Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Funn av nye Intracellulære patogener ved Amoebal coculture og Amoebal berikelse Approaches

Published: October 27, 2013 doi: 10.3791/51055
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Microbiology, University Hospital Center and University of Lausanne

Summary

Amoebal coculture er et cellekultur-system ved hjelp av vedheftende amøber for selektivt å øke intracellulære patogener i stand til å motstå fagocytiske celler som amøber og makrofager. Det representerer dermed et viktig verktøy for å oppdage nye smittestoffer. Amoebal berikelse tillater oppdagelse av nye amoebal arter og deres spesifikke intracellulære bakterier.

Abstract

Intracellulære patogener som legionella, mykobakterier og Chlamydia-lignende organismer som er vanskelige å isolere, fordi de ofte vokser dårlig eller ikke i det hele tatt på selektive media som vanligvis brukes for å dyrke bakterier. Av denne grunn ble mange av disse patogener oppdaget nylig eller følgende viktige utbrudd. Disse patogener er ofte forbundet med amøber, som tjener som vertscellen, og tillater overlevelse og vekst av bakterier. Vi har tenkt her for å gi en demonstrasjon av to teknikker som tillater isolering og karakterisering av intracellulære patogener til stede i kliniske eller miljøprøver: den amoebal coculture og amoebal berikelse. Amoebal coculture tillater utvinning av intracellulære bakterier ved å inokulere den undersøkte prøven på en amoebal plen som kan være infisert og lysert ved de intracellulære bakterier tilstede i prøven. Amoebal anrikning tillater gjenvinning av amøber tilstede i en klinisk eller miljøprøve. Ther kan føre til oppdagelse av nye amoebal arter, men også av nye intracellulære bakterier som vokser spesielt i disse amøber. Sammen utgjør disse to teknikkene bidra til å oppdage nye intracellulære bakterier i stand til å vokse i amøber. På grunn av deres evne til å infisere amøber og motstå fagocytose, kan disse intracellulære bakterier også unngå fagocytose av makrofager og dermed være patogene for høyere eukaryoter.

Introduction

Før ankomsten av molekylær diagnose, ble mikroorganismer som er tilstede i miljøet nisjer eller i kliniske prøver ofte påvises ved å dyrke dem på forskjellige selektive medier, hovedsakelig på agar i petriskåler. Fenotyper av bakterielle kolonier og deres metabolsk aktivitet da lov bakteriell klassifisering på artsnivå. Kjøttkraft kan også benyttes for å øke følsomheten for påvisning. Imidlertid har begge teknikkene tillater ikke gjenvinning av bakterier som vokser langsomt eller ikke i det hele tatt i disse media. Dette er grunnen til at molekylære metoder er så mye brukt i dag. Likevel, påvisning av DNA gir ingen anelse om levedyktigheten til bakteriene. Videre contrarily til kulturen, molekylære tilnærminger ikke fører til en belastning som kan bli ytterligere karakterisert.

Studerer patogener som vokser dårlig på fast medium eller som trenger celler til å vokse er komplisert. De fleste av disse "vanskelige å vokse" bakterier er kresen intracellulære bakterier, ofte oppdaget og preget etter store utbrudd som det var tilfellet for Legionella pneumophila. Denne bakterien ble preget etter et utbrudd som fant sted under en American Legion konvensjonen. Så mange som 182 personer ble smittet og 29 døde som følge av en alvorlig lungebetennelse 1,2. Det ble senere vist at amøber var de naturlige verter for denne bakterien og at deres tilstedeværelse i hotellet air-condition-systemet og vann nettverk var på opprinnelsen til utbruddet av den såkalte legionella tre.

Amøber er til stede over hele verden, og ble isolert fra jord, luft, vann og neseslimhinnen av humane frivillige (gjennomgått i 4). Disse "frittlevende" amøber er generelt dele selvstendig i miljøet, men kan av og til invadere givende vertene fem. Amøber feed på ulike mikroorganismer gjennom fagocytose og påfølgende lysosomal fordøyelsen ved hydrolases seks. Mange fakultative eller obligate intracellulære bakterier er i stand til å motstå fordøyelsen og derved infisere og dividere in amøber som f.eks Legionella, Chlamydia-relaterte bakterier eller mykobakterier (gjennomgått i 7 og 8). Frittlevende amøber sannsynlig representerer en viktig potensielt reservoar for intracellulære bakterier som ennå ikke er oppdaget. Dette førte vår gruppe å gjennomføre i Lausanne to viktigste teknikkene, kalt amoebal coculture og amoebal berikelse, som tillot forskjellige grupper for å isolere flere nye obligat intracellulære mikroorganismer fra ulike miljøprøver 9-15.

Siden amøber er profesjonelle fagocytter beite på bakterier, kan en bakterie i stand til å motstå fagocytose og å vokse inni disse protister også kolonisere menneskelige fagocytter og være sykdomsfremkallende mot mennesker. Dette ble delvis påvist for noen Chlamydia-relaterte bakterier, for eksempel Waddlia chondrophila. W. chondrophila kan vokse, ikke bare i amøber, men også i flere celletyper som for eksempel pattedyr epitelceller, makrofager og fiskecellelinjer 16-18. Den amoebal coculture vises også relevant for å påvise intracellulære bakterier i kliniske prøver 19,20, inkludert avføring som er tungt forurenset med ulike bakteriearter 21.

Her beskriver vi de viktigste trinnene i amoebal coculture og amoebal berikelse, inkludert (a) behandling av miljømessige eller kliniske prøver, (b) veksten av amøber på axenic media og på en bakteriell plenen av Escherichia coli og (c) valg og karakterisering av intracellulære bakterier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Amoebal coculture

1.1 Prøvepreparering

  1. Miljøprøve
    1. Vannprøver
      Filtrer vannprøven (500 ml til 1 L) gjennom et 0,22 mikrometer porestørrelse membran. Deretter riste membranen i sidens amøbe saltvann mellom PAS (120 mg NaCl, 4 mg MgSo4 • 7H 2 O, 4 mg CaCl 2 • 2H 2 O, 142 mg Na 2 HPO 4, og 136 mg av KH 2 PO 4 i 1 liter destillert vann).
    2. Faste prøver
      Resuspender faste prøver som jord-eller sandprøver og semi-faste prøver slik som aktivert slam i destillert vann eller PBS, og filtrere dem gjennom et 0,22 mikrometer porestørrelse membran. Deretter riste membranen i PAS.
    3. Prøver sterkt forurenset med endogen amøber og protozoer
      Først sedimentere prøvene ved lav hastighet sentrifugering (180 xg) for 10 min eller filtrere det gjennom en 5 um porestørrelse membran. Videre behandler supernatant (henholdsvis Filtrat), som i 1.1.1.
      Merk: Andre dekontaminering teknikker kan bli brukt til ytterligere rense miljøprøver: Varm opp prøven ved 50 ° C i 30 min eller behandle med sure eller basiske løsninger 14.
  2. Klinisk prøve
    Prosess kliniske prøver, avhengig av deres fysikalsk-kjemiske egenskaper. Filter eller sentrifuge-væsker for å fjerne store urenheter. Susp faste prøver. For å benytte vev, male dem, for eksempel ved hjelp av en Douce-homogeneiser eller glassperler, og lysere cellene for å frigjøre de intracellulære bakterier.

1.2 amøber forberedelse

  1. Buljong forberedelse
    Forbered følgende media: en rik media inneholder pepton, gjærekstrakt og glukose (PYG; 100 g proteose peptone, 10 g av gjærekstrakt, 4,9 g MgSo4 • 7H 2O, 5 g natrium-citrat • 2 H 2 O, 0,1 g Fe (NH4) 2 (SO 4) 2 • 6 H 2 O, 1,7 g KH 2 PO 4, 1,97 g Na HPO 2 4 • 7H 2 O , 45 g glukose, og 0,295 g CaCl 2 i 5 l destillert vann), og et ikke-næringsmedium, for eksempel for PAS Acanthamoeba arter.
  2. Amoebal kultur
    1. Dyrke amøber (fortrinnsvis Acanthamoeba castellanii ATCC 30010 eller A. Polyphaga Linc-Ap1) ved 25 ° C i cellekulturflasker som inneholder 30 ml PYG medium.
    2. Høste amøber ved kraftig risting av kolben og sentrifuger cellesuspensjonen i 10 min ved 1500 x g. Vask pelleten to ganger med PAS medium. Tell cellene i en Kova lysbilde og justere volumet for å oppnå en suspensjon av 5 x 10 5 celler per ml.
    3. Overfør amoebal suspensjonen i mikroplater. Bruk en ml per brønn for 12 - og 24-well plater, 500 pl for 48-brønners plater og 300 pl for 96-brønners plater. Inkuber mikro i minst 2 timer ved 25 ° C. Dette gjør det mulig for sedimentering og feste av amøber til bunnen av hver brønn.

1,3 coculture

  1. Sample vaksinasjon
    1. Inokuler plate fra 2.3.3 med serielle fortynninger av prøven fra 1,1 eller 1,2, vanligvis med 10-ganger fortynningsserier, som starter med 100 pl ufortynnet prøve.
    2. Sentrifuger mikroplate ved 1800 xg i 10 min til sediment på amoebal plenen potensielt mikroorganismer til stede i prøven. Dette øker kontakten og fagocytose av mikroorganismer av amøber.
    3. Inkuber platene i 45 minutter ved 25 ° C og vaskes tre ganger med PAS ved å erstatte mediet med friskt PAS. Tilsett 1 ml per brønn av PAS, med eller uten tilsetning av antibiotika (streptomycin, penicillin, gentamycin og / eller vancomycin), avhengig av bacterial arter som søkte på.
    4. Inkuber mikroplate ved 32 ° C i en fuktet atmosfære for å unngå encystment av amøber. Observere hver brønn daglig med en 20X objektiv å påvise tilstedeværelse av bakterier invaderende og Lysing amøber.
    5. I tilfelle av lysis, utføre en subkultur på fersk amøber ved inokulering av 100 mL av cocultures i et monosjikt på ca 10 5 amøber / cm 2. Å spesifikt isolere en gitt bakteriearter, vaksinere også bestemt agar materiale utviklet for disse bakteriene (dvs. BCYE agar for Legionella spp..).
    6. I fravær av lysis, ta 100 ul av cocultures 4-7 dager etter den første inokulering og inokulere en frisk amoebal kultur på 900 ul i en 24-brønns plate. Ved hurtig lysering av amøber observeres uten spredning av bakterier, kan et virus være til stede. I dette tilfellet, filtrere supernatanten på 0,22 mikrometer og bruke den filtrerte suspensjon for å infisere frisk amøber.

    1,4 Bakteriell isolering og karakterisering

    1. Bakteriell farging
      Utfør cocultures direkte på glassDekk i 24-brønnen mikro. Fjern mediet og utføre flekker eller immunfluorescens.
      1. Modifisert Romanowsky farging
        1. La dekk tørr. Fordyp dekk fem ganger i fikserløsning (2 mg / L Fast Green i metanol).
        2. Fordyp dekk fem ganger i farging løsning I (1,22 g / L eosin G i fosfatbuffer pH 6,6)
        3. Til slutt nedsenkes dekk 5 ganger i farvestoffoppløsningen II (1,1 g / L tiazin i fosfatbuffer pH 6,6).
        4. Skyll prøven forsiktig med destillert vann. La tørke og observere ved mikroskopi.
      2. Ziehl-Neelsen flekker
        1. La dekk tørr. Dekk prøven med Ziehl fuchsin. Varm opp fargestoff med en flamme før damper vises.
        2. Kul ved romtemperatur i minst 5 minog skyll med destillert vann. Dekk prøven med 3% saltsyreoppløsning i isopropanol i 2 minutter, og skylles med destillert vann.
        3. Lokk til 30 sek med metylenblått og skyll med destillert vann. La tørke og observere ved mikros 22.
      3. Gimenez farging
        1. Tilbered en basis fuksin stamløsning ved å blande 100 ml av 10% basis fuchsin (10 g av grunn fuksin i 100 ml 95% etanol), 250 ml 4% vandig fenol og 650 ml destillert vann. Inkuber ved 37 ° C i 48 timer før bruk.
        2. La dekk tørke og fikse ved å føre det gjennom flammen. Dekk prøven med friskt, filtrert basis fuchsin (4 ml av basis fuksin stamløsning i 10 ml 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 7,45) i 2 min.
        3. Skyll prøven med vann og inkuberes i malakittgrønt (0,8% i destillert vann) i 10 sek. Skyll igjen med vann og gjenta malakitt grønn farging. Rens på nytt med vann. La dekk tørr, mount det, og observere ved mikros 23.
      4. Immunfluorescens
        1. Fiks dekkglass ved å inkubere i metanol i 5 min, eller med paraformaldehyd 4% i 10 min.
        2. Vask tre ganger med PBS og inkuberes i 2 timer i blokkeringsløsning (5% BSA, 0,1% saponin i PBS) ved romtemperatur.
        3. Inkuber dekkglass i 1 time i blokkeringsoppløsning inneholdende antistoffer dannet mot mikroorganismen er av interesse.
        4. Vaskes igjen tre ganger i PBS og inkuberes i 1 time med et sekundært antistoff rettet mot det primære antistoff og koblet til en fluorofor. Vask tre ganger med PBS, montere dekkglass og observere ved fluorescens mikroskopi.
    2. DNA påvisning ved PCR
      Utdrag DNA 100-200 mL av amoebal coculture. Oppdage mikroorganismer med universelle primere rettet mot 16S rRNA-genet eller spesifikke primere for arter av interesse som mykobakterier 24, Legionella 25 eller medlemmer av Chlamydiales 26..

    2. Amoebal Enrichment

    2.1. Prøveopparbeidelse

    Susp solide og halvfaste prøver i PAS ved å virvle. Sentrifuger suspensjonen ved lav hastighet (180 x g) i 10 min. Dette gjør at anriking av frittlevende amøber i pelleten. Supernatanten kan bli brukt for amoebal coculture og pelleten for amoebal anrikning 21..

    2.2. Medium forberedelse

    1. Tilsett 1,5 g agar i 100 ml PAS og autoklaveres mediet 15 min ved 121 ° C. Hell den varme medium i Petri-skåler og lar størkne ved romtemperatur.
    2. Grow Escherichia coli (ATCC 25922) i LB eller thioglycolate kjøttkraft over natten ved 37 ° C. Vask bakteriene to ganger med PBS og resuspender dem i PAS medium. Spe 10x i PAS og spre 2-3 ml av denne fortynning på en PAS agar plate og la tørke.

    Tilsett en dråpe av prøve (eller et stykke filter) på den ene side av platen og la den strømme over på petriskål for å danne en linje i midten av skålen.

    2.4. Amoebal vekst og amoebal subkultur

    1. Observer petriskål daglig. Hvis det oppdages en amoebal migrasjon foran, skjære ut en liten del av agar ved migrasjon foran og vaksinere en frisk NNA petriskål dekket med en plen av E. coli.
    2. Gjenta reinokulasjon flere ganger, avhengig av renheten av prøven, for å få en ren kultur av en gitt amoebal belastning.

    2,5. Amøber og bakterier karakterisering

    1. Skrap cellene og resuspender dem i PAS.
    2. Pakk DNA og fastslå identiteten til amøber og / eller bakterie endosymbionts ved PCR og sekvensering (16S rRNA forsterkning for bakterier, resp. 18S rRNA for amøber og sekvensering, for eksempel).
      3. <li> Bruk disse skrapt celler i PAS å vaksinere friske amøber og utføre en amoebal coculture å påvise bakterier muligens tilstede i prøven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bruke amoebal coculture og amoebal berikelse, ble en hel rekke miljø-og / eller sykdomsfremkallende bakterier oppdaget (Tabell 1).

Amoebal coculture ble brukt av vår gruppe og andre til å analysere miljøprøver, vannbehandlingsanlegg og vanndistribusjonssystemer. Et bredt spekter av mikroorganismer kan bli isolert med denne teknikken. De vanligste bakterier isolert etter amoebal coculture er medlemmer av Mycobacterium slekten som kan utvinnes fra renseanlegg og fra vann nettverk 13,14,24,27,28. Legionella og α-Proteobacteria arter kan også bli isolert fra vannrenseanlegg og fra sykehus vann nettverk 14,24,28-31. Flere Chlamydia-relaterte arter ble også isolert fra elvevann og vannbehandlingsanlegg, som for eksempel Estrella lausannensis (Tall 2B-C 12,15,32,33.

34-36. Disse virusene er alle i stand til å infisere og formere seg i amøber og presentere en formørkelse fase typisk for deres viral livsstil. De mimivirus regnes som en mild menneskelige lunge patogen siden det ble innblandet i en utilsiktet smitte fra en laboratorietekniker som led av lungebetennelse 37. Potensielle patogenitet av andre gigantiske virus fortsatt trenger å bli undersøkt.

Amoebal berikelse ble ofte brukt i parallell til amoebal coculture. Dermed når etterforsker et vannbehandlingsanlegg systemet og nedstrøms vannledningsnettet, 25 forskjellige amoebal stammer har blitt oppdaget, hvorav 12 samsvarer med nye arter 14. Amøber var tilstede på alle trinn i vannrensing og distribusjon, noe som indikerer en motstand på disse protister til ozonation og klorering. Intracellulære bakterier could også påvises i disse amøber, viser viktigheten av opprinnelig amøber i overføring av intracellulære bakterier 14. I en annen studie ble amøber isoleres fra vannfordelingssystem for et sykehus 24.. En stor majoritet av de stammer isolert i denne studien tilsvarte Hartmannella vermiformis, noe som er selvsagt i stand til å overleve ved relativt høye temperaturer. Flere bakterier, slik som Legionella pneumophila kunne påvises i den stedegne amøber 24.. Et annet eksempel på bakterier som finnes i en bestemt amøbe er Parachlamydia acantamoebae. Dette Chlamydia relaterte bakterien ble isolert fra neseslimhinnen av kvinnelige frivillige ved amoebal berikelse (Figur 2A) 9, og er en potensiell agent for lungebetennelse 38. Dette viser igjen viktigheten av amøber i vedlikehold og spredning av bakterielle patogener som kan være spesielt patogene for immunocompromised pasienter 39.

Figur 1
Figur 1. Omrisset av amoebal coculture og amoebal berikelse beskriver viktige trinn i disse to teknikkene. (Tilpasset fra 40). Klikk her for å se større figur .

Fig. 2
Figur 2. Eksempler på bakterier oppdaget av amoebal coculture og deres observasjon med ulike fargemetoder. A) Farging av Parachlamydia acanthamoebae Halls coccus infiserer amøber med modifisert Romanowsky metode 24 timer etter smitte, med en forstørrelse på 1000 X. Bakterier er farget i blått (enrrows). BC) Elektronmikroskopi av Estrella lausannensis viser typisk stjerne morfologi av elementære organer (piler).

Tabell 1. Eksempler på bakterier fra forskjellige klasser oppdaget av amoebal coculture.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Amoebal coculture og amoebal berikelse er effektive metoder som tillot isolering av mange nye bakterielle og amoebal arter. Resultater oppnådd med disse metodene bekrefter den allestedsnærværende tilstedeværelse av både amøber og Amoeba-motstand bakterier i miljøet, og mest interessant i menneskeskapte vann nettverk som anses for å være styrt av kjemiske behandlinger som klorering og ozonering. Amoebal coculture og amoebal berikelse er viktige verktøy for å isolere og dyrke disse potensielt patogene mikroorganismer og å få stammer i renkultur for deretter å videre studere deres biologi og patogenitet. Nylig ble denne metoden tilpasset for høy gjennomstrømming isolering av gigantiske virus 41. Tilsvarende kan amoebal coculture automatiseres og brukes som en rutinemessig teknikk for å teste mikrobiologisk kvalitet av miljøprøver og menneskeskapte vannsystemer, for eksempel drikkevann.

Amoebal coculture kanutføres med ulike arter av amøber. Vi foretrekker vanligvis å bruke Acanthamoeba castellanii eller A. Polyphaga siden de er mindre utsatt for encystment enn Hartmannella vermiformis og siden de utviser en relativt stor host spektrum. Andre arter som kan anvendes, men protokollen og kokes skal tilpasses. Det har nylig blitt vist at A. lenticulana (ATCC 30841) kan brukes i de samme vilkår som A. castellanii eller A. Polyphaga men har forskjellig mottakelighet for infeksjon 42. For å hindre encystment, er det viktig å bruke en relativt lav inkubering temperatur (under 30 ° C), og for å opprettholde en fuktig atmosfære.

Verdt å merke seg, vil den vedvarende replikering av amoebal symbionter ikke nødvendigvis føre til amoebal lyse og da spesielt på jakt etter symbionter, bør screening ved mikroskopi og / eller PCR være systematisk utført. For å unngå nedbrytning eller avløsning av amoebal ce lls på grunn av bakteriell overvekst, er det nyttig å utføre inokulering av sterkt forurensede prøver med 10-ganger seriefortynninger.

Likevel, disse teknikkene har begrensninger. På grunn av bruken av en enkelt amoebal art, kan det hende at amoebal coculture ikke tillater isolering av bakterier som brukes som reservoar annen amoebal arter. Dessuten kan slike spesifikke amoebal arter være ute av stand til å spre seg på E. coli plener og kan gå glipp av amoebal berikelse. Avhengig av egenskapene til bakterier eller amøber undersøkt, kan det være nødvendig å teste ulike medier, ulike amoebal arter og ulike bakteriearter å mate amøber (Enterobacter doacae og noen Pseudomonas stammer er gode alternativer). Bakteriell forurensning av amøber i mediene som brukes for amoebal coculture kan oppstå og kan føre til falske positive resultater. En negativ kontroll er således obligatorisk å unngå slike falske positive resultater.

innhold "> I konklusjonen, amoebal coculture og amoebal berikelse er to komplementære tilnærminger som representerer interessante verktøy for å angi økologi og biologisk mangfold av frittlevende amøber og av amøber-motstand bakterier. Disse teknikkene gjør at oppdagelsen av mange nye arter, inkludert amøber, bakterier og gigantiske virus, danner grunnlaget for fremtidige studier for å undersøke patogenitet av disse nye mikroorganismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker Pr. Bernard La Scola for nyttige tekniske råd og interessant diskusjon om amoebal coculture og amoebal berikelse. Vi takker også Dr Vincent Thomas for hans hjelp i å implementere teknikken i vårt laboratorium.

Materials

Klasse Arter eksempler Referanse
α-proteobacteria Odyssella thelassonicensis 10
b-proteobacteria Burkholderia cepacia 36
g-proteobacteria Legionella drancourtii 26
Chlamydia Estrella lausannensis 30
Flavobacteriae Amoebophilus asiaticus 37
Actinobacteria Mykobakterier spp.. 38
Name Company Catalog Number Comments
Glucose monohydrate Merck, Darmstadt, Germany 108342
0.22 μm pore size membrane Merck Millipore, Darmstadt, Germany SCVPU11RE
proteose peptone Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 211693
yeast extract Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 212750
Cell culture flasks Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 353135
Kova slide Hycor, Indianapolis, IN 87144
cell culture microplates Corning Inc, Corning, NY 3524
Diff-Quik staining kit Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany 130832
Ziehl fuchsin Fluka, St-Louis, MI 21820
basic fuchsin Sigma, St-Louis, MI 857843
Phenol Sigma, St-Louis, MI P1037 Corrosive and mutagenic
malachite green oxalate Fluka, St-Louis, MI 63160
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 15710
Saponin Sigma, St-Louis, MI 84510

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fraser, D. W., et al. Legionnaires' disease: description of an epidemic of pneumonia. New Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).
  2. McDade, J. E., et al. Legionnaires' disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease. New Engl. J. Med. 297, 1197-1203 (1977).
  3. Rowbotham, T. J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae. J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).
  4. Rodriguez-Zaragoza, S. Ecology of free-living amoebae. Crit. Rev. Microbiol. 20, 225-241 (1994).
  5. Booton, G. C., Visvesvara, G. S., Byers, T. J., Kelly, D. J., Fuerst, P. A. Identification and distribution of Acanthamoeba species genotypes associated with nonkeratitis infections. J Clin. Microbiol. 43, 1689-1693 (2005).
  6. Brussow, H. Bacteria between protists and phages: from antipredation strategies to the evolution of pathogenicity. Molecular microbiology. 65, 583-589 (2007).
  7. Greub, G., Raoult, D. Microorganisms resistant to free-living amoebae. Clin. Microbiol. Rev. 17, 413-433 (2004).
  8. Thomas, V., McDonnell, G., Denyer, S. P., Maillard, J. Y. Free-living amoebae and their intracellular pathogenic microorganisms: risks for water quality. FEMS Microbiol Rev. 34, 231-259 (2010).
  9. Birtles, R. J., Rowbotham, T. J., Storey, C., Marrie, T. J., Raoult, D. Chlamydia-like obligate parasite of free-living amoebae. Lancet. 349, 925-926 (1997).
  10. Amann, R., et al. Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia spp. Appl. Environ. Microbiol. 63, 115-121 (1997).
  11. Birtles, R. J., et al. Candidatus Odyssella thessalonicensis' gen. nov., sp. nov., an obligate intracellular parasite of Acanthamoeba species. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 63-72 (2000).
  12. Thomas, V., Casson, N., Greub, G. Criblamydia sequanensis, a new intracellular Chlamydiales isolated from Seine river water using amoebal co-culture. Environ. Microbiol. 8, 2125-2135 (2006).
  13. Pagnier, I., Raoult, D., La Scola, B. Isolation and identification of amoeba-resisting bacteria from water in human environment by using an Acanthamoeba polyphaga co-culture procedure. Environ. Microbiol. 10, 1135-1144 (2008).
  14. Thomas, V., Loret, J. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environ. Microbiol. 10, 2728-2745 (2008).
  15. Corsaro, D., et al. Novel Chlamydiales strains isolated from a water treatment plant. Environ. Microbiol. 11, 188-200 (2009).
  16. Goy, G., Croxatto, A., Greub, G. Waddlia chondrophila enters and multiplies within human macrophages. Microbes Infect. 10, 556-562 (2008).
  17. Kebbi-Beghdadi, C., Cisse, O., Greub, G. Permissivity of Vero cells, human pneumocytes and human endometrial cells to Waddlia chondrophila. Microbes Infect. 13, 566-574 (2011).
  18. Kebbi-Beghdadi, C., Batista, C., Greub, G. Permissivity of fish cell lines to three Chlamydia-related bacteria: Waddlia chondrophila, Estrella lausannensis and Parachlamydia acanthamoebae. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 339-345 (2011).
  19. Fry, N. K., Rowbotham, T. J., Saunders, N. A., Embley, T. M. Direct amplification and sequencing of the 16S ribosomal DNA of an intracellular Legionella species recovered by amoebal enrichment from the sputum of a patient with pneumonia. FEMS Microbiol. Lett. 67, 165-168 (1991).
  20. Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila serogroup 1 from human feces with use of amebic cocultures. Clin. Infect. Dis. 26, 502-503 (1998).
  21. Greub, G., La Scola, B., Raoult, D. Amoebae-resisting bacteria isolated from human nasal swabs by amoebal coculture. Emerging Infect. Dis. 10, 470-477 (2004).
  22. Isenberg, H. D. Clinical microbiology procedures handbook. , (1992).
  23. Gimenez, D. F. Staining Rickettsiae in Yolk-Sac Cultures. Stain Technol. 39, 135-140 (1964).
  24. Thomas, V., Herrera-Rimann, K., Blanc, D. S., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-resisting bacteria in a hospital water network. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2428-2438 (2006).
  25. Miyamoto, H., et al. Development of a new seminested PCR method for detection of Legionella species and its application to surveillance of legionellae in hospital cooling tower water. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2489-2494 (1997).
  26. Lienard, J., et al. Development of a new chlamydiales-specific real-time PCR and its application to respiratory clinical samples. J. Clin. Microbiol. 49, 2637-2642 (2011).
  27. Wang, Y., Ogawa, M., Fukuda, K., Miyamoto, H., Taniguchi, H. Isolation and identification of mycobacteria from soils at an illegal dumping site and landfills in Japan. Microbiol. Immunol. 50, 513-524 (2006).
  28. Corsaro, D., Pages, G. S., Catalan, V., Loret, J. F., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-associated bacteria in water treatment plants. Int. J. Hygiene Environ. Health. 213, 158-166 (2010).
  29. La Scola, B., et al. Legionella drancourtii sp. nov., a strictly intracellular amoebal pathogen. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 699-703 (2004).
  30. Thomas, V., Casson, N., Greub, G. New Afipia and Bosea strains isolated from various water sources by amoebal co-culture. Syst. Appl. Microbiol. 30, 572-579 (2007).
  31. La Scola, B., et al. Amoeba-resisting bacteria and ventilator-associated pneumonia. Emerging Infect. Dis. 9, 815-821 (2003).
  32. Collingro, A., et al. Recovery of an environmental Chlamydia strain from activated sludge by co-cultivation with Acanthamoeba sp. Microbiology. 151, 301-309 (2005).
  33. Lienard, J., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Estrella lausannensis, a new star in the Chlamydiales order. Microbes Infect. 13, 1232-1241 (2011).
  34. La Scola, B., et al. A giant virus in amoebae. Science. 299, 2033 (2003).
  35. Boyer, M., et al. Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21848-21853 (2009).
  36. Thomas, V., et al. Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets. Environ. Microbiol. 13, 1454-1466 (2011).
  37. Raoult, D., Renesto, P., Brouqui, P. Laboratory infection of a technician by mimivirus. Ann. Internal Med. 144, 702-703 (2006).
  38. Greub, G. Parachlamydia acanthamoebae, an emerging agent of pneumonia. Clin. Microbiol. Infect. 15, 18-28 (2009).
  39. Lamoth, F., Greub, G. Amoebal pathogens as emerging causal agents of pneumonia. FEMS Microbiol. Rev. 34, 260-280 (2010).
  40. Lienard, J. G. Ch. 6. Environmental microbiology, current technology and water applications. Ashbolt, K., Sen, N. J. , Caister Academic Press. 143-162 (2011).
  41. Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ. Microbiol. , (2012).
  42. Ovrutsky, A. R., et al. Cooccurrence of Free-Living Amoebae and Nontuberculous Mycobacteria in Hospital Water Networks, and Preferential Growth of Mycobacterium avium in Acanthamoeba lenticulata. Appl. Environ. Microbiol. 79, 3185-3192 (2013).

Tags

Immunologi Environmental Microbiology Soil Mikrobiologi Vann Mikrobiologi amøber mikroorganismer coculture obligate intracellulære bakterier
Funn av nye Intracellulære patogener ved Amoebal coculture og Amoebal berikelse Approaches
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., … More

Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches. J. Vis. Exp. (80), e51055, doi:10.3791/51055 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter