Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

اكتشاف جديد بين الخلايا مسببات الأمراض عن طريق Amoebal Coculture والمناهج Amoebal التخصيب

Published: October 27, 2013 doi: 10.3791/51055
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Microbiology, University Hospital Center and University of Lausanne

Summary

coculture Amoebal هو نظام زراعة الخلايا باستخدام الأميبات تمسكا تنمو بشكل انتقائي مسببات الأمراض داخل الخلايا قادرة على مقاومة الخلايا البلعمية مثل الأميبات والضامة. وبالتالي فإنه يمثل أداة رئيسية لاكتشاف العوامل المعدية الجديدة. تخصيب Amoebal يسمح اكتشاف الأنواع الجديدة وamoebal من البكتيريا داخل الخلايا الخاصة.

Abstract

مسببات الأمراض مثل البكتيريا داخل الخلايا، المتفطرات والكائنات الحية مثل الكلاميديا ​​يصعب عزل لأنهم غالبا ما تنمو بشكل سيئ أو لا على الاطلاق على وسائل الإعلام الانتقائي الذي عادة ما تستخدم لزراعة البكتيريا. لهذا السبب، تم اكتشاف العديد من هذه الجراثيم إلا في الآونة الأخيرة أو في أعقاب تفشي الهامة. غالبا ما ترتبط هذه الجراثيم مع الأميبات، والتي تكون بمثابة خلايا المضيف والسماح للبقاء ونمو البكتيريا. نعتزم هنا لتقديم مظاهرة من اثنين من التقنيات التي تسمح العزلة وتوصيف مسببات الأمراض داخل الخلايا الموجودة في العينات السريرية أو البيئية: وcoculture amoebal وتخصيب amoebal. coculture Amoebal يسمح الانتعاش من البكتيريا داخل الخلايا، فحقن العينة على التحقيق في الحديقة amoebal التي يمكن أن تكون مصابة و lysed من البكتيريا داخل الخلايا الموجودة في العينة. يسمح تخصيب Amoebal استرداد الأميبات موجودة في عينة سريرية أو البيئية. الويمكن أن يؤدي إلى اكتشاف أنواع جديدة amoebal ولكن أيضا من البكتيريا داخل الخلايا الجديدة المتنامية على وجه التحديد في هذه الأميبات. معا، وهذه التقنيات اثنين تساعد على اكتشاف البكتيريا داخل الخلايا الجديدة قادرة على النمو في الأميبات. نظرا لقدرتها على إصابة الأميبات ومقاومة البلعمة، قد هذه البكتيريا داخل الخلايا أيضا الهروب البلعمة التي الضامة، وبالتالي، تكون الممرضة لحقيقيات النوى أعلى.

Introduction

قبل ظهور التشخيص الجزيئي، والكائنات الدقيقة الموجودة في محاريب البيئية أو في العينات السريرية في كثير من الأحيان الكشف عنها من قبل زراعتها على وسائل الإعلام الانتقائي مختلفة، وذلك أساسا على أجار في أطباق بتري. النمط الظاهري من المستعمرات البكتيرية ونشاطهم الأيضية ثم سمح تصنيف البكتيريا على مستوى الأنواع. ويمكن أيضا أن تستخدم مرق لزيادة حساسية الكشف. ومع ذلك، كل التقنيات لا تسمح الانتعاش من البكتيريا التي تنمو ببطء أو لا على الاطلاق على هذه الوسائط. هذا هو السبب وتستخدم على نطاق واسع النهج الجزيئية في الوقت الحاضر. ومع ذلك، والكشف عن الحمض النووي لا يقدم أي دليل على بقاء البكتيريا. علاوة على ذلك، على العكس من الثقافة، والنهج الجزيئية لا يؤدي إلى سلالة يمكن أن تكون كذلك تتميز.

دراسة مسببات الأمراض التي تنمو بشكل سيئ على وسائل الاعلام الصلبة أو أن الخلايا تنمو الحاجة إلى معقد. معظم هذه "من الصعب أن تنمو البكتيريا" هي INTR الحساسيةالبكتيريا ديكي، وكثيرا ما اكتشف وتتميز التالية تفشي كبيرة كما كان الحال بالنسبة لالمستروحة البكتيريا. وقد تميزت هذه البكتيريا التالية تفشى التي وقعت خلال اتفاقية الفيلق الاميركي. أصيب ما لا يقل عن 182 شخصا وتوفي 29 بسبب التهاب رئوي حاد 1،2. وقد تجلى لاحقا أن الأميبات كانت الحاضن الطبيعي لهذه البكتيريا والتي كان وجودها في شبكات الفنادق نظام تكييف الهواء والماء في أصل اندلاع مرض ما يسمى الجندي 3.

الأميبات موجودة في جميع أنحاء العالم وكانت معزولة من التربة والهواء والماء والغشاء المخاطي للأنف من متطوعين من البشر (مراجعة في 4). هذه الأميبات "حرة المعيشة" يتم تقسيم عموما بشكل مستقل في البيئة ولكن في بعض الأحيان قد تغزو المضيفين متساهلة 5. تغذية الأميبات على مختلف الكائنات الدقيقة من خلال البلعمة واللاحقة الليزوزومية الهضم بواسطة HYdrolases 6. العديد من أنواع البكتيريا داخل الخلايا الاختيارية أو تلزم هي قادرة على مقاومة عملية الهضم، وبالتالي تصيب وتقسيم في الأميبات على سبيل المثال البكتيريا أو المتفطرات المرتبطة الكلاميديا ​​البكتيريا، (مراجعة في 7 و 8). الأميبات حرة المعيشة المرجح تمثل الخزان المحتملة الهامة للبكتيريا داخل الخلايا التي تم اكتشافها حتى الآن لا. قاد هذه المجموعة جهدنا لتنفيذها في لوزان اثنين من التقنيات الرئيسية، ودعا coculture amoebal وتخصيب amoebal، مما سمح مجموعات مختلفة لعزل الكائنات الدقيقة العديد من الخلايا تلزم جديدة من العينات البيئية المختلفة 9-15.

منذ الأميبات هي البالعات المهنية الرعي على البكتيريا، قد بكتيريا قادرة على مقاومة البلعمة وتنمو داخل هذه الأولانيات أيضا استعمار البالعات الإنسان وتكون الممرضة تجاه البشر. وقد تجلى هذا بشكل جزئي لبعض أنواع البكتيريا المرتبطة الكلاميديا، مثل Waddlia تشوndrophila. دبليو chondrophila يمكن أن تنمو، ليس فقط في الأميبات ولكن أيضا في العديد من أنواع الخلايا مثل الخلايا الظهارية الثديية، الضامة، وخطوط الخلايا الأسماك 16-18. يظهر coculture amoebal أيضا ذات الصلة للكشف عن البكتيريا داخل الخلايا في العينات السريرية 19،20، بما في ذلك البراز التي تكون ملوثة بشكل كبير مع الأنواع البكتيرية المختلفة 21.

نحن هنا وصف الخطوات الرئيسية لcoculture amoebal وتخصيب amoebal، بما في ذلك (أ) معاملة العينات البيئية أو السريرية، (ب) نمو الأميبات على وسائل الإعلام وممحوضة على العشب البكتيريا القولونية و (ج) اختيار وتوصيف من البكتيريا داخل الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Amoebal Coculture

1.1 إعداد نموذج

  1. عينة بيئية
    1. عينات المياه
      تحديد عينة المياه (500 مل إلى 1 لتر) من خلال 0.22 ميكرون حجم المسام الغشاء. ثم، ويهز الغشاء في الأميبا المالحة PAS المتوسطة صفحة في (120 ملغ من كلوريد الصوديوم، 4 ملغ من MgSO 4 • 7H 2 O، 4 ملغ من و CaCl 2 • 2H 2 O، 142 ملغ من الصوديوم 2 هبو 4، و 136 ملغ من KH 2 ص 4 في 1 لتر من الماء المقطر).
    2. العينات الصلبة
      في resuspend العينات الصلبة مثل التربة أو الرمل العينات وعينات شبه الصلبة مثل الحمأة المنشطة في الماء المقطر أو برنامج تلفزيوني وتصفية لهم من خلال 0.22 ميكرون حجم المسام الغشاء. ثم، ويهز الغشاء في نظام تقييم الأداء.
    3. عينات ملوثة للغاية مع الأميبات الذاتية والبروتوزوا
      أول الرواسب العينات بواسطة الطرد المركزي سرعة منخفضة (180 x ج) للص 10 دقيقة أو تصفية عليه من خلال 5 ميكرون حجم المسام الغشاء. مزيد من معالجة طاف (على التوالي رشاحة)، كما في 1.1.1.
      ملاحظة: يمكن استخدام تقنيات التطهير أخرى لمواصلة تطهير العينات البيئية: حرارة العينة في 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو علاج مع المحاليل الحمضية أو الأساسية 14.
  2. عينة السريرية
    معالجة العينات السريرية اعتمادا على الخصائص الفيزيائية والكيميائية. تصفية الطرد المركزي أو سوائل لإزالة الشوائب الكبيرة. في resuspend العينات الصلبة. لاستخدام الأنسجة، وطحن لهم، على سبيل المثال باستخدام homogeneiser dounce أو الخرز الزجاجي، وليز الخلايا لتحرير البكتيريا داخل الخلايا.

1.2 إعداد الأميبات

  1. إعداد مرق
    إعداد وسائل الإعلام التالية: وسائل الإعلام الغنية التي تحتوي على ببتون، خلاصة الخميرة والجلوكوز (PYG و 100 غرام من ببتون البروتيوز، 10 غرام من خلاصة الخميرة، 4.9 غرام من MgSO 4 • 7H 2O، 5 غرام من سترات الصوديوم • 2H 2 O، 0.1 غرام من الحديد (NH 4) 2 (SO 4) 2 • 6H 2 O، 1.7 غرام من KH 2 PO 4، 1.97 غرام من نا 2 هبو 4 • 7H 2 O ، 45 غراما من الجلوكوز، و0.295 غرام من و CaCl 2 في 5 لتر من الماء المقطر) وسيلة غير الغذائية مثل PAS للأنواع الشوكميبة.
  2. ثقافة Amoebal
    1. زراعة الأميبات (تفضيلي الشوكميبة castellanii آي تي سي سي 30010 أو A. polyphaga ينك-AP1) عند 25 درجة مئوية في قوارير زراعة الخلايا تحتوي على 30 مل من PYG المتوسط.
    2. حصاد الأميبات عن طريق هز قوية من القارورة وأجهزة الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 10 دقيقة في 1،500 ز س. يغسل بيليه مرتين مع PAS المتوسط. عد الخلايا في شريحة كوفاتش وضبط مستوى الصوت للحصول على تعليق من 5 × 10 5 خلايا لكل مل.
    3. نقل تعليق amoebal في microplates. استخدام 1 مل لكل بئر لمدة 12 - و 24 ثلوحات الذراع، 500 ميكرولتر لوحات 48 جيدا و 300 ميكرولتر لوحات 96 جيدا. احتضان صفيحة ميكروسكوبية لا يقل عن 2 ساعة على 25 درجة مئوية. وهذا يسمح الترسيب والتعلق من الأميبات إلى الجزء السفلي من كل بئر.

1.3 Coculture

  1. عينة التلقيح
    1. تطعيم لوحة من 2.3.3 مع التخفيفات التسلسلي للعينة من 1.1 أو 1.2، وعادة مع 10 أضعاف سلسلة التخفيف، بدءا من 100 ميكرولتر من العينة غير مخفف.
    2. أجهزة الطرد المركزي في صفيحة ميكروسكوبية 1،800 x ج لمدة 10 دقيقة على الرسوبيات في حديقة amoebal الكائنات الدقيقة يحتمل وجودها في العينة. وهذا يزيد من الاتصال والبلعمة من الكائنات الحية الدقيقة التي كتبها الأميبات.
    3. احتضان لوحات لمدة 45 دقيقة عند 25 درجة مئوية ويغسل ثلاث مرات مع PAS عن طريق استبدال وسائل الإعلام مع PAS الطازجة. إضافة 1 مل لكل بئر من PAS مع أو بدون إضافة المضادات الحيوية (الستربتومايسين، البنسلين، جنتاميسين و / أو فانكومايسين)، اعتمادا على بكتيرياالأنواع آل التي يتم البحث عنها.
    4. احتضان صفيحة ميكروسكوبية في 32 درجة مئوية في جو مرطب لتجنب تكيس من الأميبات. مراقبة كل بئر يوميا مع الهدف 20X للكشف عن وجود البكتيريا الغازية وlysing الأميبات.
    5. في حالة تحلل، نفذ ثقافة فرعية على الأميبات الطازجة، فحقن 100 ميكرولتر من cocultures لأحادي الطبقة من حوالي 10 الأميبات 5 / سم 2. لعزل تحديدا الأنواع البكتيرية معين، تطعيم أيضا وسائل الإعلام أجار محددة مصممة لهذه البكتيريا (أي BCYE أجار لالفيلقيات).
    6. في غياب تحلل، واتخاذ 100 ميكرولتر من cocultures بعد 4-7 أيام من التلقيح الأول وتطعيم ثقافة amoebal جديدة من 900 ميكرولتر في 24 لوحة جيدا. إذا لوحظ تحلل السريع لالأميبات دون انتشار البكتيريا، قد يكون الفيروس الحالي. في هذه الحالة، تحديد طاف عند 0.22 ميكرون واستخدام التعليق تصفيتها لتصيب الأميبات الطازجة.

    1.4 العزلة البكتيرية وتوصيف

    1. تلطيخ البكتيرية
      أداء cocultures مباشرة على coverslips الزجاج في 24 microplates جيدا. إزالة المتوسطة وأداء تلطيخ أو المناعي.
      1. تعديل Romanowsky تلطيخ
        1. السماح للساترة الجافة. تزج ساترة خمس مرات في الحل تثبيتي (2 ملغم / لتر سريعة الخضراء في الميثانول).
        2. تزج ساترة خمس مرات في حل تلطيخ الأول (1.22 ز / L G صبغة فوسفورية حمراء في الفوسفات العازلة درجة الحموضة 6.6)
        3. أخيرا، تزج ساترة 5 مرات في حل تلطيخ الثاني (1.1 غرام / لتر thiazine في الفوسفات العازلة درجة الحموضة 6.6).
        4. شطف العينة مع الماء المقطر. اسمحوا الجافة ونلاحظ بواسطة المجهر.
      2. تسيل Neelsen تلطيخ
        1. السماح للساترة الجافة. تغطية العينة مع تسيل فوكسين. حرارة الصبغة بلهب حتى تظهر الأبخرة.
        2. بارد في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق على الأقلوشطف مع الماء المقطر. تغطية العينة مع 3٪ من محلول حمض الهيدروكلوريك في الأيزوبروبانول لمدة 2 دقيقة ويشطف بالماء المقطر.
        3. تغطية لمدة 30 ثانية مع الميثيلين الأزرق وشطف مع الماء المقطر. اسمحوا الجافة ونلاحظ بواسطة المجهر 22.
      3. جيمينيز تلطيخ
        1. إعداد محلول المخزون فوكسين الأساسية عن طريق خلط 100 مل من فوكسين الأساسية بنسبة 10٪ (10 غرام من فوكسين الأساسية في 100 مل 95٪ من الإيثانول)، 250 مل من 4٪ الفينول المائي و 650 مل من الماء المقطر. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة قبل الاستخدام.
        2. السماح للساترة الجافة وإصلاح بتمريرها من خلال اللهب. تغطية العينة مع تصفيتها حديثا فوكسين الأساسية (4 مل من محلول المخزون الأساسية فوكسين في 10 مل من 0.1 M العازلة فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.45) لمدة 2 دقيقة.
        3. شطف العينة مع الماء واحتضان باللون الأخضر المرمر (0.8٪ في الماء المقطر) لمدة 10 ثانية. شطف مع الماء مرة أخرى وكرر تلطيخ المسرطنة. شطف مرة أخرى بالماء. السماح للساترة الجافة، مount ذلك، ونلاحظ بواسطة المجهر 23.
      4. المناعي
        1. إصلاح ساترة التي يحتضنها في الميثانول لمدة 5 دقائق أو مع بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 10 دقيقة.
        2. يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 2 ساعة في عرقلة الحل (5٪ BSA، 0.1٪ سابونين في برنامج تلفزيوني) في درجة حرارة الغرفة.
        3. احتضان ساترة لمدة 1 ساعة في عرقلة الحل تحتوي على الأجسام المضادة التي أثيرت ضد الكائنات الحية الدقيقة في المصالح.
        4. يغسل مرة أخرى ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 1 ساعة مع الأجسام المضادة الثانوية الموجهة ضد الأجسام المضادة الأولية وربطها fluorophore. يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، جبل ساترة ونلاحظ بواسطة المجهر مضان.
    2. الكشف عن الحمض النووي عن طريق PCR
      استخراج الحمض النووي من 100 إلى 200 ميكرولتر من coculture amoebal. الكشف عن الكائنات الدقيقة مع الاشعال عالمية تستهدف الجينات 16S الرنا الريباسي أو الاشعال محددة للأنواع ذات الأهمية مثل المتفطرات 24 ، الليجيونيلا 25 أو 26 أعضاء المتدثراوات.

    2. الإثراء Amoebal

    2.1. إعداد نموذج

    في resuspend العينات الصلبة وشبه الصلبة في نظام تقييم الأداء من قبل vortexing. الطرد المركزي تعليق على سرعة منخفضة (180 x ج) لمدة 10 دقيقة. وهذا يسمح إثراء الأميبات حرة المعيشة في بيليه. طاف يمكن استخدامها لcoculture amoebal وبيليه لتخصيب amoebal 21.

    2.2. إعداد المتوسطة

    1. إضافة 1.5 غرام من أجار إلى 100 مل من PAS والأوتوكلاف المتوسط ​​15 دقيقة في 121 درجة مئوية. صب المتوسطة الدافئة في أطباق بتري، والسماح يصلب في درجة حرارة الغرفة.
    2. تنمو القولونية (آي تي سي سي 25922) في مرق LB أو thioglycolate بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. يغسل البكتيريا مرتين مع برنامج تلفزيوني و resuspend لهم في PAS المتوسط. تمييع 10X في PAS وتنتشر 2-3 مل من هذا التخفيف على لوحة PAS أجار واسمحوا الجافة.

    الحمار = "jove_step"> 2.3. عينة التلقيح

    إضافة قطرة من العينة (أو قطعة من فلتر) على جانب واحد من لوحة والسماح لها بالتدفق على طبق بيتري لتشكيل خط في وسط الطبق.

    2.4. النمو Amoebal وثقافة فرعية amoebal

    1. مراقبة طبق بيتري اليومية. إذا تم الكشف عن جبهة الهجرة amoebal، قطع قطعة صغيرة من أجار في الجبهة الهجرة وتطعيم طبق بتري NNA الطازجة مغطاة حشيش E. القولونية.
    2. تكرار إعادة التلقيح عدة مرات تبعا لنقاء العينة، من أجل الحصول على ثقافة نقية من سلالة amoebal معين.

    2.5. الأميبات والبكتيريا توصيف

    1. تتخلص الخلايا و resuspend لهم في نظام تقييم الأداء.
    2. استخراج الحمض النووي وتحديد هوية الأميبات و / أو endosymbionts البكتيرية بواسطة PCR والتسلسل (16S الرنا الريباسي التضخيم للبكتيريا، التركيب. 18S الرنا الريباسي لالأميبات وتسلسلها، على سبيل المثال).
      3. <لى> استخدام هذه الخلايا في كشط PAS لتطعيم الأميبات الطازجة وإجراء coculture amoebal للكشف عن البكتيريا ربما موجودة في العينة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام coculture amoebal وتخصيب amoebal، مجموعة كاملة من البكتيريا البيئية و / أو المسببة للأمراض تم اكتشاف (الجدول 1).

وقد استخدم coculture Amoebal لدينا مجموعة وغيرها لتحليل العينات البيئية، ومحطات معالجة المياه وشبكات توزيع المياه. وهناك مجموعة واسعة من الكائنات الدقيقة يمكن أن تكون معزولة مع هذه التقنية. البكتيريا الأكثر شيوعا التي يعزلها coculture amoebal هي أعضاء في جنس المتفطرة التي يمكن استردادها من محطات معالجة المياه وشبكات المياه من 13،14،24،27،28. البكتيريا والأنواع α-proteobacteria ويمكن أيضا أن تكون معزولة عن محطات معالجة المياه وشبكات المياه من المستشفى 14،24،28-31. تم عزل العديد من الأنواع ذات الصلة الكلاميديا ​​أيضا من مياه النهر ومرافق معالجة المياه، كما هو الحال مثلا استريلا lausannensis (أرقام 2B-C 12،15،32،33.

ق ق = "jove_content"> استخدام coculture amoebal، تم اكتشاف الفيروسات العملاقة مختلفة، مثل Mimivirus، مرسيليا وLausannevirus 34-36. هذه الفيروسات كلها قادرة على إصابة وتتكاثر داخل الأميبات وتقديم مرحلة الكسوف نموذجية من نمط حياتهم الفيروسية. يعتبر mimivirus كما معتدل الممرض رئة الإنسان منذ المتورطين في وجود عدوى عرضية من فني المختبر الذي كان يعاني من التهاب رئوي 37. الإمراضية المحتملة للفيروسات العملاقة الأخرى لا يزال يتعين التحقيق فيها.

وغالبا ما تستخدم لتخصيب Amoebal بالتوازي مع amoebal coculture. وبالتالي، عند التحقيق في نظام محطة معالجة المياه وشبكة المياه المصب، تم الكشف عن 25 سلالات amoebal مختلفة، منها 12 يتفق مع الأنواع الجديدة 14. كانت الأميبات حاضرا في كل خطوة من خطوات تنقية المياه وتوزيعها، مما يدل على أن مقاومة هذه الأولانيات إلى المعالجة بالأوزون والكلور. الخلايا البكتيريا المشتركيونيتبول أيضا يتم الكشف في هذه الأميبات، والتي تبين أهمية الأميبات السكان الأصليين في نقل البكتيريا داخل الخلايا 14. في دراسة أخرى، الأميبات يمكن عزلها عن نظام توزيع المياه في مستشفى 24. إن الغالبية العظمى من السلالات المعزولة في هذه الدراسة يتفق مع الدودي الهارتمانيلة، الذي هو بطبيعة الحال قادرة على البقاء على قيد الحياة في درجات حرارة عالية نسبيا. يمكن أن يتم الكشف عن العديد من البكتيريا، مثل البكتيريا المستروحة في الأميبات الأصلية 24. مثال آخر من البكتيريا الموجودة في الأميبا محددة هو Parachlamydia acantamoebae. تم عزل هذه البكتيريا المرتبطة الكلاميديا ​​من الغشاء المخاطي للأنف من المتطوعات عن طريق تخصيب amoebal (الشكل 2A) 9 و هو عامل المحتملة للالتهاب الرئوي 38. وهذا يدل مرة أخرى على أهمية الأميبات في الصيانة وتشتت مسببات الأمراض البكتيرية التي قد تكون المسببة للأمراض وخاصة بالنسبة للimmunocompromisإد المرضى 39.

الشكل 1
الشكل 1. الخطوط العريضة للcoculture amoebal وتخصيب amoebal تصف الخطوات الهامة من هذه التقنيات اثنين. (مقتبس من 40). انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 2
الشكل 2. أمثلة من البكتيريا التي اكتشفها coculture amoebal والمراقبة مع وسائل تلطيخ مختلفة. A) تلون مكورة اصابة الأميبات Parachlamydia acanthamoebae قاعة مع تعديل طريقة Romanowsky 24 ساعة بعد الإصابة، مع التكبير من 1،000 X. هي ملطخة البكتيريا في الزرقاء (أrrows). BC) المجهر الإلكتروني من استريلا lausannensis تبين التشكل نموذجية نجم الهيئات الابتدائية (السهام).

الجدول 1. أمثلة من البكتيريا من فئات مختلفة اكتشفها coculture amoebal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

coculture Amoebal وتخصيب amoebal طرق فعالة التي سمحت للعزل العديد من الأنواع البكتيرية وamoebal جديدة. النتائج التي تم الحصول عليها مع هذه الأساليب تؤكد وجود في كل مكان من كلا الأميبات والبكتيريا مقاومة الأميبا في البيئة، وهذا هو الأكثر أهمية في شبكات المياه من صنع الإنسان التي تعتبر أن يسيطر عليها العلاجات الكيميائية مثل الكلور والمعالجة بالأوزون. coculture Amoebal وتخصيب amoebal هي أدوات أساسية لعزل وزراعة هذه الكائنات الحية الدقيقة المحرضة والحصول على سلالات نقية في الثقافة من أجل مزيد من الدراسة ثم إلى الأحياء والمرضية. في الآونة الأخيرة، وقد تم تكييف هذه الطريقة لارتفاع الإنتاجية عزل الفيروسات العملاقة 41. وبالمثل، قد يكون آليا coculture amoebal وتستخدم تقنية روتينية لاختبار الجودة الميكروبيولوجية للعينات البيئية وشبكات المياه من صنع الإنسان، مثل مياه الشرب.

coculture Amoebal يمكنأن يؤديها مع أنواع مختلفة من الأميبات. نحن نفضل عادة إلى استخدام الشوكميبة castellanii أو A. polyphaga نظرا لأنها أقل عرضة للتكيس من الدودي الهارتمانيلة ونظرا لأنها تظهر طائفة المضيف كبيرة نسبيا. أنواع أخرى يمكن استخدامها ولكن يجب أن تتكيف البروتوكول ومرق. وقد ثبت مؤخرا أن A. lenticulana (آي تي سي سي 30841) يمكن استخدامها في نفس الظروف التي A. castellanii أو A. polyphaga ولكن لديه قابلية للإصابة مختلفة 42. لمنع تكيس، فمن المهم استخدام حرارة الحضانة منخفضة نسبيا (أقل من 30 درجة مئوية) والحفاظ على جو مرطب.

الجدير بالذكر، فإن التكرار المستمر من المتكافلة amoebal لا يؤدي بالضرورة إلى تحلل amoebal وعندما تبحث على وجه التحديد لالمتكافلة، وفحص بواسطة المجهر و / أو PCR ينبغي أن يقوم بصورة منتظمة. لتجنب تحلل أو مفرزة من م amoebal LLS بسبب النمو الزائد للبكتريا، فمن المفيد إجراء التلقيح العينات الملوثة بشدة باستخدام التخفيفات التسلسلي 10 أضعاف.

ومع ذلك، هذه التقنيات لديها قيود. ويرجع ذلك إلى استخدام الأنواع amoebal واحدة، قد لا تسمح coculture amoebal عزلة من البكتيريا التي تستخدم كما خزان الأنواع amoebal آخر. علاوة على ذلك، قد تكون غير قادر على التكاثر في هذه الأنواع E. amoebal محددة قد يكون غاب المروج القولونية وتخصيب amoebal. اعتمادا على خصائص البكتيريا أو الأميبات التحقيق، قد يكون من الضروري اختبار وسائل الإعلام المختلفة، والأنواع المختلفة amoebal والأنواع البكتيرية المختلفة لتغذية الأميبات (الأمعائية doacae وبعض سلالات الزائفة هي بدائل جيدة). التلوث الجرثومي من الأميبات أو وسائل الإعلام المستخدمة لcoculture amoebal قد يحدث وربما يؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة. A السيطرة السلبية وبالتالي إلزامية لتجنب مثل هذه النتائج الإيجابية الكاذبة.

المحتويات "> وفي الختام، coculture amoebal وتخصيب amoebal هي نهجين متكاملين التي تمثل أدوات مثيرة للاهتمام لتحديد البيئة والتنوع البيولوجي من الأميبات حرة المعيشة والبكتيريا مقاومة الأميبات. هذه التقنيات تسمح اكتشاف العديد من الأنواع الجديدة، بما في ذلك الأميبات، البكتيريا والفيروسات العملاقة، والتي تشكل الأساس لدراسات مستقبلية للتحقيق في تسببها هذه الكائنات الدقيقة الرواية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

نشكر العلاقات العامة. برنار لا سكولا للحصول على النصائح التقنية مفيدة ومناقشة مثيرة للاهتمام على coculture amoebal وتخصيب amoebal. نشكر أيضا الدكتور فنسنت توماس لمساعدته في تنفيذ هذه التقنية في مختبرنا.

Materials

فئة أمثلة الأنواع مرجع
α-proteobacteria Odyssella thelassonicensis 10
ب proteobacteria بيركولديريا الشرهة 36
ز proteobacteria الليجيونيلا drancourtii 26
متدثرات استريلا lausannensis 30
Flavobacteriae Amoebophilus asiaticus 37
Actinobacteria المتفطرات النيابة. 38
Name Company Catalog Number Comments
Glucose monohydrate Merck, Darmstadt, Germany 108342
0.22 μm pore size membrane Merck Millipore, Darmstadt, Germany SCVPU11RE
proteose peptone Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 211693
yeast extract Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 212750
Cell culture flasks Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 353135
Kova slide Hycor, Indianapolis, IN 87144
cell culture microplates Corning Inc, Corning, NY 3524
Diff-Quik staining kit Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany 130832
Ziehl fuchsin Fluka, St-Louis, MI 21820
basic fuchsin Sigma, St-Louis, MI 857843
Phenol Sigma, St-Louis, MI P1037 Corrosive and mutagenic
malachite green oxalate Fluka, St-Louis, MI 63160
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 15710
Saponin Sigma, St-Louis, MI 84510

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fraser, D. W., et al. Legionnaires' disease: description of an epidemic of pneumonia. New Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).
  2. McDade, J. E., et al. Legionnaires' disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease. New Engl. J. Med. 297, 1197-1203 (1977).
  3. Rowbotham, T. J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae. J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).
  4. Rodriguez-Zaragoza, S. Ecology of free-living amoebae. Crit. Rev. Microbiol. 20, 225-241 (1994).
  5. Booton, G. C., Visvesvara, G. S., Byers, T. J., Kelly, D. J., Fuerst, P. A. Identification and distribution of Acanthamoeba species genotypes associated with nonkeratitis infections. J Clin. Microbiol. 43, 1689-1693 (2005).
  6. Brussow, H. Bacteria between protists and phages: from antipredation strategies to the evolution of pathogenicity. Molecular microbiology. 65, 583-589 (2007).
  7. Greub, G., Raoult, D. Microorganisms resistant to free-living amoebae. Clin. Microbiol. Rev. 17, 413-433 (2004).
  8. Thomas, V., McDonnell, G., Denyer, S. P., Maillard, J. Y. Free-living amoebae and their intracellular pathogenic microorganisms: risks for water quality. FEMS Microbiol Rev. 34, 231-259 (2010).
  9. Birtles, R. J., Rowbotham, T. J., Storey, C., Marrie, T. J., Raoult, D. Chlamydia-like obligate parasite of free-living amoebae. Lancet. 349, 925-926 (1997).
  10. Amann, R., et al. Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia spp. Appl. Environ. Microbiol. 63, 115-121 (1997).
  11. Birtles, R. J., et al. Candidatus Odyssella thessalonicensis' gen. nov., sp. nov., an obligate intracellular parasite of Acanthamoeba species. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 63-72 (2000).
  12. Thomas, V., Casson, N., Greub, G. Criblamydia sequanensis, a new intracellular Chlamydiales isolated from Seine river water using amoebal co-culture. Environ. Microbiol. 8, 2125-2135 (2006).
  13. Pagnier, I., Raoult, D., La Scola, B. Isolation and identification of amoeba-resisting bacteria from water in human environment by using an Acanthamoeba polyphaga co-culture procedure. Environ. Microbiol. 10, 1135-1144 (2008).
  14. Thomas, V., Loret, J. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environ. Microbiol. 10, 2728-2745 (2008).
  15. Corsaro, D., et al. Novel Chlamydiales strains isolated from a water treatment plant. Environ. Microbiol. 11, 188-200 (2009).
  16. Goy, G., Croxatto, A., Greub, G. Waddlia chondrophila enters and multiplies within human macrophages. Microbes Infect. 10, 556-562 (2008).
  17. Kebbi-Beghdadi, C., Cisse, O., Greub, G. Permissivity of Vero cells, human pneumocytes and human endometrial cells to Waddlia chondrophila. Microbes Infect. 13, 566-574 (2011).
  18. Kebbi-Beghdadi, C., Batista, C., Greub, G. Permissivity of fish cell lines to three Chlamydia-related bacteria: Waddlia chondrophila, Estrella lausannensis and Parachlamydia acanthamoebae. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 339-345 (2011).
  19. Fry, N. K., Rowbotham, T. J., Saunders, N. A., Embley, T. M. Direct amplification and sequencing of the 16S ribosomal DNA of an intracellular Legionella species recovered by amoebal enrichment from the sputum of a patient with pneumonia. FEMS Microbiol. Lett. 67, 165-168 (1991).
  20. Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila serogroup 1 from human feces with use of amebic cocultures. Clin. Infect. Dis. 26, 502-503 (1998).
  21. Greub, G., La Scola, B., Raoult, D. Amoebae-resisting bacteria isolated from human nasal swabs by amoebal coculture. Emerging Infect. Dis. 10, 470-477 (2004).
  22. Isenberg, H. D. Clinical microbiology procedures handbook. , (1992).
  23. Gimenez, D. F. Staining Rickettsiae in Yolk-Sac Cultures. Stain Technol. 39, 135-140 (1964).
  24. Thomas, V., Herrera-Rimann, K., Blanc, D. S., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-resisting bacteria in a hospital water network. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2428-2438 (2006).
  25. Miyamoto, H., et al. Development of a new seminested PCR method for detection of Legionella species and its application to surveillance of legionellae in hospital cooling tower water. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2489-2494 (1997).
  26. Lienard, J., et al. Development of a new chlamydiales-specific real-time PCR and its application to respiratory clinical samples. J. Clin. Microbiol. 49, 2637-2642 (2011).
  27. Wang, Y., Ogawa, M., Fukuda, K., Miyamoto, H., Taniguchi, H. Isolation and identification of mycobacteria from soils at an illegal dumping site and landfills in Japan. Microbiol. Immunol. 50, 513-524 (2006).
  28. Corsaro, D., Pages, G. S., Catalan, V., Loret, J. F., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-associated bacteria in water treatment plants. Int. J. Hygiene Environ. Health. 213, 158-166 (2010).
  29. La Scola, B., et al. Legionella drancourtii sp. nov., a strictly intracellular amoebal pathogen. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 699-703 (2004).
  30. Thomas, V., Casson, N., Greub, G. New Afipia and Bosea strains isolated from various water sources by amoebal co-culture. Syst. Appl. Microbiol. 30, 572-579 (2007).
  31. La Scola, B., et al. Amoeba-resisting bacteria and ventilator-associated pneumonia. Emerging Infect. Dis. 9, 815-821 (2003).
  32. Collingro, A., et al. Recovery of an environmental Chlamydia strain from activated sludge by co-cultivation with Acanthamoeba sp. Microbiology. 151, 301-309 (2005).
  33. Lienard, J., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Estrella lausannensis, a new star in the Chlamydiales order. Microbes Infect. 13, 1232-1241 (2011).
  34. La Scola, B., et al. A giant virus in amoebae. Science. 299, 2033 (2003).
  35. Boyer, M., et al. Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21848-21853 (2009).
  36. Thomas, V., et al. Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets. Environ. Microbiol. 13, 1454-1466 (2011).
  37. Raoult, D., Renesto, P., Brouqui, P. Laboratory infection of a technician by mimivirus. Ann. Internal Med. 144, 702-703 (2006).
  38. Greub, G. Parachlamydia acanthamoebae, an emerging agent of pneumonia. Clin. Microbiol. Infect. 15, 18-28 (2009).
  39. Lamoth, F., Greub, G. Amoebal pathogens as emerging causal agents of pneumonia. FEMS Microbiol. Rev. 34, 260-280 (2010).
  40. Lienard, J. G. Ch. 6. Environmental microbiology, current technology and water applications. Ashbolt, K., Sen, N. J. , Caister Academic Press. 143-162 (2011).
  41. Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ. Microbiol. , (2012).
  42. Ovrutsky, A. R., et al. Cooccurrence of Free-Living Amoebae and Nontuberculous Mycobacteria in Hospital Water Networks, and Preferential Growth of Mycobacterium avium in Acanthamoeba lenticulata. Appl. Environ. Microbiol. 79, 3185-3192 (2013).

Tags

علم المناعة، العدد 80، ميكروبيولوجيا البيئة، علم الأحياء الدقيقة التربة، المياه ميكروبيولوجيا، الأميبات، والكائنات الدقيقة، coculture، تلزم البكتيريا داخل الخلايا
اكتشاف جديد بين الخلايا مسببات الأمراض عن طريق Amoebal Coculture والمناهج Amoebal التخصيب
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., … More

Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches. J. Vis. Exp. (80), e51055, doi:10.3791/51055 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter