Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Ontdekking van nieuwe intracellulaire pathogenen door Amoebal Coculture en Amoebal Verrijking benaderingen

Published: October 27, 2013 doi: 10.3791/51055
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Microbiology, University Hospital Center and University of Lausanne

Summary

Amoebal coculture is een celcultuur systeem met aanhangend amoeben om selectief te groeien intracellulaire pathogenen kunnen fagocytcellen zoals amoeben en macrofagen weerstaan. Het vormt dus een belangrijk instrument om nieuwe infectieuze agentia te ontdekken. Amoebal verrijking laat ontdekking van nieuwe amoebal soorten en hun specifieke intracellulaire bacteriën.

Abstract

Intracellulaire pathogenen zoals Legionella, mycobacteriën en Chlamydia-achtige organismen moeilijk te isoleren omdat ze groeien vaak slecht of helemaal niet op selectieve media die gewoonlijk worden gebruikt om bacteriën te kweken. Om deze reden zijn veel van deze pathogenen zijn pas onlangs ontdekt of volgende belangrijke uitbraken. Deze pathogenen zijn vaak geassocieerd met amoeben, die als gastheer-cel en kan de overleving en groei van de bacteriën. We zijn van plan hier een demonstratie van twee technieken die isolatie en karakterisering van intracellulaire pathogenen aanwezig in klinische of milieu monsters laten leveren: de amoebal co-cultuur en de amoebal verrijking. Amoebal coculture maakt terugwinning van intracellulaire bacteriën door het enten van het te onderzoeken monster op een amoebal grasveld dat besmet kan en de intracellulaire bacteriën in het monster gelyseerd. Amoebal verrijking laat herstel van amoeben aanwezig zijn in een klinische of milieu-monster. Thwordt kan leiden tot de ontdekking van nieuwe amoebal soorten, maar ook van nieuwe intracellulaire bacterie die specifiek groeien in deze amoeben. Samen vormen deze twee technieken helpen om nieuwe intracellulaire bacteriën kunnen groeien in amoeben ontdekken. Vanwege hun vermogen om amoeben infecteren en tegen fagocytose, kunnen deze intracellulaire bacteriën ook ontsnappen fagocytose door macrofagen en dus pathogeen hogere eukaryoten.

Introduction

Vóór de komst van de moleculaire diagnostiek, werden micro-organismen in het milieu niches of in klinische monsters vaak gedetecteerd door het cultiveren van hen op verschillende selectieve media, vooral op agar in petrischalen. Het fenotype van de bacteriële kolonies en hun metabolische activiteit toegestaan ​​dan bacteriële classificatie op soortniveau. Bouillon kan ook worden gebruikt om de gevoeligheid van detectie te vergroten. Echter, beide technieken niet het herstel van de bacteriën die langzaam of niet groeien op alle op deze media toe te staan. Dit is de reden waarom moleculaire benaderingen zo wijd tegenwoordig gebruikt. Niettemin detectie van DNA geeft geen aanwijzing op de levensvatbaarheid van de bacteriën. Bovendien, in tegenstelling tot cultuur moleculaire benaderingen niet tot een stam die verder kan worden gekarakteriseerd.

Studeren ziekteverwekkers die slecht groeien op vaste media of die moeten cellen om te groeien is ingewikkeld. De meeste van deze 'moeilijk te kweken' bacteriën fastidious intracellulair bacteriën, vaak ontdekt en gekarakteriseerd volgende grote uitbraken zoals het geval was voor Legionella pneumophila was. Deze bacterie werd gekenmerkt na een uitbraak die is opgetreden tijdens een American Legion conventie. Maar liefst 182 mensen werden besmet en 29 overleden als gevolg van een ernstige longontsteking 1,2. Later werd aangetoond dat amoeben waren de natuurlijke gastheren van deze bacterie en dat hun aanwezigheid in het hotel airconditioning systeem en waternetwerken was aan de oorsprong van de uitbraak van de ziekte de zogenaamde veteranenziekte 3.

Amoeben aanwezig wereldwijd en werden geïsoleerd uit grond, lucht, water en het neusslijmvlies van menselijke vrijwilligers (beoordeeld in 4). Deze "free-living" amoeben zijn over het algemeen verdelen autonoom in het milieu, maar kan af en toe binnenvallen tolerante systemen 5. Amoeben voeden zich met verschillende micro-organismen door middel van fagocytose en de daaropvolgende lysosomale vertering door hydrolases 6. Veel facultatieve of obligate intracellulaire bacteriën kunnen digestie weerstaan ​​en daardoor infecteren en verdelen amoeben bijvoorbeeld Legionella, Chlamydia verwante bacteriën of mycobacteriën (beoordeeld 7 en 8). Amoeben waarschijnlijk een belangrijke potentiële reservoir vormen voor intracellulaire bacteriën die nog niet zijn ontdekt. Dit leidde onze groep te implementeren in Lausanne twee belangrijkste technieken, genaamd amoebal coculture en amoebal verrijking, waardoor verschillende groepen een aantal nieuwe obligaat intracellulaire micro-organismen te isoleren van verschillende milieu-monsters 9-15.

Aangezien amoeben zijn professionele fagocyten grazen op bacteriën, kan een bacterie in staat om fagocytose te weerstaan ​​en te groeien binnen deze protisten ook koloniseren menselijke fagocyten en pathogeen ten opzichte van mensen. Dit werd gedeeltelijk aangetoond voor enkele Chlamydia-verwante bacteriën, zoals Waddlia chondrophila. W. chondrophila kan groeien, niet alleen in amoeben als in verscheidene celtypes zoals zoogdiercellen epitheelcellen, macrofagen, en vis cellijnen 16-18. De amoebal coculture wordt ook relevant voor het detecteren van intracellulaire bacteriën in klinische monsters 19,20, inclusief ontlasting die zwaar verontreinigd met verschillende bacteriesoorten 21.

Hier beschrijven we de belangrijkste stappen van amoebal coculture en amoebal verrijking, waaronder (a) behandeling van milieu of klinische monsters, (b) de groei van amoeben op axenic media en een bacteriedek van Escherichia coli en (c) de selectie en karakterisering van intracellulaire bacteriën.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Amoebal Coculture

1.1 Voorbereiding van het monster

  1. Milieumonster
    1. Watermonsters
      Filtreer het watermonster (500 ml tot 1 L) door een 0,22 urn poriegrootte membraan. Dan schud het membraan in Page's amoebe zoutoplossing medium PAS (120 mg NaCl, 4 mg MgSÜ4 • 7H 2 O, 4 mg CaCl2 • 2H 2 O, 142 mg Na 2 HPO 4, en 136 mg KH 2 PO 4 in 1 liter gedestilleerd water).
    2. Vaste monsters
      Resuspendeer vaste monsters zoals grond of zand monsters en semi-vaste stoffen zoals geactiveerde slib in gedestilleerd water of PBS en te filteren door een 0,22 urn poriegrootte membraan. Dan schud het membraan in PAS.
    3. Monsters sterk verontreinigd met endogene amoeben en protozoa
      Sediment eerst de monsters door de lage snelheid centrifugeren (180 xg) for 10 min of te filteren door middel van een 5 um poriegrootte membraan. Verdere verwerking van de supernatant (respectievelijk filtraat), zoals in 1.1.1.
      Opmerking: Andere ontsmetting kan worden gebruikt om verder te ontsmetten milieumonsters: Verwarm het monster bij 50 ° C gedurende 30 minuten of behandelen met zure of basische oplossingen 14.
  2. Klinische steekproef
    Proces klinische monsters afhankelijk van hun fysisch-chemische eigenschappen. Filter of centrifuge vloeistoffen grote onzuiverheden te verwijderen. Resuspendeer vaste monsters. Weefsels gebruiken, maal ze, bijvoorbeeld door een dounce homogeneiser of glazen kralen, en lyseren van de cellen om de intracellulaire bacteriën vrij.

1.2 Amoeben voorbereiding

  1. Bouillon voorbereiding
    Bereid de volgende media: een rijk medium dat pepton, gistextract en glucose (PYG, 100 g proteosepepton, 10 g gistextract, 4,9 g MgSO4 • 7H 2O, 5 g natriumcitraat • 2H 2 O, 0,1 g Fe (NH4) 2 (SO4) 2 • 6H 2 O, 1,7 g KH 2PO 4, 1,97 g Na 2 HPO 4 • 7H 2 O , 45 g glucose en 0,295 g CaCl2 in 5 L gedestilleerd water) en een niet-voedende medium zoals PAS voor Acanthamoeba soorten.
  2. Amoebal cultuur
    1. Cultiveren amoeben (bij voorkeur Acanthamoebacastellanii ATCC 30010 of A. Polyphaga Linc-Ap1) bij 25 ° C in celkweek kolven met 30 ml PYG medium.
    2. Oogst de amoeben door krachtig schudden van de kolf en centrifugeer de celsuspensie gedurende 10 minuten bij 1500 x g. Was de pellet tweemaal met PAS medium. Tel de cellen in een Kova glijbaan en het volume aan te passen aan een suspensie van 5 x 10 5 cellen per ml te verkrijgen.
    3. Breng de amoebal schorsing in microplates. Gebruik 1 ml per putje voor 12 - en 24-well platen, 500 ul van 48-well platen en 300 pi van 96-well platen. Incubeer de microplaat gedurende minstens 2 uur bij 25 ° C. Dit maakt sedimentatie en bevestiging van de amoeben onderaan elk putje.

1.3 Coculture

  1. Monster inenting
    1. Inoculeer de plaat 2.3.3 met seriële verdunningen van het monster van 1.1 of 1.2, meestal met 10-voudige verdunningsreeks, beginnend met 100 ul onverdund monster.
    2. Centrifugeer de microplaat bij 1800 xg gedurende 10 min naar het sediment op de amoebal gazon de micro-organismen die aanwezig kunnen zijn in het monster. Dit verhoogt contact en fagocytose van micro-organismen door amoeben.
    3. Incubeer de platen gedurende 45 min bij 25 ° C en was driemaal met PAS door vervanging van het medium met vers PAS. Voeg 1 ml per putje van PAS met of zonder toevoeging van antibiotica (streptomycine, penicilline, gentamicine en / of vancomycine), afhankelijk van de bacterial soorten die worden gezocht.
    4. Incubeer de microplaat bij 32 ° C in een bevochtigde atmosfeer encystment van amoeben voorkomen. Observeer elk putje dagelijks met een 20X doelstelling om de aanwezigheid van bacteriën binnenvallen en lyseren amoeben detecteren.
    5. Bij lysis Voer een subcultuur verse amoeben door inoculeren van 100 ul hulpkweken een monolaag van ongeveer 10 5 amoeben / cm 2. Om specifiek te isoleren een bepaalde bacteriesoort, te enten ook specifieke agar media ontworpen voor deze bacteriën (dwz BCYE agar voor Legionella spp.).
    6. Bij afwezigheid van lysis, neem 100 ul hulpkweken 6:56 dagen na de eerste inoculatie en beënt een nieuwe amoebal cultuur van 900 pl in een 24-wells plaat. Als snelle lysis van amoeben waargenomen zonder proliferatie van bacteriën, kan een virus aanwezig zijn. In dit geval, filtreer de supernatant bij 0,22 micrometer en met de suspensie gefiltreerd verse amoeben infecteren.

    1.4 Bacteriële isolatie en karakterisering

    1. Bacteriële kleuring
      Voer cocultures direct op glas dekglaasjes in 24-putjes. Verwijder het medium en vlekken of immunofluorescentie voeren.
      1. Gemodificeerde Romanowsky kleuring
        1. Laat het dekglaasje droog. Dompel het dekglaasje vijf keer in het fixeermiddel oplossing (2 mg / L snel groen in methanol).
        2. Dompel de dekglaasje vijf keer in de kleuring oplossing I (1,22 g / L Eosine G in fosfaatbuffer pH 6,6)
        3. Tot slot, dompel de dekglaasje 5 keer in de kleuring oplossing II (1,1 g / L thiazine in fosfaatbuffer pH 6,6).
        4. Spoel het monster met gedestilleerd water. Even laten drogen en te observeren met behulp van microscopie.
      2. Ziehl-Neelsen
        1. Laat het dekglaasje droog. Bedek het monster met Ziehl fuchsine. Verhit de kleurstof met een vlam tot dampen verschijnen.
        2. Koel bij kamertemperatuur gedurende ten minste 5 minutenen spoelen met gedistilleerd water. Bedek het monster met 3% zoutzuur oplossing in isopropanol gedurende 2 min en spoelen met gedestilleerd water.
        3. Dekking voor 30 sec met methyleenblauw en spoelen met gedistilleerd water. Even laten drogen en te observeren door microscopie 22.
      3. Gimenez kleuring
        1. Bereid een basisch fuchsine voorraadoplossing door het mengen van 100 ml 10% basisch fuchsine (10 g basisch fuchsine in 100 ml 95% ethanol), 250 ml 4% waterige fenol en 650 ml gedestilleerd water. Incubeer bij 37 ° C gedurende 48 uur voor gebruik.
        2. Laat het dekglaasje drogen en door het door de vlam te repareren. Bedek het monster met vers gefiltreerd basisch fuchsine (4 ml basisch fuchsine voorraadoplossing in 10 ml 0,1 M natriumfosfaatbuffer, pH 7,45) gedurende 2 minuten.
        3. Spoel het monster met water en incubeer in malachietgroen (0,8% in gedestilleerd water) gedurende 10 sec. Weer afspoelen met water en herhaal malachietgroen kleuring. Weer afspoelen met water. Laat het dekglaasje droog, mount het, en observeren door microscopie 23.
      4. Immunofluorescentie
        1. Bevestig het dekglaasje door incubatie in methanol gedurende 5 minuten of 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten.
        2. Was driemaal met PBS en incubeer gedurende 2 uur in blokkeeroplossing (5% BSA, 0,1% saponine in PBS) bij kamertemperatuur.
        3. Incubeer het dekglaasje gedurende 1 uur in blokkerende oplossing die antilichamen opgewekt tegen het micro-organisme plaats.
        4. Was opnieuw drie keer in PBS en incubeer gedurende 1 uur met een secundair antilichaam tegen het primaire antilichaam en aan een fluorofoor. Spoel driemaal met PBS, monteer de dekglaasje en observeren met behulp van fluorescentie microscopie.
    2. DNA detectie door PCR
      Extraheer DNA 100-200 ui amoebal coculture. Detecteren micro-organismen met universele primers gericht op de 16S rRNA-gen of specifieke primers voor soorten van belang, zoals mycobacteriën 24, Legionella 25 of leden van de Chlamydiales 26.

    2. Amoebal Verrijking

    2.1. Voorbereiding van het monster

    Resuspendeer vaste en semi-vaste monsters in PAS door vortexen. Centrifugeer de suspensie bij lage snelheid (180 x g) gedurende 10 minuten. Dit maakt verrijking van amoeben in de pellet. Het supernatant kan worden gebruikt voor amoebal coculture en de pellet gedurende amoebal verrijking 21.

    2.2. Mediumbereiding

    1. Voeg 1,5 g agar 100 ml autoclaaf PAS en het medium 15 minuten bij 121 ° C. Giet de warme in petrischalen en laat stollen op kamertemperatuur.
    2. Groei Escherichia coli (ATCC 25922) in LB of thioglycolaat bouillon overnacht bij 37 ° C. Was de bacteriën tweemaal met PBS en resuspendeer ze in PAS medium. Verdunnen 10x in PAS en verspreiden 2-3 ml van deze verdunning op een PAS agar plaat en laat drogen.

    Voeg een druppel monster (of een stukje filter) aan een zijde van de plaat en het laten stromen via petrischaal op een lijn in het midden van de schaal te vormen.

    2.4. Amoebal groei en amoebal subcultuur

    1. Let op de petrischaal dagelijks. Als een amoebal migratie voorzijde wordt gedetecteerd, snijd een klein stukje van agar aan de migratie voor en te enten een frisse NNA petrischaal bedekt met een grasveld van E. coli.
    2. Herhaal de reïnoculatie meermaals afhankelijk van de zuiverheid van het monster, om een ​​zuivere cultuur van een bepaalde amoebal stam hebben.

    2.5. Amoeben en bacteriën karakterisering

    1. Schraap de cellen en resuspendeer ze in PAS.
    2. Extraheer DNA en bepalen de identiteit van amoeben en / of bacteriële endosymbionten door PCR en sequencing (16S rRNA versterking voor bacteriën, resp. 18S rRNA voor amoeben en sequencing, bijvoorbeeld).
      3. <li> Gebruik deze geschraapt cellen in PAS frisse amoeben te enten en het uitvoeren van een amoebal coculture om bacteriën mogelijk aanwezig zijn in het monster te detecteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Met behulp amoebal coculture en amoebal verrijking, werden een hele reeks milieu-en / of pathogene bacteriën ontdekt (tabel 1).

Amoebal coculture werd gebruikt door onze groep en anderen om milieu-monsters, waterzuiveringsinstallaties en water distributie systemen te analyseren. Een breed scala aan micro-organismen kunnen worden geïsoleerd met deze techniek. De meest voorkomende bacteriën geïsoleerd door amoebal coculture zijn lid van de Mycobacterium genus die kunnen worden teruggevorderd van waterzuiveringsinstallaties en van waternetwerken 13,14,24,27,28. Legionella en α-proteobacteriën soorten kunnen ook worden geïsoleerd van waterzuiveringsinstallaties en uit het ziekenhuis waternetwerken 14,24,28-31. Verschillende Chlamydia-verwante soorten werden ook geïsoleerd van rivierwater en installaties voor waterbehandeling, zoals bijvoorbeeld Estrella lausannensis (figuren 2B-C 12,15,32,33.

34-36. Deze virussen zijn allemaal in staat tot infectie en vermenigvuldiging binnen amoeben en presenteren een eclips fase typisch voor hun virale levensstijl. De mimivirus wordt beschouwd als een milde menselijke long pathogeen omdat het werd betrokken bij een toevallige infectie van een laborant die longontsteking 37 lijden. Potentiële pathogeniteit van andere reusachtige virussen moet nog worden onderzocht.

Amoebal verrijking werd vaak gebruikt in parallel met coculture amoebal. Dus, bij het ​​onderzoeken van een waterzuiveringsinstallatie systeem en de downstream waternetwerk, 25 verschillende amoebal stammen zijn gevonden, waarvan 12 overeenkwamen met nieuwe soorten 14. Amoeben waren aanwezig bij elke stap van waterzuivering en-distributie, met vermelding van een weerstand van deze protisten ozonisatie en chloreren. Intracellulaire bacteriën coOok ULD worden gedetecteerd in deze amoeben, die het belang van inheemse amoeben in de overdracht van intracellulaire bacteriën 14. In een andere studie konden amoeben worden geïsoleerd uit het waterdistributiesysteem van een ziekenhuis 24. Een grote meerderheid van de geïsoleerde stammen in dit onderzoek overeen met Hartmannella vermiformis, die van nature in staat om te overleven bij relatief hoge temperaturen. Verscheidene bacteriën zoals Legionella pneumophila konden worden gedetecteerd in de inheemse amoeben 24. Een ander voorbeeld van bacteriën gevonden in een bepaalde amoebe is Parachlamydia acantamoebae. Deze Chlamydia verband bacterie werd geïsoleerd uit neusslijmvlies van vrouwelijke vrijwilligers door amoebal verrijking (Figuur 2A) 9 en is een potentieel middel van longontsteking 38. Dit toont opnieuw het belang van amoeben in het onderhoud en verspreiding van bacteriële pathogenen die speciaal pathogeen voor immunocompromis misschiened patiënten 39.

Figuur 1
Figuur 1. Overzicht van amoebal coculture en amoebal verrijking beschrijven van de belangrijkste stappen van deze twee technieken. (Aangepast uit 40). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2
Figuur 2. Voorbeelden van bacteriën door amoebal coculture en hun waarneming met verschillende kleuringsmethoden ontdekt. ​​A) kleuring van Parachlamydia Acanthamoeben Hall's kokken infecteren amoeben met gemodificeerde Romanowsky methode 24 uur na infectie, met een vergroting van 1000 X. Bacteriën zijn gekleurd in het blauw (eenrrows). BC) Elektronenmicroscopie van Estrella lausannensis met de kenmerkende ster morfologie van elementaire lichamen (pijlen).

Tabel 1. Voorbeelden van bacteriën uit verschillende klassen door amoebal coculture ontdekt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Amoebal coculture en amoebal verrijking zijn efficiënte methoden die de isolatie van veel nieuwe bacteriële en amoebal soorten toegestaan. Resultaten verkregen met deze methoden bevestigen de alomtegenwoordige aanwezigheid van zowel amoeben en-amoebe weerstand bacteriën in het milieu, en het meest interessant in de mens veroorzaakte water netwerken die worden geacht te zijn gecontroleerd door chemische behandelingen, zoals chloreren en ozonisatie. Amoebal coculture en amoebal verrijking zijn essentiële instrumenten om te isoleren en te cultiveren deze potentieel pathogene micro-organismen en stammen in zuivere cultuur te verkrijgen om vervolgens verder te studeren hun biologie en pathogeniciteit. Onlangs werd deze werkwijze aangepast voor high-throughput isolatie van grote virussen 41. Evenzo kan amoebal coculture worden geautomatiseerd en gebruikt als een routine techniek om microbiologische kwaliteit van milieu-monsters en kunstmatige watersystemen, zoals het drinken van water te testen.

Amoebal coculture kanworden uitgevoerd met verschillende soorten amoeben. We meestal de voorkeur aan Acanthamoebacastellanii of A. gebruiken Polyphaga omdat ze minder gevoelig voor encystment dan Hartmannella vermiformis en Dankzij hun relatief grote gastheerspectra. Andere soorten kunnen worden gebruikt, maar het protocol en de bouillon moet worden aangepast. Het is onlangs aangetoond dat A. lenticulana (ATCC 30.841) kunnen worden gebruikt in dezelfde omstandigheden als A. castellanii of A. Polyphaga maar heeft verschillende gevoeligheid voor infecties 42. Om encystment voorkomen, is het belangrijk om een ​​relatief lage incubatietemperatuur (beneden 30 ° C) gebruikt en een vochtige atmosfeer te handhaven.

Opmerkelijk, zal de aanhoudende replicatie van amoebal symbionten niet noodzakelijk leiden tot amoebal lysis en wanneer specifiek op zoek naar symbionten, moet screening door microscopie en / of PCR systematisch worden uitgevoerd. Om lysis of loskomen van de amoebal ce voorkomen lls gevolg van bacteriële overgroei, is het nuttig inoculatie van zwaar vervuilde monsters uitvoeren met 10-voudige seriële verdunningen.

Toch hebben deze technieken beperkingen. Door het gebruik van een enkele soort amoebal, kan de co-cultuur amoebal niet toestaan ​​dat de isolatie van bacteriën die als reservoir amoebal andere soorten. Bovendien kunnen dergelijke specifieke amoebal soorten niet in staat om zich te verspreiden over E. zijn coli gazons en kan worden gemist door amoebal verrijking. Afhankelijk van de eigenschappen van de bacteriën of amoeben onderzocht, kan het noodzakelijk zijn om verschillende media, verschillende amoebal soorten en andere bacteriesoorten testen amoeben (Enterobacter doacae en sommige Pseudomonas stammen zijn goede alternatieven) voeden. Bacteriële contaminatie van amoeben of media die worden gebruikt voor amoebal coculture kan optreden en kan leiden tot valse positieve resultaten. Een negatieve controle is dus verplicht om deze vals-positieve resultaten te vermijden.

inhoud "> Tot slot, amoebal coculture en amoebal verrijking zijn twee complementaire benaderingen die interessante tools te vertegenwoordigen voor de ecologie en biodiversiteit van amoeben en-amoeben weerstand bacteriën opgeven. Deze technieken laten toe de ontdekking van vele nieuwe soorten, waaronder amoeben, bacteriën en virussen reus, die de basis vormen voor toekomstige studies om de pathogeniciteit van deze nieuwe micro-organismen te onderzoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Wij danken Pr. Bernard La Scola naar nuttige technische adviezen en interessante discussie over amoebal coculture en amoebal verrijking. We danken ook Dr Vincent Thomas voor zijn hulp bij de uitvoering van de techniek in ons laboratorium.

Materials

Klasse Soort voorbeelden Verwijzing
α-proteobacteria Odyssella thelassonicensis 10
b-proteobacteria Burkholderia cepacia 36
G-proteobacteria Legionella drancourtii 26
Chlamydiae Estrella lausannensis 30
Flavobacteriae Amoebophilus asiaticus 37
Actinobacteria Mycobacteriën spp. 38
Name Company Catalog Number Comments
Glucose monohydrate Merck, Darmstadt, Germany 108342
0.22 μm pore size membrane Merck Millipore, Darmstadt, Germany SCVPU11RE
proteose peptone Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 211693
yeast extract Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 212750
Cell culture flasks Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 353135
Kova slide Hycor, Indianapolis, IN 87144
cell culture microplates Corning Inc, Corning, NY 3524
Diff-Quik staining kit Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany 130832
Ziehl fuchsin Fluka, St-Louis, MI 21820
basic fuchsin Sigma, St-Louis, MI 857843
Phenol Sigma, St-Louis, MI P1037 Corrosive and mutagenic
malachite green oxalate Fluka, St-Louis, MI 63160
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 15710
Saponin Sigma, St-Louis, MI 84510

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fraser, D. W., et al. Legionnaires' disease: description of an epidemic of pneumonia. New Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).
  2. McDade, J. E., et al. Legionnaires' disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease. New Engl. J. Med. 297, 1197-1203 (1977).
  3. Rowbotham, T. J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae. J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).
  4. Rodriguez-Zaragoza, S. Ecology of free-living amoebae. Crit. Rev. Microbiol. 20, 225-241 (1994).
  5. Booton, G. C., Visvesvara, G. S., Byers, T. J., Kelly, D. J., Fuerst, P. A. Identification and distribution of Acanthamoeba species genotypes associated with nonkeratitis infections. J Clin. Microbiol. 43, 1689-1693 (2005).
  6. Brussow, H. Bacteria between protists and phages: from antipredation strategies to the evolution of pathogenicity. Molecular microbiology. 65, 583-589 (2007).
  7. Greub, G., Raoult, D. Microorganisms resistant to free-living amoebae. Clin. Microbiol. Rev. 17, 413-433 (2004).
  8. Thomas, V., McDonnell, G., Denyer, S. P., Maillard, J. Y. Free-living amoebae and their intracellular pathogenic microorganisms: risks for water quality. FEMS Microbiol Rev. 34, 231-259 (2010).
  9. Birtles, R. J., Rowbotham, T. J., Storey, C., Marrie, T. J., Raoult, D. Chlamydia-like obligate parasite of free-living amoebae. Lancet. 349, 925-926 (1997).
  10. Amann, R., et al. Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia spp. Appl. Environ. Microbiol. 63, 115-121 (1997).
  11. Birtles, R. J., et al. Candidatus Odyssella thessalonicensis' gen. nov., sp. nov., an obligate intracellular parasite of Acanthamoeba species. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 63-72 (2000).
  12. Thomas, V., Casson, N., Greub, G. Criblamydia sequanensis, a new intracellular Chlamydiales isolated from Seine river water using amoebal co-culture. Environ. Microbiol. 8, 2125-2135 (2006).
  13. Pagnier, I., Raoult, D., La Scola, B. Isolation and identification of amoeba-resisting bacteria from water in human environment by using an Acanthamoeba polyphaga co-culture procedure. Environ. Microbiol. 10, 1135-1144 (2008).
  14. Thomas, V., Loret, J. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environ. Microbiol. 10, 2728-2745 (2008).
  15. Corsaro, D., et al. Novel Chlamydiales strains isolated from a water treatment plant. Environ. Microbiol. 11, 188-200 (2009).
  16. Goy, G., Croxatto, A., Greub, G. Waddlia chondrophila enters and multiplies within human macrophages. Microbes Infect. 10, 556-562 (2008).
  17. Kebbi-Beghdadi, C., Cisse, O., Greub, G. Permissivity of Vero cells, human pneumocytes and human endometrial cells to Waddlia chondrophila. Microbes Infect. 13, 566-574 (2011).
  18. Kebbi-Beghdadi, C., Batista, C., Greub, G. Permissivity of fish cell lines to three Chlamydia-related bacteria: Waddlia chondrophila, Estrella lausannensis and Parachlamydia acanthamoebae. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 339-345 (2011).
  19. Fry, N. K., Rowbotham, T. J., Saunders, N. A., Embley, T. M. Direct amplification and sequencing of the 16S ribosomal DNA of an intracellular Legionella species recovered by amoebal enrichment from the sputum of a patient with pneumonia. FEMS Microbiol. Lett. 67, 165-168 (1991).
  20. Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila serogroup 1 from human feces with use of amebic cocultures. Clin. Infect. Dis. 26, 502-503 (1998).
  21. Greub, G., La Scola, B., Raoult, D. Amoebae-resisting bacteria isolated from human nasal swabs by amoebal coculture. Emerging Infect. Dis. 10, 470-477 (2004).
  22. Isenberg, H. D. Clinical microbiology procedures handbook. , (1992).
  23. Gimenez, D. F. Staining Rickettsiae in Yolk-Sac Cultures. Stain Technol. 39, 135-140 (1964).
  24. Thomas, V., Herrera-Rimann, K., Blanc, D. S., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-resisting bacteria in a hospital water network. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2428-2438 (2006).
  25. Miyamoto, H., et al. Development of a new seminested PCR method for detection of Legionella species and its application to surveillance of legionellae in hospital cooling tower water. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2489-2494 (1997).
  26. Lienard, J., et al. Development of a new chlamydiales-specific real-time PCR and its application to respiratory clinical samples. J. Clin. Microbiol. 49, 2637-2642 (2011).
  27. Wang, Y., Ogawa, M., Fukuda, K., Miyamoto, H., Taniguchi, H. Isolation and identification of mycobacteria from soils at an illegal dumping site and landfills in Japan. Microbiol. Immunol. 50, 513-524 (2006).
  28. Corsaro, D., Pages, G. S., Catalan, V., Loret, J. F., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-associated bacteria in water treatment plants. Int. J. Hygiene Environ. Health. 213, 158-166 (2010).
  29. La Scola, B., et al. Legionella drancourtii sp. nov., a strictly intracellular amoebal pathogen. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 699-703 (2004).
  30. Thomas, V., Casson, N., Greub, G. New Afipia and Bosea strains isolated from various water sources by amoebal co-culture. Syst. Appl. Microbiol. 30, 572-579 (2007).
  31. La Scola, B., et al. Amoeba-resisting bacteria and ventilator-associated pneumonia. Emerging Infect. Dis. 9, 815-821 (2003).
  32. Collingro, A., et al. Recovery of an environmental Chlamydia strain from activated sludge by co-cultivation with Acanthamoeba sp. Microbiology. 151, 301-309 (2005).
  33. Lienard, J., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Estrella lausannensis, a new star in the Chlamydiales order. Microbes Infect. 13, 1232-1241 (2011).
  34. La Scola, B., et al. A giant virus in amoebae. Science. 299, 2033 (2003).
  35. Boyer, M., et al. Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21848-21853 (2009).
  36. Thomas, V., et al. Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets. Environ. Microbiol. 13, 1454-1466 (2011).
  37. Raoult, D., Renesto, P., Brouqui, P. Laboratory infection of a technician by mimivirus. Ann. Internal Med. 144, 702-703 (2006).
  38. Greub, G. Parachlamydia acanthamoebae, an emerging agent of pneumonia. Clin. Microbiol. Infect. 15, 18-28 (2009).
  39. Lamoth, F., Greub, G. Amoebal pathogens as emerging causal agents of pneumonia. FEMS Microbiol. Rev. 34, 260-280 (2010).
  40. Lienard, J. G. Ch. 6. Environmental microbiology, current technology and water applications. Ashbolt, K., Sen, N. J. , Caister Academic Press. 143-162 (2011).
  41. Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ. Microbiol. , (2012).
  42. Ovrutsky, A. R., et al. Cooccurrence of Free-Living Amoebae and Nontuberculous Mycobacteria in Hospital Water Networks, and Preferential Growth of Mycobacterium avium in Acanthamoeba lenticulata. Appl. Environ. Microbiol. 79, 3185-3192 (2013).

Tags

Immunologie Environmental Microbiology Bodem Microbiologie Water Microbiologie Amoebae micro-organismen coculture obligaat intracellulaire bacterie
Ontdekking van nieuwe intracellulaire pathogenen door Amoebal Coculture en Amoebal Verrijking benaderingen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., … More

Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches. J. Vis. Exp. (80), e51055, doi:10.3791/51055 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter