Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Открытие новых внутриклеточных патогенов на Amoebal сокультивирования и подходов Amoebal обогащению

Published: October 27, 2013 doi: 10.3791/51055
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Microbiology, University Hospital Center and University of Lausanne

Summary

Amoebal сокультивирования это система культуры клеток с помощью клейкого амеб выборочно растут внутриклеточных возбудителей способны противостоять фагоцитарные клетки, такие как амебы и макрофагов. Таким образом, он представляет собой ключевой инструмент для себя новые инфекционные агенты. Amoebal обогащение позволяет открытие новых amoebal видов и их специфических внутриклеточных бактерий.

Abstract

Внутриклеточных патогенов, таких как легионеллы, микобактерий и Chlamydia-подобных организмов трудно выделить, потому что они часто растут плохо или вообще не на селективной среде, которые обычно используются для выращивания бактерий. По этой причине, многие из этих патогенов были обнаружены только недавно или после важных вспышек. Эти патогены часто связаны с амеб, которые служат клетке-хозяине и позволить выживание и рост бактерий. Мы намерены здесь, чтобы предоставить демонстрацию двух методов, которые позволяют выделение и характеристика внутриклеточных патогенов присутствует в клинических или проб окружающей среды: amoebal сокультивирования и amoebal обогащению. Amoebal сокультивирования позволяет восстановление внутриклеточных бактерий путем посева исследуемого образца на качестве amoebal газон, который может быть заражен и лизируют внутриклеточных бактерий, присутствующих в образце. Amoebal обогащение позволяет восстановление амеб присутствует в клинических или окружающей образца. Чтбудет может привести к открытию новых amoebal видов, но и новых внутриклеточных бактерий, растущих в частности, в этих амеб. Вместе эти два методы помогают открыть для себя новые внутриклеточные бактерии, способные расти в амеб. Из-за их способности инфицировать амебы и противостоять фагоцитоз, эти внутриклеточных бактерий также может избежать фагоцитоз макрофагов и, таким образом, быть патогенными для высших эукариот.

Introduction

До появления молекулярной диагностики, микроорганизмы, присутствующие в окружающей среде нишах или в клинических образцах часто обнаруживается путем культивирования их на разных селективных средах, в основном на агар в чашках Петри. Фенотип бактериальных колоний и их метаболической активности бактерий затем дают классификацию на видовом уровне. Бульон также могут быть использованы для повышения чувствительности детектирования. Тем не менее, оба метода не позволяют восстановление бактерий, которые растут медленно или вообще не на этих средах. Это причина, почему молекулярные подходы так широко используется в настоящее время. Тем не менее, обнаружение ДНК не дает никакой подсказки на жизнеспособность бактерий. Кроме того, Вопреки культуры, молекулярные подходы не приведет к деформации, которые могут быть дополнительно охарактеризованы.

Изучение патогенных микроорганизмов, которые растут плохо на твердой среде или которые нуждаются клеток расти сложно. Большинство из них "трудно расти" бактерии привередливый ВВЕДЕНИбесклеточные бактерии, часто открытые и характеризуются следующие крупных вспышек, как это было в случае с легионелл. Эта бактерия характеризуется после вспышки, которая произошла во время конвенции Американского легиона. Целых 182 человек были инфицированы и 29 умер из-за тяжелой пневмонии 1,2. Позже было показано, что амебы были естественными носителями этой бактерии и что их присутствие в отель системы кондиционирования воздуха и водопроводных сетей было в начале вспышки заболевания так называемой легионера 3.

Амеба присутствуют во всем мире и были изолированы от почвы, воздуха, воды и слизистой оболочки носа человеческих добровольцев (отзывы в 4). Эти "свободной гостиная" амебы обычно деления автономно в окружающую среду, но может иногда вторгаются разрешительных хозяев 5. Амеба питаются различными микроорганизмами через фагоцитоза и последующего лизосом переваривания гиdrolases 6. Многие факультативные или облигатными внутриклеточными бактериями способны противостоять пищеварение и таким образом заразить и разделить в амеб как, например Legionella, Chlamydia, связанные с бактериями или микобактериями (отзывы в 7 и 8). Бесплатный амебах всего представляют собой важный потенциальный резервуар для внутриклеточных бактерий, которые еще не были обнаружены. Это привело нашу группу для реализации в Лозанне две основные методы, называемые amoebal сокультивирования и amoebal обогащения, что позволило разные группы, чтобы изолировать несколько новых облигатными внутриклеточными микроорганизмами из различных проб окружающей среды 9-15.

С амебы профессиональные фагоциты, пасущиеся на бактерии, бактерия способна противостоять фагоцитоз и расти внутри этих простейших также может колонизировать человека фагоциты и быть патогенными по отношению к людям. Это было частично показано для некоторых Хламидиоз-родственных бактерий, таких как Waddlia чоndrophila. W. chondrophila может расти не только в амебы, но и в нескольких типов клеток, таких как эпителиальные клетки млекопитающих, макрофагов и клеточных линий 16-18 рыб. Amoebal сокультивирования также появляется соответствующая для обнаружения внутриклеточных бактерий в клинических образцах 19,20, включая табуретки, которые сильно загрязненных различных видов бактерий 21.

Здесь мы опишем основные этапы amoebal сокультивирования и amoebal обогащения, в том числе (а) лечения экологических или клинических образцах, (б) ростом амеб на аксенными СМИ и на бактериальной лужайке кишечной палочки и (с) отбора и характеристики внутриклеточных бактерий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Amoebal сокультивирования

1.1 Подготовка образцов

  1. Образец окружающей среды
    1. Пробы воды
      Фильтр пробу воды (500 мл до 1 л) через мембрану с размером пор 0,22 мкм. Затем встряхнуть мембрану в амеба солевой среде PAS страницы (120 мг NaCl, 4 мг MgSO 4 • 7H 2 O, 4 мг CaCl 2 • 2H 2 O, 142 мг Na 2 HPO 4, и 136 мг KH 2 PO 4 в 1 л дистиллированной воды).
    2. Твердые образцы
      Ресуспендируют твердых образцов, как почвы или песка образцов и полутвердых образцов, таких как активного ила в дистиллированной воде или PBS и фильтрации их через мембрану с размером пор 0,22 мкм. Затем встряхнуть мембраны в PAS.
    3. Образцы сильно загрязненных с эндогенным амеб и простейших
      Первый осадок образцы низкоскоростным центрифугированием (180 мкг) FOг 10 мин или отфильтровать его через размер пор мембраны 5 мкм. Далее процесс супернатанта (соответственно фильтрата), как и в 1.1.1.
      Примечание: Другие методы дезактивации могут быть использованы для дальнейшего обеззараживания проб окружающей среды: Нагрейте образец при 50 ° С в течение 30 мин или лечения с кислой или щелочной решений 14.
  2. Клиническая образец
    Процесс клинических образцов в зависимости от их физико-химических свойств. Фильтровать или центрифуги жидкости для удаления крупных примесей. Ресуспендируют твердых образцов. Чтобы использовать ткани, растереть их, например с помощью Dounce homogeneiser или стеклянные бусы, и лизиса клеток, чтобы освободить внутриклеточные бактерии.

1.2 подготовка Амеб

  1. Подготовка Бульон
    Подготовьте следующие носители: мультимедийного содержащие пептон, дрожжевой экстракт и глюкозу (PYG; 100 г Протеозопептон пептона, 10 г дрожжевого экстракта, 4,9 г MgSO 4 • 7H 2О, 5 г цитрата натрия • 2H 2 O, 0,1 г Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 • 6H 2 O, 1,7 г KH 2 PO 4, 1,97 г Na 2 HPO 4 • 7H 2 O , 45 г глюкозы и 0,295 г CaCl 2 в 5 л дистиллированной воды) и не-питательная среда, таких как PAS для видов Acanthamoeba.
  2. Amoebal культура
    1. Выращивают амебы (предпочтительно Acanthamoeba castellanii ATCC 30010 или A. Polyphaga Линк-AP1) при 25 ° С в колбах клеточных культур, содержащих 30 мл среды PYG.
    2. Урожай амеб на энергичного встряхивания колбы и центрифуги клеточной суспензии в течение 10 мин при 1500 х г. Вымойте гранул дважды PAS среды. Граф клеток в слайд Кова и регулировки громкости, чтобы получить суспензию из 5 × 10 5 клеток на мл.
    3. Перенести amoebal суспензии в микропланшеты. Используйте 1 мл на лунку для 12 - и 24-ВтELL пластины, 500 мкл на 48-луночных планшетах и ​​300 мкл на 96-луночных планшетах. Выдержите планшет, по крайней мере 2 часов при 25 ° С Это позволяет осаждение и прикрепление амебы на дно каждой лунки.

1.3 сокультивирования

  1. Образец прививка
    1. Привить пластинку из 2.3.3 с серийными разведениями образца от 1.1 или 1.2, как правило, с серии разведений 10-кратного, начиная с 100 мкл неразбавленного образца.
    2. Центрифуга планшет при 1800 мкг в течение 10 мин до осадка на amoebal газон микроорганизмы потенциально присутствующего в образце. Это увеличивает контакт и фагоцитоз микроорганизмов по амеб.
    3. Инкубируйте пластин в течение 45 мин при 25 ° С и мыть три раза PAS путем замены носитель со свежим PAS. Добавить 1 мл на лунку PAS с добавлением или без добавления антибиотиков (стрептомицин, пенициллин, гентамицин и / или ванкомицин), в зависимости от bacteriаль видов, которые просматривали.
    4. Выдержите планшет при 32 ° С в увлажненной атмосфере, чтобы избежать инцистирования из амеб. Соблюдайте каждый хорошо ежедневно с целью 20X обнаружить наличие бактерий вторжения и лизирующих амеб.
    5. В случае лизиса выполнить субкультуру на свежем амебы путем инокуляции 100 мкл совместных культурах в монослое около 10 5 амеб / см 2. Чтобы специально изолировать данной видов бактерий, привить также конкретных агар СМИ предназначены для этих бактерий (то есть BCYE агар для Legionella SPP.).
    6. При отсутствии лизиса, принимать по 100 мкл совместных культурах 6:56 дней после первой прививки и прививку свежего amoebal культуру 900 мкл в 24-луночный планшет. Если в скором лизис амеб наблюдается без распространения бактерий, вирус может присутствовать. В этом случае фильтр супернатант при 0,22 мкм и использовать отфильтрованную суспензию инфицировать свежий амебы.

    1.4 Бактериальный выделение и характеристика

    1. Бактериальный окрашивание
      Выполните совместных культурах непосредственно на покровные стекла в 24-луночные микропланшеты. Снимите среду и выполнять окрашивание или иммунофлюоресценции.
      1. Изменения окрашивание по Романовскому
        1. Пусть покровное сухой. Погрузитесь покровное пять раз закрепляющего раствора (2 мг / л Быстрый зеленый в метаноле).
        2. Погрузитесь покровное пять раз в красящим раствором я (1,22 г / л эозином G в фосфатный буфер, рН 6,6)
        3. Наконец, погрузиться покровного стекла 5 раз в красящим раствором II (1,1 г / л тиазиновом в фосфатный буфер, рН 6,6).
        4. Промыть образец дистиллированной водой. Дайте высохнуть и наблюдать с помощью микроскопа.
      2. Окрашивание по Цилю-Нильсену
        1. Пусть покровное сухой. Накройте образца с Ziehl фуксина. Нагрейте краску с пламенем, пока не появятся пары.
        2. Прохладный при комнатной температуре в течение не менее 5 минути промойте дистиллированной водой. Крышка образца с 3%-ным раствором соляной кислоты в изопропаноле в течение 2 мин и промыть дистиллированной водой.
        3. Обложка в течение 30 сек с метиленовым синим и промойте дистиллированной водой. Дайте высохнуть и наблюдать с помощью микроскопа 22.
      3. Окрашивание Хименес
        1. Подготовка основной фуксин маточного раствора путем смешивания 100 мл 10% основного фуксина (10 г основного фуксина в 100 мл 95% этанола), 250 мл 4%-ного водного фенола и 650 мл дистиллированной воды. Инкубируют при 37 ° С в течение 48 ч перед использованием.
        2. Пусть покровное высушить и исправить путем пропускания ее через пламя. Крышка образца с свежеотфильтрованная основного фуксина (4 мл основного фуксина маточного раствора в 10 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера, рН 7,45) в течение 2 мин.
        3. Промыть образец водой и инкубировать в малахитового зеленого (0,8% в дистиллированной воде) в течение 10 сек. Промыть снова водой и повторите малахитовый зеленый окрашивание. Промыть снова водой. Пусть покровное сухой, мр а ф его, и наблюдать с помощью микроскопа 23.
      4. Иммунофлюоресценция
        1. Закрепить покровное путем инкубации в метаноле в течение 5 мин или с 4% параформальдегид в течение 10 мин.
        2. Промыть три раза ЗФР и инкубируют в течение 2 ч в блокирующем растворе (5% BSA, 0,1% сапонина в ФБР) при комнатной температуре.
        3. Инкубировать покровное в течение 1 часа в блокирующем растворе, содержащий антител, полученных против микроорганизма, представляющего интерес.
        4. Промыть снова три раза в PBS и инкубировали в течение 1 часа с вторичным антителом, направленным против первичного антитела и связанного с флуорофора. Вымойте три раза PBS, смонтировать покровное и наблюдать с помощью флуоресцентной микроскопии.
    2. Обнаружение ДНК с помощью ПЦР
      Извлечение ДНК от 100 до 200 мкл amoebal сокультивирования. Обнаружение микроорганизмов с универсальными праймерами, направленных гена 16S рРНК или специфические праймеры для видов, представляющих интерес, таких как микобактерии 24, Легионеллы 25 или члены 26 Chlamydiales.

    2. Amoebal Обогащение

    2.1. Подготовка образца

    Ресуспендируют твердых и полутвердых образцов в PAS встряхиванием. Центрифугируют суспензию с низкой скоростью (180 мкг) в течение 10 мин. Это позволяет обогащение свободно живущих амеб в осадке. Супернатант может быть использован для amoebal сокультивирования и осадок на amoebal обогащения 21.

    2.2. Средний подготовка

    1. Добавить 1,5 г агара к 100 мл PAS и автоклав в среднесрочной 15 мин при 121 ° С Налейте теплую среду в чашках Петри, и пусть затвердевают при комнатной температуре.
    2. Расти кишечной палочки (АТСС 25922) в LB или тиогликолятной бульоне в течение ночи при 37 ° С Вымойте бактерии дважды PBS и ресуспендируют их в PAS среды. Развести в 10 раз в PAS и распространять 2-3 мл этого раствора на PAS агаром и дайте высохнуть.

    Добавить каплю образца (или часть фильтра) на одной стороне пластины и позволить ей течь через чашку Петри, чтобы сформировать линию в центр чашки.

    2.4. Amoebal рост и amoebal субкультура

    1. Соблюдайте чашку Петри ежедневно. Если amoebal миграции фронта обнаружен, вырезать небольшой кусочек агара в миграционной спереди и привить свежий блюдо ННА Петри, покрытую газоне Е. палочка.
    2. Повторите повторная инокуляция несколько раз в зависимости от чистоты образца, чтобы иметь чистую культуру данной amoebal штамма.

    2.5. Амеба и бактерии характеристика

    1. Очистите клетки и ресуспендируют их в PAS.
    2. Извлечение ДНК и определить личность амеб и / или бактериальных эндосимбионтов методом ПЦР и секвенирования (16S рРНК усиления для бактерий, соотв. 18S рРНК для амеб и последовательности, например).
      3. <литий> Используйте эти Царапины клеток в PAS привить свежий амеб и выполнить amoebal сокультивирования обнаруживать бактерии, возможно, присутствующие в пробе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Использование amoebal сокультивирования и amoebal обогащение, целый ряд экологических и / или патогенных бактерий были обнаружены (табл. 1).

Amoebal сокультивирования использовался нашей группой и другими анализировать пробы окружающей среды, водоочистные сооружения и систем водоснабжения. Широкий спектр микроорганизмов могут быть выделены с этой техникой. Наиболее распространенные бактерии, выделенные на amoebal сокультивирования являются членами Mycobacterium рода, которые могут быть извлечены из водоочистных сооружений и от водопроводных сетей 13,14,24,27,28. Legionella и α-протеобактерий виды также могут быть изолированы от водоочистных сооружений и от больничных водопроводных сетей 14,24,28-31. Несколько Хламидиоз-родственные виды были также выделены из речной воды и очистных сооружений, как, например, Estrella lausannensis (рис. 2В-С 12,15,32,33.

34-36. Эти вирусы все способны заражать и размножаться в амеб и представить затмение фазу типичной вирусной образа жизни. В mimivirus считается мягким человеческого патогена легких, поскольку он был замешан в случайного заражения лаборанта, который страдал от пневмонии 37. Потенциал патогенность других гигантских вирусов еще нуждается в изучении.

Amoebal обогащение часто используется параллельно с amoebal сокультивирования. Таким образом, при исследовании системы водоочистки и вниз по течению водопроводной сети, 25 различных amoebal штаммы были обнаружены, из которых 12 соответствовали новых видов 14. Амеба присутствовали на каждом этапе очистки и распределения воды, что указывает на устойчивость этих простейших к озонирования и хлорирования. Внутриклеточных бактерий совместноULD также быть обнаружены в этих амеб, показывая важность коренного амеб в передаче внутриклеточных бактерий 14. В другом исследовании, амебы могут быть изолированы от системы распределения воды больницы 24. Подавляющее большинство штаммов, выделенных в этом исследовании соответствовала Hartmannella vermiformis, что, естественно, способны выживать при относительно высоких температурах. Несколько бактерии, такие как легионелл могут быть обнаружены в индейской амеб 24. Другой пример бактерий, найденных в определенном амебы Parachlamydia acantamoebae. Это Chlamydia, связанных бактерия был выделен из слизистой оболочки носа из женщин-добровольцев по amoebal обогащения (рис. 2а) и 9 является потенциальным агентом пневмонии 38. Это еще раз показывает важность амеб в поддержании и дисперсии бактериальных патогенов, которые могут быть особенно патогенны для immunocompromisред пациентов 39.

Рисунок 1
Рисунок 1. План amoebal сокультивирования и amoebal обогащения, описывающей важные шаги этих двух методов. (Адаптировано из 40). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 2
Рисунок 2. Примеры бактерий, обнаруженных amoebal сокультивирования и их наблюдения с различными методами окрашивания.) Окрашивание Coccus заражения амеб Parachlamydia Acanthamoebae Холла с модифицированной Романовскому метод 24 часов после заражения, с увеличением 1000 X. Бактерии окрашиваются в синий (rrows). н.э.) Электронная микроскопия Estrella lausannensis показывая типичный звездный морфологию элементарные тельца (стрелки).

Таблица 1. Примеры бактерий из разных классов, открытых amoebal сокультивирования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Amoebal сокультивирования и amoebal обогащения являются эффективные методы, которые позволили изоляцию многих новых бактериальных и amoebal видов. Результаты, полученные с помощью этих методов подтверждения вездесущий присутствие как амебы и амебы-стойкой бактерий в окружающей среде, и что самое интересное в искусственных водных сетей, которые считаются управляться химических обработок, таких как хлорирование и озонирование. Amoebal сокультивирования и amoebal обогащения являются необходимыми инструментами, чтобы изолировать и культивировать эти потенциально патогенные микроорганизмы и получить штаммы в чистой культуре, чтобы затем продолжить изучение их биологии и патогенности. В последнее время этот метод был адаптирован для изоляции высокой пропускной гигантских вирусов 41. Точно так же, amoebal сокультивирования может быть автоматизирован и использовать в качестве обычного метода для проверки микробиологического качества проб окружающей среды и техногенных систем водоснабжения, таких как питьевая вода.

Amoebal сокультивирования можетвыполняться с различных видов амеб. Мы обычно предпочитают использовать Acanthamoeba castellanii или A. Polyphaga так как они менее склонны к инцистирования чем Hartmannella vermiformis и так как они обладают относительно большой спектр хоста. Другие виды могут быть использованы, но протокол и бульон должны быть адаптированы. Это было недавно показано, что А. lenticulana (АТСС 30841) могут быть использованы в тех же условиях, A. castellanii или А. Polyphaga но имеет другую восприимчивость к инфекции 42. Чтобы предотвратить инцистирования, важно использовать относительно низкую температуру инкубации (ниже 30 ° С) и для поддержания влажной атмосфере.

Обращает на себя внимание, устойчивый репликация amoebal симбионтов не обязательно приведет к amoebal лизиса и когда специально искали симбионтов, скрининг с помощью микроскопии и / или ПЦР следует систематически проводятся. Чтобы избежать лизиса или отряд amoebal се РЛС из-за бактериального роста, полезно проводить посев сильно загрязненных образцов с использованием 10-кратных серийных разведений.

Тем не менее, эти методы имеют свои ограничения. В связи с использованием одного amoebal видов, amoebal сокультивирования не может позволить изоляцию бактерий, которые используют в качестве резервуара еще amoebal видов. Более того, такие специфические amoebal виды могут оказаться не в состоянии размножаться на Е. палочки газоны и может не хватать amoebal обогащения. В зависимости от свойств бактерий или амеб исследованных, это может быть необходимо для тестирования различных средств массовой информации, различные amoebal видов и различных видов бактерий, чтобы накормить амеб (Enterobacter doacae и некоторые штаммы Pseudomonas являются хорошей альтернативой). Бактериальное загрязнение амеб или носителя, используемого для amoebal сокультивирования может произойти и может привести к ложным положительным результатам. Отрицательный контроль, таким образом, обязательным, чтобы избежать таких ложных положительных результатов.

Содержание "> В заключение amoebal сокультивирования и amoebal обогащение два взаимодополняющих подхода, которые представляют интересные инструменты, чтобы указать экологии и биоразнообразия свободной жизни амеб и амеб-стойкой бактерий. Эти методы позволяют открытие многих новых видов, в том числе амебы, бактерии и гигантские вирусы, формируя основу для будущих исследований по расследованию патогенность этих новых микроорганизмов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgments

Мы благодарим Pr. Бернар Ла Скола за полезные технических советов и интересной дискуссии на amoebal сокультивирования и amoebal обогащения. Мы также благодарим доктора Винсента Томаса за его помощь в реализации технику в нашей лаборатории.

Materials

Класс Примеры Виды Ссылка
α-протеобактерии Odyssella thelassonicensis 10
б-протеобактерии Burkholderia cepacia 36
г-протеобактерии Legionella drancourtii 26
Хламидии Эстрелла lausannensis 30
Flavobacteriae Amoebophilus asiaticus 37
Actinobacteria Микобактерии SPP. 38
Name Company Catalog Number Comments
Glucose monohydrate Merck, Darmstadt, Germany 108342
0.22 μm pore size membrane Merck Millipore, Darmstadt, Germany SCVPU11RE
proteose peptone Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 211693
yeast extract Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 212750
Cell culture flasks Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 353135
Kova slide Hycor, Indianapolis, IN 87144
cell culture microplates Corning Inc, Corning, NY 3524
Diff-Quik staining kit Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany 130832
Ziehl fuchsin Fluka, St-Louis, MI 21820
basic fuchsin Sigma, St-Louis, MI 857843
Phenol Sigma, St-Louis, MI P1037 Corrosive and mutagenic
malachite green oxalate Fluka, St-Louis, MI 63160
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 15710
Saponin Sigma, St-Louis, MI 84510

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fraser, D. W., et al. Legionnaires' disease: description of an epidemic of pneumonia. New Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).
  2. McDade, J. E., et al. Legionnaires' disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease. New Engl. J. Med. 297, 1197-1203 (1977).
  3. Rowbotham, T. J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae. J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).
  4. Rodriguez-Zaragoza, S. Ecology of free-living amoebae. Crit. Rev. Microbiol. 20, 225-241 (1994).
  5. Booton, G. C., Visvesvara, G. S., Byers, T. J., Kelly, D. J., Fuerst, P. A. Identification and distribution of Acanthamoeba species genotypes associated with nonkeratitis infections. J Clin. Microbiol. 43, 1689-1693 (2005).
  6. Brussow, H. Bacteria between protists and phages: from antipredation strategies to the evolution of pathogenicity. Molecular microbiology. 65, 583-589 (2007).
  7. Greub, G., Raoult, D. Microorganisms resistant to free-living amoebae. Clin. Microbiol. Rev. 17, 413-433 (2004).
  8. Thomas, V., McDonnell, G., Denyer, S. P., Maillard, J. Y. Free-living amoebae and their intracellular pathogenic microorganisms: risks for water quality. FEMS Microbiol Rev. 34, 231-259 (2010).
  9. Birtles, R. J., Rowbotham, T. J., Storey, C., Marrie, T. J., Raoult, D. Chlamydia-like obligate parasite of free-living amoebae. Lancet. 349, 925-926 (1997).
  10. Amann, R., et al. Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia spp. Appl. Environ. Microbiol. 63, 115-121 (1997).
  11. Birtles, R. J., et al. Candidatus Odyssella thessalonicensis' gen. nov., sp. nov., an obligate intracellular parasite of Acanthamoeba species. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 63-72 (2000).
  12. Thomas, V., Casson, N., Greub, G. Criblamydia sequanensis, a new intracellular Chlamydiales isolated from Seine river water using amoebal co-culture. Environ. Microbiol. 8, 2125-2135 (2006).
  13. Pagnier, I., Raoult, D., La Scola, B. Isolation and identification of amoeba-resisting bacteria from water in human environment by using an Acanthamoeba polyphaga co-culture procedure. Environ. Microbiol. 10, 1135-1144 (2008).
  14. Thomas, V., Loret, J. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environ. Microbiol. 10, 2728-2745 (2008).
  15. Corsaro, D., et al. Novel Chlamydiales strains isolated from a water treatment plant. Environ. Microbiol. 11, 188-200 (2009).
  16. Goy, G., Croxatto, A., Greub, G. Waddlia chondrophila enters and multiplies within human macrophages. Microbes Infect. 10, 556-562 (2008).
  17. Kebbi-Beghdadi, C., Cisse, O., Greub, G. Permissivity of Vero cells, human pneumocytes and human endometrial cells to Waddlia chondrophila. Microbes Infect. 13, 566-574 (2011).
  18. Kebbi-Beghdadi, C., Batista, C., Greub, G. Permissivity of fish cell lines to three Chlamydia-related bacteria: Waddlia chondrophila, Estrella lausannensis and Parachlamydia acanthamoebae. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 339-345 (2011).
  19. Fry, N. K., Rowbotham, T. J., Saunders, N. A., Embley, T. M. Direct amplification and sequencing of the 16S ribosomal DNA of an intracellular Legionella species recovered by amoebal enrichment from the sputum of a patient with pneumonia. FEMS Microbiol. Lett. 67, 165-168 (1991).
  20. Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila serogroup 1 from human feces with use of amebic cocultures. Clin. Infect. Dis. 26, 502-503 (1998).
  21. Greub, G., La Scola, B., Raoult, D. Amoebae-resisting bacteria isolated from human nasal swabs by amoebal coculture. Emerging Infect. Dis. 10, 470-477 (2004).
  22. Isenberg, H. D. Clinical microbiology procedures handbook. , (1992).
  23. Gimenez, D. F. Staining Rickettsiae in Yolk-Sac Cultures. Stain Technol. 39, 135-140 (1964).
  24. Thomas, V., Herrera-Rimann, K., Blanc, D. S., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-resisting bacteria in a hospital water network. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2428-2438 (2006).
  25. Miyamoto, H., et al. Development of a new seminested PCR method for detection of Legionella species and its application to surveillance of legionellae in hospital cooling tower water. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2489-2494 (1997).
  26. Lienard, J., et al. Development of a new chlamydiales-specific real-time PCR and its application to respiratory clinical samples. J. Clin. Microbiol. 49, 2637-2642 (2011).
  27. Wang, Y., Ogawa, M., Fukuda, K., Miyamoto, H., Taniguchi, H. Isolation and identification of mycobacteria from soils at an illegal dumping site and landfills in Japan. Microbiol. Immunol. 50, 513-524 (2006).
  28. Corsaro, D., Pages, G. S., Catalan, V., Loret, J. F., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-associated bacteria in water treatment plants. Int. J. Hygiene Environ. Health. 213, 158-166 (2010).
  29. La Scola, B., et al. Legionella drancourtii sp. nov., a strictly intracellular amoebal pathogen. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 699-703 (2004).
  30. Thomas, V., Casson, N., Greub, G. New Afipia and Bosea strains isolated from various water sources by amoebal co-culture. Syst. Appl. Microbiol. 30, 572-579 (2007).
  31. La Scola, B., et al. Amoeba-resisting bacteria and ventilator-associated pneumonia. Emerging Infect. Dis. 9, 815-821 (2003).
  32. Collingro, A., et al. Recovery of an environmental Chlamydia strain from activated sludge by co-cultivation with Acanthamoeba sp. Microbiology. 151, 301-309 (2005).
  33. Lienard, J., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Estrella lausannensis, a new star in the Chlamydiales order. Microbes Infect. 13, 1232-1241 (2011).
  34. La Scola, B., et al. A giant virus in amoebae. Science. 299, 2033 (2003).
  35. Boyer, M., et al. Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21848-21853 (2009).
  36. Thomas, V., et al. Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets. Environ. Microbiol. 13, 1454-1466 (2011).
  37. Raoult, D., Renesto, P., Brouqui, P. Laboratory infection of a technician by mimivirus. Ann. Internal Med. 144, 702-703 (2006).
  38. Greub, G. Parachlamydia acanthamoebae, an emerging agent of pneumonia. Clin. Microbiol. Infect. 15, 18-28 (2009).
  39. Lamoth, F., Greub, G. Amoebal pathogens as emerging causal agents of pneumonia. FEMS Microbiol. Rev. 34, 260-280 (2010).
  40. Lienard, J. G. Ch. 6. Environmental microbiology, current technology and water applications. Ashbolt, K., Sen, N. J. , Caister Academic Press. 143-162 (2011).
  41. Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ. Microbiol. , (2012).
  42. Ovrutsky, A. R., et al. Cooccurrence of Free-Living Amoebae and Nontuberculous Mycobacteria in Hospital Water Networks, and Preferential Growth of Mycobacterium avium in Acanthamoeba lenticulata. Appl. Environ. Microbiol. 79, 3185-3192 (2013).

Tags

Иммунологии выпуск 80 экологической микробиологии почвенной микробиологии Вода Микробиология Амеб микроорганизмы сокультивирования обязывает внутриклеточных бактерий
Открытие новых внутриклеточных патогенов на Amoebal сокультивирования и подходов Amoebal обогащению
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., … More

Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches. J. Vis. Exp. (80), e51055, doi:10.3791/51055 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter