Facile modification of collagen directed by collagen mimetic peptides. J. Am. Chem. Soc. 127, 4130-4131 (2005).
- Wang, A. Y., et al. Immobilization of growth factors on collagen scaffolds mediated by polyanionic collagen mimetic peptides and its effect on endothelial cell morphogenesis. Biomacromolecules. 9, 2929-2936 (2008).
- Mo, X., An, Y. J., Yun, C. S., Yu, S. M. Nanoparticle-assisted visualization of binding interactions between collagen mimetic peptide and collagen fibers. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 2267-2270 (2006).
- Chan, T. R., Stahl, P. J., Yu, S. M. Matrix-bound VEGF mimetic peptides: design and endothelial cell activation in collagen scaffolds. Adv. Funct. Mater. 21, 4252-4262 (2011).
- van Hagen, P. M., et al. Evaluation of a radiolabelled cyclic DTPA-RGD analogue for tumour imaging and radionuclide therapy. Int. J. Cancer. 90, 186-198 (2000).
- Boudko, S., et al. Nucleation and propagation of the collagen triple helix in single-chain and trimerized peptides: transition from third to first order kinetics. J. Mol. Biol. 317, 459-470 (2002).
- Ackerman, M. S., et al. Sequence dependence of the folding of collagen-like peptides. J. Biol. Chem. 274, 7668-7673 (1999).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- Brodsky, B., Persikov, A. V. Molecular structure of the collagen triple helix. Adv. Prot. Chem. 70, 301-339 (2005).
