Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Opdagelsen af ​​nye intracellulære patogener af Amoebal cokultur og Amoebal Enrichment Approaches

Published: October 27, 2013 doi: 10.3791/51055
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Microbiology, University Hospital Center and University of Lausanne

Summary

Amoebal cokultur er en cellekultur-system ved hjælp af klæbende amøber til selektivt at vokse intracellulære patogener stand til at modstå fagocytiske celler, såsom amøber og makrofager. Det udgør derfor et vigtigt redskab til at opdage nye smitstoffer. Amoebal berigelse tillader opdagelsen af ​​nye amoebal arter og deres specifikke intracellulære bakterier.

Abstract

Intracellulære patogener, såsom Legionella, mykobakterier og klamydia-lignende organismer er vanskelige at isolere, fordi de ofte vokser dårligt eller slet ikke på selektive medier, der normalt bruges til at dyrke bakterier. Af denne grund blev mange af disse patogener opdagede først for nylig eller efter vigtige udbrud. Disse patogener er ofte forbundet med amøber, der tjener som værtscelle og tillade overlevelse og vækst af bakterierne. Vi agter her for at give en demonstration af to teknikker, der tillader isolering og karakterisering af intracellulære patogener til stede i kliniske eller miljøprøver: den amoebal cokultur og amoebal berigelse. Amoebal cokultur tillader genvinding af intracellulære bakterier ved podning den undersøgte prøve på en amoebal græsplæne, der kan være inficeret og lyseres ved de intracellulære bakterier til stede i prøven. Amoebal berigelse tillader inddrivelse af amøber til stede i et klinisk eller miljømæssige prøve. Ther kan føre til opdagelsen af ​​nye amoebal arter, men også nye intracellulære bakterier vokser specifikt i disse amøber. Tilsammen udgør disse to teknikker bidrage til at opdage nye intracellulære bakterier i stand til at vokse i amøber. På grund af deres evne til at inficere amøber og modstå fagocytose, kan disse intracellulære bakterier også undslippe fagocytose af makrofager og dermed være patogen for højere eukaryoter.

Introduction

Før fremkomsten af ​​molekylær diagnose blev tilstedeværende mikroorganismer i miljøet nicher eller i kliniske prøver ofte detekteres ved at dyrke dem på forskellige selektive medier, hovedsagelig på agar i Petri-skåle. Fænotype de bakterielle kolonier og deres metaboliske aktivitet tilladt så bakteriel klassificering på artsniveau. Bouillon kan også anvendes til at øge følsomheden af ​​detektion. Men begge teknikker tillader ikke inddrivelse af bakterier, der vokser langsomt eller slet ikke på disse medier. Dette er grunden til, molekylære metoder er så udbredt i dag. Ikke desto mindre, påvisning af DNA giver ingen anelse om levedygtigheden af ​​bakterierne. Desuden Modsat til kultur, molekylære metoder ikke resulterer i en stamme, der kan yderligere beskrives.

Studere patogener, der vokser dårligt på faste medier eller det behov celler til at vokse, er kompliceret. De fleste af disse "vanskelige at dyrke" bakterier er kræsen intracellulære bakterier, ofte opdaget og karakteriseret efter store udbrud, som det var tilfældet for Legionella pneumophila. Denne bakterie blev karakteriseret efter et udbrud, der fandt sted under en American Legion konvention. Så mange som 182 personer blev smittet, og 29 døde på grund af en alvorlig lungebetændelse 1,2. Det blev senere vist, at amøber var selvskrevne til denne bakterie, og at deres tilstedeværelse i hotelsiden air-conditioning system og vand-net var på oprindelsen af udbruddet af den såkaldte legionærsyge 3.

Amøber er til stede over hele verden og er blevet isoleret fra jord, luft, vand og næseslimhinden af humane frivillige (revideret i 4). Disse "fritlevende" amøber generelt dividere autonomt i miljøet, men kan lejlighedsvis invadere eftergivende værter 5. Amøber foder på forskellige mikroorganismer gennem fagocytose og efterfølgende lysosomal fordøjelse af hydrolases 6.. Mange fakultative eller som forpligter intracellulære bakterier er i stand til at modstå fordøjelsen og dermed inficere og dividere i amøber som for eksempel Legionella, Chlamydia-relaterede bakterier eller mykobakterier (revideret i 7 og 8). Fritlevende amøber udgør sandsynligvis en vigtig potentiel reservoir for intracellulære bakterier, der endnu ikke er blevet opdaget. Dette førte vores gruppe at gennemføre i Lausanne to vigtigste teknikker, kaldet amoebal cokultur og amoebal berigelse, som tillod forskellige grupper til at isolere flere nye obligat intracellulære mikroorganismer fra forskellige miljøprøver 9-15.

Da amøber er professionelle fagocytter græsser på bakterier, kan en bakterie i stand til at modstå fagocytose og vokse inde i disse protister også kolonisere humane fagocytter og være patogene over for mennesker. Dette blev delvist påvist for nogle chlamydia-relaterede bakterier, såsom Waddlia chondrophila. W. chondrophila kan vokse ikke kun i amøber, men også i flere celletyper, såsom mammale epitelceller, makrofager og fisk cellelinier 16-18. Den amoebal cokultur vises også relevant for at detektere intracellulære bakterier i kliniske prøver 19,20, herunder afføring, som er stærkt forurenet med forskellige bakteriearter 21.

Her beskriver vi de vigtigste trin i amoebal cokultur og amoebal berigelse, herunder (a) behandling af miljø-eller kliniske prøver (b) væksten i amøber på axeniske medierne og på en bakteriel plæne af Escherichia coli og (c) udvælgelse og karakterisering af intracellulære bakterier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Amoebal cokultur

1.1 Prøveforberedelse

  1. Miljøprøve
    1. Vandprøver
      Prøven vand (500 ml til 1 liter) filtreres gennem et 0,22 um porestørrelse membran. Derefter ryste membranen i sidens amøbe saltvandsmedium PAS (120 mg NaCl, 4 mg MgSO4 • 7H 2 O, 4 mg CaCl2 • 2H 2 O, 142 mg Na 2 HPO 4, og 136 mg af KH 2 PO 4 i 1 liter destilleret vand).
    2. Faste prøver
      Resuspender faste prøver som jord eller sand prøver og halvfaste prøver, såsom aktiveret slam i destilleret vand eller PBS og filtrere dem gennem et 0,22 um porestørrelse membran. Derefter ryste membranen i PAS.
    3. Prøver stærkt forurenede med endogent amøber og protozoer
      Først sedimentere prøverne ved centrifugering ved lav hastighed (180 x g) for 10 minutter eller filtreres gennem et 5 um porestørrelse membran. Videre proces supernatanten (henholdsvis Filtrat), som i 1.1.1.
      Bemærk: Andre dekontamineret kan bruges til yderligere at rense miljøprøver: Prøven opvarmes ved 50 ° C i 30 min eller behandle med sure og basiske opløsninger 14.
  2. Klinisk prøve
    Behandle kliniske prøver afhængig af deres fysisk-kemiske egenskaber. Filtrer eller centrifuger væsker for at fjerne store urenheder. Resuspender faste prøver. For at bruge væv, male dem, for eksempel ved anvendelse af en Dounce homogeneiser eller glasperler, og lysere cellerne for at frigøre de intracellulære bakterier.

1.2 Amøber forberedelse

  1. Bouillon forberedelse
    Forbered følgende medier: a rich media indeholdende pepton, gærekstrakt og glucose (PYG, 100 g proteosepepton, 10 g gærekstrakt, 4,9 g MgSO4 • 7H 2O, 5 g natriumcitrat • 2H 2 O 0,1 g Fe (NH4) 2 (SO4) 2 • 6H 2 O, 1,7 g KH 2PO 4, 1,97 g Na 2 HPO 4 • 7H 2 O , 45 g glucose og 0,295 g CaCl2 i 5 liter destilleret vand) og et ikke-nærende medium, såsom PAS til Acanthamoeba arter.
  2. Amoebal kultur
    1. Dyrk amøber (fortrinsvis Acanthamoeba castellanii ATCC 30010 eller A. polyphaga Linc-Ap1) ved 25 ° C i celle kultur kolber indeholdende 30 ml PYG medium.
    2. Harvest amøber ved kraftig omrystning af kolben og centrifugere cellesuspensionen i 10 minutter ved 1.500 x g. Vask pellet to gange med PAS medium. Tælle celler i en Kova dias og justere lydstyrken for at opnå en suspension af 5 x 10 5 celler pr ml.
    3. Overfør amoebal suspensionen i mikroplader. Brug 1 ml per brønd i 12 - og 24-well plader, 500 pi i 48-brønds plader og 300 pi til 96-brønds plader. Inkubér mikropladen mindst 2 timer ved 25 ° C. Dette tillader sedimentation og fastgørelse af amøber til bunden af ​​hver brønd.

1.3 cokultur

  1. Prøve podning
    1. Podes pladen fra 2.3.3 med serielle fortyndinger af prøven fra 1.1 og 1.2, som regel med 10-fold fortyndingsrække startende med 100 pi ufortyndet prøve.
    2. Centrifugér mikropladen ved 1.800 xg i 10 min til sediment på amoebal græsplæne mikroorganismerne potentielt til stede i prøven. Dette forøger kontakt og fagocytose af mikroorganismer ved amøber.
    3. Pladerne inkuberes i 45 minutter ved 25 ° C og vaskes tre gange med PAS ved at erstatte medierne med frisk PAS. Der tilsættes 1 ml per brønd af PAS med eller uden tilsætning af antibiotika (streptomycin, penicillin, gentamicin og / eller vancomycin), afhængigt af bakterieal arter, der søges efter.
    4. Inkuberes mikropladen ved 32 ° C i en befugtet atmosfære for at undgå encystment af amøber. Overhold hver godt dagligt med en 20X målsætning at detektere tilstedeværelsen af ​​bakterier invaderer og lyserende amøber.
    5. I tilfælde af lysering udføre en subkultur på frisk amøber ved at pode 100 ul cokulturer til et monolag af omkring 10 5 amøber / cm2. Til specifikt at isolere en given bakterieart, podes også specifik agar medier designet til disse bakterier (dvs. BCYE agar for Legionella spp.).
    6. I mangel af lysering tage 100 pi cokulturer fire til syv dage efter den første inokulation og pode et frisk amoebal kultur 900 ul i et 24-brønds plade. Hvis hurtig lysering af amøber observeres uden spredning af bakterier, kan en virus være til stede. I dette tilfælde foretage supernatanten ved 0,22 um og anvende det filtrerede suspensionen til at inficere friske amøber.

    1.4 Bakteriel isolering og karakterisering

    1. Bakteriel farvning
      Udfør cokulturer direkte på dækglas i 24-brønds mikroplader. Fjern mediet og udføre farvning eller immunfluorescens.
      1. Modificeret Romanowsky farvning
        1. Lad dækglasset tørre. Fordyb dækglasset fem gange i fikseringsopløsning (2 mg / L Fast Green i methanol).
        2. Fordyb dækglasset fem gange i farvningsopløsningen I (1,22 g / L Eosin G i phosphatpuffer pH 6,6)
        3. Endelig fordybe dækglasset 5 gange i farveopløsning II (1,1 g / L thiazin i fosfatbuffer pH 6,6).
        4. Skyl prøven med destilleret vand. Lad tørre og iagttage ved mikroskopi.
      2. Ziehl-Neelsen farvning
        1. Lad dækglasset tørre. Dæk prøven med Ziehl fuchsin. Opvarm farvestoffet med en flamme, indtil dampene vises.
        2. Olien afkøles ved stuetemperatur i mindst 5 minog skyl med destilleret vand. Dæk prøven med 3% saltsyreopløsning i isopropanol i 2 minutter og skylles med destilleret vand.
        3. Cover for 30 sek med methylenblåt og skyl med destilleret vand. Lad tørre og iagttage ved mikroskopi 22..
      3. Gimenez farvning
        1. Forbered en basisk fuchsin stamopløsning ved at blande 100 ml 10% basisk fuchsin (10 g basisk fuchsin i 100 ml 95% ethanol), 250 ml 4% vandig phenol og 650 ml destilleret vand. Der inkuberes ved 37 ° C i 48 timer før brug.
        2. Lad dækglasset tørre og løse ved at føre den gennem ild. Dæk prøven med frisk filtreret basisk fuchsin (4 ml basisk fuchsin stamopløsning i 10 ml 0,1 M natriumphosphatpuffer, pH 7,45) i 2 minutter.
        3. Skyl prøven med vand, og der inkuberes i malakitgrønt (0,8% i destilleret vand) i 10 sek. Skyl igen med vand og gentage malakitgrønt farvning. Skyl igen med vand. Lad dækglasset tørre, mount det og observere ved mikroskopi 23.
      4. Immunofluorescens
        1. Lave dækglasset ved inkubering i methanol i 5 min eller med paraformaldehyd 4% i 10 min.
        2. Vask tre gange med PBS og inkuberes i 2 timer i en blokerende opløsning (5% BSA, 0,1% Saponin i PBS) ved stuetemperatur.
        3. Inkuber dækglasset i 1 time i en blokerende opløsning, der indeholder antistoffer mod mikroorganismen af ​​interesse.
        4. Vask igen tre gange i PBS og inkuberes i 1 time med et sekundært antistof rettet mod det primære antistof og knyttet til en fluorofor. Der vaskes tre gange med PBS, montere dækglasset og observere ved fluorescens mikroskopi.
    2. DNA-detektion ved PCR
      Uddrag DNA fra 100 til 200 pi amoebal cokultur. Detect mikroorganismer med universelle primere rettet mod 16S rRNA-genet eller specifikke primere for arter af interesse såsom mykobakterier 24, Legionella 25 eller medlemmer af Chlamydiales 26..

    2. Amoebal Berigelse

    2.1. Prøveforberedelse

    Resuspender faste og halvfaste prøver i PAS ved hvirvelbehandling. Centrifugeres suspensionen ved lav hastighed (180 xg) i 10 min. Dette tillader berigelse af fritlevende amøber i pelleten. Supernatanten kan anvendes til amoebal cokultur og pelleten for amoebal berigelse 21.

    2.2. Medium forberedelse

    1. Tilføj 1,5 g agar til 100 ml PAS-og autoklaveres mediet 15 minutter ved 121 ° C. Hæld den varme medium i petriskåle og lade størkne ved stuetemperatur.
    2. Grow Escherichia coli (ATCC 25922) i LB eller thioglycolat bouillon natten over ved 37 ° C. Vask bakterierne to gange med PBS og resuspendere dem i PAS medium. Fortynd 10x i PAS og sprede 2-3 ml af denne fortynding på en PAS agarplade og lad tørre.

    Tilføj en dråbe af prøve (eller et stykke filter) på den ene side af pladen og lad det strømme over petriskålen for at danne en linje i midten af ​​skålen.

    2.4. Amoebal vækst og amoebal subkultur

    1. Overhold petriskålen dagligt. Hvis der registreres en amoebal migration front, skåret ud et lille stykke af agar på migration foran og pode en frisk NNA petriskål dækket med en græsplæne på E. coli.
    2. Gentag genpodning flere gange afhængigt af renheden af ​​prøven, for at have en ren kultur af en given amoebal stamme.

    2.5. Amøber og bakterier karakterisering

    1. Skrab cellerne og resuspenderes dem i PAS.
    2. Uddrag DNA og bestemme identiteten af ​​amøber og / eller bakterielle endosymbionts ved PCR og sekventering (16S rRNA forstærkning for bakterier hhv. 18S rRNA for amøber og sekventering, for eksempel).
      3. <li> Brug disse skrabet celler i PAS at pode frisk amøber og udføre en amoebal cokultur at detektere bakterier muligvis er til stede i prøven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Brug amoebal cokultur og amoebal berigelse, blev en lang række miljø-og / eller sygdomsfremkaldende bakterier opdaget (tabel 1).

Amoebal cokultur blev brugt af vores gruppe og andre til at analysere miljøprøver, vandbehandlingsanlæg og vand distributionssystemer. En bred vifte af mikroorganismer kunne isoleres med denne teknik. De mest almindelige bakterier isoleret ved amoebal cokultur er medlemmer af Mycobacterium slægten, der kan inddrives fra rensningsanlæg og fra vand-netværk 13,14,24,27,28. Legionella og α-Proteobacteria arter kan også isoleres fra rensningsanlæg og fra hospitalet vandnet 14,24,28-31. Adskillige Klamydia-beslægtede arter blev også isoleret fra flodvand og vandbehandlingsanlæg, som for eksempel Estrella lausannensis (figur 2B-C 12,15,32,33.

34-36. Disse vira er alle i stand til at inficere og formere sig i amøber og præsentere en formørkelse fase typisk for deres virale livsstil. De mimivirus betragtes som en mild human lunge patogen, da det blev impliceret i en utilsigtet infektion af en laborant, der led af lungebetændelse 37.. Potentiel patogenicitet af andre gigantiske vira stadig skal undersøges.

Amoebal berigelse blev ofte brugt sideløbende med amoebal cokultur. Således når han undersøger et rensningsanlæg, og nedstrøms vand-netværket, er blevet opdaget 25 forskellige amoebal stammer, hvoraf 12 svarede til nye arter 14. Amøber var til stede på alle trin i vandrensning og distribution, hvilket indikerer en modstand af disse protister til ozon og kloring. Intracellulær bakterier could også påvises i disse amøber, der viser betydningen af indfødte amøber i transmissionen af intracellulære bakterier 14. I en anden undersøgelse kunne amøber isoleres fra vandet distributionssystem på et hospital 24. Et stort flertal af de isolerede stammer i denne undersøgelse svarede til Hartmannella vermiformis, hvilket er naturligt i stand til at overleve ved relativt høje temperaturer. Adskillige bakterier, såsom Legionella pneumophila kunne påvises i den oprindelige amøber 24. Et andet eksempel på bakterier, der findes i et bestemt amøbe er Parachlamydia acantamoebae. Denne Klamydia-relateret bakterie blev isoleret fra næseslimhinden af kvindelige frivillige ved amoebal berigelse (figur 2A) 9 og er en potentiel agent for lungebetændelse 38.. Dette viser igen betydningen af ​​amøber i vedligeholdelse og spredning af bakterielle patogener, der kan være særligt patogene for immunocompromised patienter 39..

Figur 1
Figur 1. Skitse af amoebal cokultur og amoebal berigelse beskriver de vigtige skridt i disse to teknikker. (Tilpasset fra 40). Klik her for at se større figur .

Figur 2
Figur 2. Eksempler på bakterier opdaget af amoebal cokultur, og denne observation med forskellige farvningsmetoder. A) Farvning af Parachlamydia acanthamoebae Hall coccus inficerer amøber med modificeret Romanowsky fremgangsmåden 24 timer efter infektion med en forstørrelse på 1.000 X. Bakterier farves blå (enrrows). f.Kr.) Elektronmikroskopi af Estrella lausannensis viser den typiske stjerne morfologi elementære organer (pile).

Tabel 1. Eksempler på bakterier fra forskellige klasser opdaget af amoebal cokultur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Amoebal cokultur og amoebal berigelse er effektive metoder, der tillod isolering af mange nye bakterie-og amoebal arter. Resultater opnået med disse metoder bekræfter den allestedsnærværende tilstedeværelsen af ​​både amøber og amøber-modstand bakterier i miljøet, og mest interessant i menneskeskabte vandnet, der anses for at være kontrolleret af kemiske behandlinger såsom kloring og ozon. Amoebal cokultur og amoebal berigelse er vigtige redskaber til at isolere og dyrke disse potentielt patogene mikroorganismer og opnå stammer i renkultur for så yderligere at studere deres biologi og patogenicitet. For nylig blev denne metode tilpasset til high-throughput isolation af gigantiske virus 41. Tilsvarende kan amoebal cokultur automatiseres og bruges som en rutinemæssig teknik til at teste mikrobiologiske kvalitet af miljøprøver og menneskeskabte vandsystemer, såsom drikkevand.

Amoebal cokultur kanudføres med forskellige arter af amøber. Vi foretrækker normalt at bruge Acanthamoeba castellanii eller A. polyphaga da de er mindre tilbøjelige til at encystment end Hartmannella vermiformis og da de udviser et relativt stort værtsspektrum. Andre arter kan anvendes, men protokollen og bouillon bør tilpasses. Det er for nylig blevet vist, at A. lenticulana (ATCC 30841) kan anvendes på samme betingelser som A. castellanii eller A. polyphaga men har forskellig modtagelighed for infektion 42. For at forhindre encystment, er det vigtigt at anvende en relativt lav inkubationstemperatur (under 30 ° C) og til at opretholde en fugtig atmosfære.

Bemærkelsesværdige, vil den vedvarende replikation af amoebal symbionter ikke nødvendigvis føre til amoebal lyse og når specielt på udkig efter symbionter, bør screening af mikroskopi og / eller PCR systematisk udført. For at undgå lyse eller løsrivelse af amoebal ce LLS skyldes bakteriel overvækst, er det nyttigt at udføre podning af stærkt forurenede prøver ved hjælp af 10-fold seriefortyndinger.

Ikke desto mindre har disse metoder begrænsninger. På grund af anvendelsen af ​​en enkelt amoebal arter, kan amoebal cokultur ikke tillade isolering af bakterier, der bruger som reservoir anden amoebal arter. Desuden kan sådanne særlige amoebal arter være ude af stand til at formere sig på E. coli græsplæner og kan blive savnet af amoebal berigelse. Afhængigt af egenskaberne af de bakterier eller amøber undersøgte, kan det være nødvendigt at teste forskellige medier, forskellige amoebal arter og forskellige bakteriearter at fodre amøber (Enterobacter doacae og nogle Pseudomonas stammer er gode alternativer). Bakteriel forurening af amøber eller medier, der anvendes til amoebal cokultur kan forekomme og kan føre til falske positive resultater. En negativ kontrol er således obligatorisk at undgå sådanne falske positive resultater.

indhold "> Afslutningsvis amoebal cokultur og amoebal berigelse er to komplementære tilgange, der repræsenterer interessante værktøjer til at specificere økologi og biodiversitet af fritlevende amøber og amøber-modstand bakterier. Disse teknikker tillader opdagelsen af ​​mange nye arter, herunder amøber, bakterier og gigantiske virus, der danner grundlag for fremtidige undersøgelser for at undersøge patogenicitet af disse nye mikroorganismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker Pr. Bernard La Scola for nyttige tekniske råd og interessant diskussion om amoebal cokultur og amoebal berigelse. Vi takker også Dr. Vincent Thomas for hans hjælp i gennemførelsen af ​​teknikken i vores laboratorium.

Materials

Klasse Arter eksempler Henvisning
α-Proteobacteria Odyssella thelassonicensis 10
b-Proteobacteria Burkholderia cepacia 36
g-Proteobacteria Legionella drancourtii 26
Chlamydiae Estrella lausannensis 30
Flavobacteriae Amoebophilus asiaticus 37
Actinobacteria Mycobacteria spp. 38
Name Company Catalog Number Comments
Glucose monohydrate Merck, Darmstadt, Germany 108342
0.22 μm pore size membrane Merck Millipore, Darmstadt, Germany SCVPU11RE
proteose peptone Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 211693
yeast extract Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 212750
Cell culture flasks Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 353135
Kova slide Hycor, Indianapolis, IN 87144
cell culture microplates Corning Inc, Corning, NY 3524
Diff-Quik staining kit Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany 130832
Ziehl fuchsin Fluka, St-Louis, MI 21820
basic fuchsin Sigma, St-Louis, MI 857843
Phenol Sigma, St-Louis, MI P1037 Corrosive and mutagenic
malachite green oxalate Fluka, St-Louis, MI 63160
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 15710
Saponin Sigma, St-Louis, MI 84510

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fraser, D. W., et al. Legionnaires' disease: description of an epidemic of pneumonia. New Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).
  2. McDade, J. E., et al. Legionnaires' disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease. New Engl. J. Med. 297, 1197-1203 (1977).
  3. Rowbotham, T. J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae. J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).
  4. Rodriguez-Zaragoza, S. Ecology of free-living amoebae. Crit. Rev. Microbiol. 20, 225-241 (1994).
  5. Booton, G. C., Visvesvara, G. S., Byers, T. J., Kelly, D. J., Fuerst, P. A. Identification and distribution of Acanthamoeba species genotypes associated with nonkeratitis infections. J Clin. Microbiol. 43, 1689-1693 (2005).
  6. Brussow, H. Bacteria between protists and phages: from antipredation strategies to the evolution of pathogenicity. Molecular microbiology. 65, 583-589 (2007).
  7. Greub, G., Raoult, D. Microorganisms resistant to free-living amoebae. Clin. Microbiol. Rev. 17, 413-433 (2004).
  8. Thomas, V., McDonnell, G., Denyer, S. P., Maillard, J. Y. Free-living amoebae and their intracellular pathogenic microorganisms: risks for water quality. FEMS Microbiol Rev. 34, 231-259 (2010).
  9. Birtles, R. J., Rowbotham, T. J., Storey, C., Marrie, T. J., Raoult, D. Chlamydia-like obligate parasite of free-living amoebae. Lancet. 349, 925-926 (1997).
  10. Amann, R., et al. Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia spp. Appl. Environ. Microbiol. 63, 115-121 (1997).
  11. Birtles, R. J., et al. Candidatus Odyssella thessalonicensis' gen. nov., sp. nov., an obligate intracellular parasite of Acanthamoeba species. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 63-72 (2000).
  12. Thomas, V., Casson, N., Greub, G. Criblamydia sequanensis, a new intracellular Chlamydiales isolated from Seine river water using amoebal co-culture. Environ. Microbiol. 8, 2125-2135 (2006).
  13. Pagnier, I., Raoult, D., La Scola, B. Isolation and identification of amoeba-resisting bacteria from water in human environment by using an Acanthamoeba polyphaga co-culture procedure. Environ. Microbiol. 10, 1135-1144 (2008).
  14. Thomas, V., Loret, J. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environ. Microbiol. 10, 2728-2745 (2008).
  15. Corsaro, D., et al. Novel Chlamydiales strains isolated from a water treatment plant. Environ. Microbiol. 11, 188-200 (2009).
  16. Goy, G., Croxatto, A., Greub, G. Waddlia chondrophila enters and multiplies within human macrophages. Microbes Infect. 10, 556-562 (2008).
  17. Kebbi-Beghdadi, C., Cisse, O., Greub, G. Permissivity of Vero cells, human pneumocytes and human endometrial cells to Waddlia chondrophila. Microbes Infect. 13, 566-574 (2011).
  18. Kebbi-Beghdadi, C., Batista, C., Greub, G. Permissivity of fish cell lines to three Chlamydia-related bacteria: Waddlia chondrophila, Estrella lausannensis and Parachlamydia acanthamoebae. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 339-345 (2011).
  19. Fry, N. K., Rowbotham, T. J., Saunders, N. A., Embley, T. M. Direct amplification and sequencing of the 16S ribosomal DNA of an intracellular Legionella species recovered by amoebal enrichment from the sputum of a patient with pneumonia. FEMS Microbiol. Lett. 67, 165-168 (1991).
  20. Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila serogroup 1 from human feces with use of amebic cocultures. Clin. Infect. Dis. 26, 502-503 (1998).
  21. Greub, G., La Scola, B., Raoult, D. Amoebae-resisting bacteria isolated from human nasal swabs by amoebal coculture. Emerging Infect. Dis. 10, 470-477 (2004).
  22. Isenberg, H. D. Clinical microbiology procedures handbook. , (1992).
  23. Gimenez, D. F. Staining Rickettsiae in Yolk-Sac Cultures. Stain Technol. 39, 135-140 (1964).
  24. Thomas, V., Herrera-Rimann, K., Blanc, D. S., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-resisting bacteria in a hospital water network. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2428-2438 (2006).
  25. Miyamoto, H., et al. Development of a new seminested PCR method for detection of Legionella species and its application to surveillance of legionellae in hospital cooling tower water. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2489-2494 (1997).
  26. Lienard, J., et al. Development of a new chlamydiales-specific real-time PCR and its application to respiratory clinical samples. J. Clin. Microbiol. 49, 2637-2642 (2011).
  27. Wang, Y., Ogawa, M., Fukuda, K., Miyamoto, H., Taniguchi, H. Isolation and identification of mycobacteria from soils at an illegal dumping site and landfills in Japan. Microbiol. Immunol. 50, 513-524 (2006).
  28. Corsaro, D., Pages, G. S., Catalan, V., Loret, J. F., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-associated bacteria in water treatment plants. Int. J. Hygiene Environ. Health. 213, 158-166 (2010).
  29. La Scola, B., et al. Legionella drancourtii sp. nov., a strictly intracellular amoebal pathogen. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 699-703 (2004).
  30. Thomas, V., Casson, N., Greub, G. New Afipia and Bosea strains isolated from various water sources by amoebal co-culture. Syst. Appl. Microbiol. 30, 572-579 (2007).
  31. La Scola, B., et al. Amoeba-resisting bacteria and ventilator-associated pneumonia. Emerging Infect. Dis. 9, 815-821 (2003).
  32. Collingro, A., et al. Recovery of an environmental Chlamydia strain from activated sludge by co-cultivation with Acanthamoeba sp. Microbiology. 151, 301-309 (2005).
  33. Lienard, J., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Estrella lausannensis, a new star in the Chlamydiales order. Microbes Infect. 13, 1232-1241 (2011).
  34. La Scola, B., et al. A giant virus in amoebae. Science. 299, 2033 (2003).
  35. Boyer, M., et al. Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21848-21853 (2009).
  36. Thomas, V., et al. Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets. Environ. Microbiol. 13, 1454-1466 (2011).
  37. Raoult, D., Renesto, P., Brouqui, P. Laboratory infection of a technician by mimivirus. Ann. Internal Med. 144, 702-703 (2006).
  38. Greub, G. Parachlamydia acanthamoebae, an emerging agent of pneumonia. Clin. Microbiol. Infect. 15, 18-28 (2009).
  39. Lamoth, F., Greub, G. Amoebal pathogens as emerging causal agents of pneumonia. FEMS Microbiol. Rev. 34, 260-280 (2010).
  40. Lienard, J. G. Ch. 6. Environmental microbiology, current technology and water applications. Ashbolt, K., Sen, N. J. , Caister Academic Press. 143-162 (2011).
  41. Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ. Microbiol. , (2012).
  42. Ovrutsky, A. R., et al. Cooccurrence of Free-Living Amoebae and Nontuberculous Mycobacteria in Hospital Water Networks, and Preferential Growth of Mycobacterium avium in Acanthamoeba lenticulata. Appl. Environ. Microbiol. 79, 3185-3192 (2013).

Tags

Immunologi Environmental Microbiology Soil Microbiology Water Microbiology Amøber mikroorganismer cokultur obligate intracellulære bakterier
Opdagelsen af ​​nye intracellulære patogener af Amoebal cokultur og Amoebal Enrichment Approaches
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., … More

Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches. J. Vis. Exp. (80), e51055, doi:10.3791/51055 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter