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Neuroscience

Eine Nasennebenschutz-Protokoll für die Untersuchung Verhaltensplastizität bei Insekten: Anwendung auf Grund, Biomedizinische und Agrarforschung

Published: September 8, 2014 doi: 10.3791/51057
Automatic Translation
1, 1
1School of Life Sciences, Arizona State University

Abstract

Insekten ihre Antworten zu modifizieren, um durch Reize Erfahrung assoziieren diese Reize mit Ereignissen wichtig für das Überleben (zB Essen, Kumpels, Drohungen). Es gibt mehrere Mechanismen, durch die Verhaltens ein Insekt lernt hervorstechenden Verbänden und bezieht sie auf diese Ereignisse. Es ist wichtig, diese Verhaltensplastizität für Programme auf die Unterstützung von Insekten, die vorteilhaft für die Landwirtschaft ausgerichtet zu verstehen. Dieses Verständnis kann auch für die Entdeckung Lösungen für die biomedizinische und landwirtschaftliche Probleme, die durch Insekten, die als Krankheitsüberträger und Schädlinge verwendet werden. Die Nasenneben Response (PER) Anlage Protokoll wurde für Honigbienen (Apis mellifera) vor über 50 Jahren entwickelt, um zu studieren, wie sie wahrnehmen und erfahren Sie mehr über Blumen Gerüche, die den Nektar und Pollen Ressourcen einer Kolonie Bedürfnisse für das Überleben zu signalisieren. Die pro Verfahren bietet eine robuste und einfach zu beschäftigen Rahmen für die Untersuchung mehrere verschiedene ökologisch relevanten mechamen der Verhaltensplastizität. Es ist für den Einsatz leicht anpassbar mit einigen anderen Insektenarten und andere Verhaltens Reflexe. Diese Protokolle können leicht in Verbindung mit verschiedenen Mitteln zur Überwachung neurale Aktivität im ZNS mittels Elektrophysiologie oder bioimaging oder zur gezielten Manipulation neuromodulatorischen Wege eingesetzt werden. Es ist ein robustes Assay zum schnellen Nachweis subletalen Auswirkungen auf das Verhalten von Umwelt-Stressoren, Toxine oder Pestizide verursacht.

Wir zeigen, wie der Per-Protokoll ist einfach zu implementieren mit Hilfe von zwei Verfahren. Eine ist als Laborübung für Studenten oder für schnelle Tests der Wirkung einer experimentellen Behandlung geeignet. Der andere bietet gründlichere Kontrolle der Variablen, die für Studien von Verhaltensanlage ist. Wir zeigen, wie verschiedene Maßnahmen zur Verhaltensreaktion von binären ja / nein, mehr kontinuierliche Variable wie Latenz und Dauer der Rüssel-Erweiterung kann verwendet werden, um zu testen Hypothese werdens. Und diskutieren wir einige Fallstricke, die Forscher häufig begegnen, wenn sie zum ersten Mal verwenden Sie den Vorgang.

Introduction

Viele Insekten lernen über ökologisch relevante Reize, und sie dann ihre Verhaltensreaktionen auf diese Reize, um neue prädiktive Beziehungen in ihrer Umgebung anpassen ändern. Mehrere verschiedene Mechanismen können diesen Verhaltensplastizität zugrunde liegen (zB nicht-assoziativen, assoziative / Pawlowschen und operante / instrument 1). Diese Arten von Plastizität unterscheiden sich in die Stimuli oder Verhaltensweisen sind mit wichtigen Ereignissen, wie das Auftreten von Lebensmitteln, einem Kumpel, oder Gefahr verbunden. Das Verständnis dieser Formen der Plastizität ist für die Grundlagenforschung sehr wichtig, wie sich das Nervensystem verändert, neue Erinnerungen zu 2 kodieren. Es ist auch wichtig für das Verständnis der adaptiven Verhalten von Insekten, die wichtige Überträger von Krankheiten (zB Tsetse-und Moskito) und Insekten, die landwirtschaftlich wichtig sind, sind entweder in der Pflanzenproduktion (Honigbienen) oder als Schädlinge.

Studium Verhaltensplastizität in jedem animal erfordert aufgrund der experimentellen Kontrolle über eine Anzahl von Variablen, die nicht in dem Gebiet 1 erreichbar. Es erfordert die Entwicklung eines robusten Anlage Protokoll, das unter kontrollierten Bedingungen mehr eingesetzt werden können, aber die immer noch relevant, um das Verhalten unter natürlichen Bedingungen sind. Die Honigbiene (Apis mellifera) ist ein ausgezeichnetes Modell dafür, wie ein Protokoll für die Durchführung kontrollierter Analysen der Verhaltensplastizität 3,4 zu entwickeln. Die Nasenneben Response (PER) in Honigbienen ist ein natürlicher Reflex Verhaltens, in dem die Honigbiene erweitert sein Rüssel in Reaktion auf anten Stimulation mit einer Zuckerlösung. Während der normalen Nahrungssuchverhalten tritt PRO, wenn die Honigbiene Nektar findet in einer Blume. Glücklicherweise wird Honigbienen leicht zeigen diese einfache und leicht quantifizierbare Verhalten im Labor. Dies macht es möglich, zu untersuchen, in einer kontrollierten Umgebung, die Mechanismen, die diese ökologisch relevanten Verhalten 5 beeinflussen. PRO can auch innerhalb einer Konditionierungsprotokoll verwendet, um Reizwahrnehmung und Lern-und Gedächtnis unter verschiedenen Behandlungsbedingungen, die bestimmt sind, die Verhaltens-und neuronalen Mechanismen, die die Plastizität zugrunde liegen 6 zeigen untersuchen.

Seit den ersten Untersuchungen von Kuwabara 7, hat PRO Anlage sehr stark genutzt, um nicht-assoziativen, assoziativ und operante Verhaltensmechanismen, die Plastizität im Honigbienen 8 zugrunde liegen, zu offenbaren. Diese Mechanismen sind identisch mit den in den Studien der frei fliegenden Bienen 9 offenbart. Im Gegensatz zu Untersuchungen von frei fliegenden Bienen können PER Anlage Protokolle mit Elektrophysiologie 10,11 oder Live-Zell-Fluoreszenz-Bildgebung des Gehirns 12-14 gekoppelt werden. Außerdem ermöglichen PRO Protokolle für experimentelle Manipulation von Nervenbahnen durch pharmakologische oder molekulargenetische Behandlungen, um Hypothesen über die Rolle der spezifischen Komponenten des Netzwerks, wie nehmer testenomodulators 15,16. PRO-Protokolle haben auch eine wichtige Möglichkeit, die subletale Auswirkungen der Umweltbedingungen sowie Giftstoffe auf die Gesundheit und Leistungsfähigkeit der Nahrungssuche Honigbienen 17 zu bewerten ist.

Dieses Verfahren beschreibt zwei Geruchsversandmethoden parallel. Verfahren 1 ist eine Version des Geruchs und unbedingter Reiz (Saccharose) Lieferung, das eine kostengünstige und technisch einfache Methode zur Darstellung der Geruch und Saccharose Belohnung bietet. Diese Methode ist gut für die Grundausbildung und wenn Automatisierung ist nicht möglich. Es ist eine hervorragende Möglichkeit, um diese Technik zu einem Klassenzimmer oder Labor Lehre einzuführen. Während Anlage für Experimente mit schwierigeren Aufgaben und gekoppelt physiologischen Beurteilung der Geruchswahrnehmung, Lernen oder Gedächtnis, ist es sehr wichtig, genau und präzise regeln den Beginn, Dauer Lieferzeitpunkt Reize. Für die zuverlässigsten Konjunktur Lieferung, verwenden ein Mittel zur Automatisierung der Geruch Lieferung einnd eine genaue Methode der Belohnung Lieferung. Methode 2 verwendet automatisierte Geruch Lieferung und präziser Saccharose Lieferung. Es ist technisch anspruchsvoller und erfordert mehr für die Ersteinrichtung als Methode 1, aber es die Konsistenz der Zeitpunkt und die Menge der Impulse für Anlage verwendet deutlich erhöht und sollte wenn immer möglich genutzt werden.

Protocol

1. Geruch (bedingten Reiz) Cartridge-Setup

  1. Zu Beginn des Experiments Einrichten mehrerer Geruchspatronen für die verschiedenen Gerüchen zur Konditionierung Studien notwendig.
    1. Verwenden Sie einen Abzug für die Geruchs Verdünnung und Geruch Patrone Vorbereitung. Öffnen Sie niemals Flaschen Gerüche außerhalb dieser Dunstabzug, da die Gerüche schnell im Labor zu verbreiten und möglicherweise die Honigbienen, um den Geruch aussetzen, bevor Anlage. Auch mit Handschuhen während der Einrichtung der Geruchspatronen und gründlich waschen, danach zu vermeiden, dass die Honigbienen, um Gerüche beim Umgang mit ihnen.
    2. Stellen Sie sicher, jeder Geruch Patrone ist eindeutig mit einer farbcodierten Etikett der Geruch, für die sie zum ersten Mal verwendet wird markiert. Niemals einen Geruch Patrone (Spritzenzylinder oder Kolben) für mehr als einen Geruch, da möglicherweise Restgeruch an der Kartusche sein.
  2. Vorbereitung Gerüche und Duftmischungen
    1. Verdünnen Gerüche entweder in Hexan oder Mineralöl auf die desired Konzentration.
      HINWEIS: Die Änderung der Konzentration des Geruchs oder präsentieren Mischungen von zwei oder mehr Geruchsstoffe können für die Untersuchung von zusätzlichen Aspekten ermöglichen, wie die Bienen spüren Gerüche und lernen Sie die Anlage Vereins. Duftmischungen kann so einfach wie ein 50:50 binären Mischung oder so komplex wie Gerüche, die mehrere natürliche Geruchsreize zu imitieren sein. Reduzierung der Konzentration des Geruchs erhöht auch die Schwierigkeit der Aufgabe.
      1. Gerüche erschöpft mit Wiederverwendung der Kartusche (2). Um zu vermeiden, Probleme von Erschöpfung machen genug Patronen zu können, um eine neue Patrone alle 10-12 verwendet zu wechseln.
  3. Vorbereitung Geruch Patronen
    1. Methode 1
      1. Für diese Methode verwenden, 20 ml Kunststoffspritzen mit einem 15 mm Durchmesser-Kreis aus Filterpapier auf die Gummi Ende des Kolbens für die Geruchspatronen merken.
      2. Entfernen Sie den Kolben aus der Spritze und einer Reißzwecke zu verwenden, um das Stück zu befestigen filter Papier dem Ende des Kolbens.
      3. Verwenden Sie eine Mikropipette zu 10 ul der Geruch auf das Filterpapier legen, und setzen Sie den Kolben in den Spritzenzylinder. Drücken Sie den Kolben an den 15-ml-Marke auf dem Spritzenzylinder.
    2. Methode 2
      1. Für dieses Verfahren verwenden 1 cc Glas oder Kunststoff Tuberkulinspritzen (oder modifizierten Pipetten ähnlicher Form und Volumen) mit einem Filterpapierstreifen in und ein Gummi oder Silikon Drossel in dem breiten Ende des Spritzenzylinders für den Geruchspatronen.
      2. Entfernen Sie den Kolben aus einer 1 cc Tuberkulinspritze Barrel. Der Spritzenzylinder wird der Körper des Geruchspatrone.
      3. Entfernen Sie die schwarze Gummispitze von der Spritzenkolben und schneiden Sie die geschlossenen Ende des Gummispitze.
        HINWEIS: Diese Gummiring wird als Drossel wirken, um Sog aus dem Luftstrom in der Arena, die vorzeitig ziehen wird Geruch aus der Kartusche und über die zurückhaltende Honigbiene zu reduzieren. Alternativ Silikonschlauch (4,8 mm outer Durchmesser) in 5 mm Abschnitte geschnitten arbeiten, wie Drosseln.
    3. Spülen der Innenseite des Spritzenzylinders und der Kautschuk / Silikon Drossel mit 70% Ethanol (zur Entfernung großer Teil der Restgeruch von früheren Gebrauch) und ließ sie an der Luft trocknen.
    4. Legen Sie eine 0,2 x 4 cm Filterpapierstreifen in die weite Öffnung des Fasses, so erstreckt sich das Papier 1-2 cm über die Öffnung.
    5. Verwenden Sie eine Mikropipette bis 3-10 ul der Geruch auf das Filterpapier, ohne dass der Geruch berühren Sie das Ende des Spritzenzylinders zu platzieren. Die Pipettenspitze kann für den gleichen Geruch wiederverwendet werden, aber stellen Sie sicher, dass Sie eine frische Spitze verwenden, um die nächste Geruch.
    6. Drehen die breite Öffnung des Spritzenzylinders nach oben, so wird das Filterpapier gleitet schnell in das Rohr. Legen Sie die Drossel in die weite Öffnung des Spritzenzylinders.
      1. Stellen Sie sicher, jeder Geruch Patrone ist eindeutig mit einer farbcodierten Etikett der Geruch wird es zuerst verwendet markiert. Verwenden Sie niemals einen Geruch Patrone (Spritzenzylinder oder restrictor) für mehr als einen Geruch, da möglicherweise Restgeruch auf sie.
    7. Ball bis zum Ende eines fusselfreien Tuch, legen Sie ihn mit 70% Ethanol, und verwenden Sie es gründlich wischen Sie die Außenfläche der Kassette, um jede Restgeruch an der Außenseite der Patrone zu entfernen.

2. Erhebung, Bändigen, und Fütterung der Bienen

  1. Vorbereitung Bee Bändigen Geschirre
    1. Machen Sie einfach Rückhaltegurte für Honigbienen aus Kunststoff Strohhalme, harte Kunststoffschlauch oder bearbeiteten Metallrohr (alle sind ca. 0,9 cm Innendurchmesser und haben 1-2 mm Wandstärke). Verwenden stabiler Bäume für Verfahren, die Chirurgie.
    2. 3 cm geschnitten Abschnitte des Schlauchs. Dann teilweise wegschneiden etwa die Hälfte der oberen 1 cm des Kabelbaums, um es einfacher, die Biene in Position zu halten, während die Befestigung der Kabelbaum.
    3. Schneiden Sie ein 0,2 x 6 cm Streifen Klebeband und befestigen Sie das eine Ende an der einen Seite der Bienenbaum, leaVing das andere Ende frei.
  2. Sammeln Worker Bees
    1. Sammeln Arbeiter von der Einfahrt in die Kolonie, wie sie vor der Abreise von der Kolonie unterbrechen oder, wie von der Nahrungssuche zurück.
      Hinweis: Wenn sich ein Stück Maschendraht, mit Löchern, die gerade groß genug für Arbeiterinnen, um durch zu kriechen, über dem Eingang verlangsamt die zurückkehrenden Arbeiter nach unten und macht es leichter, sie zu fangen, bevor sie die Kolonie ein.
    2. Legen Sie ein Szintillationsfläschchen über die Biene, bis es fliegt hinein. Halten Sie das Fläschchen mit der Öffnung nach unten oder waagerecht, während der Deckel befestigt ist, so dass die Bienen nicht fliegen aus dem Fläschchen. Legen Sie nur eine Biene in jedem Fläschchen. Stellen Sie sicher, dass der Deckel hat ein Loch für eine angemessene Gasaustausch zu ermöglichen.
    3. Sammeln die Bienen schnell, um die Zeit, die sie in den Fläschchen verbringen zu minimieren. Die Durchstechflaschen mit Bienen in ihnen in einer kleinen Box in den Schatten.
    4. Übertragen Sie die Box mit den Fläschchen und Bienen ins Labor, und legen Sie die Fläschchen in ein Eis-Wasser-slUrry, bis die Bienen nicht mehr bewegen. Sobald eine Biene ist unbeweglich, entfernen Sie das Fläschchen aus dem Eis sofort um eine Überbelichtung zu vermeiden kalt, und legen Sie die Biene in ein Rückhaltegeschirr.
      HINWEIS: Wir empfehlen nicht, indem die Bienen in den Kühlschrank oder Gefrierschrank, da es schwierig ist, zu überwachen, wenn die Bienen sich unbeweglich, was zu einer übermäßigen Belastung durch die Kälte. Wenn die Nutzung mehr als 10 Bienen, übertragen nur wenige Bienen auf das Eis-Wasser-Schlamm zu einer Zeit.
  3. Zurückhalten der Bienen
    1. Platzieren der Biene in der Kabelbaum mit seiner dem weggeschnittenen Abschnitt der Rohrleitung und der Spitze unmittelbar oberhalb der Oberseite des Rohr dorsalen Thorax. Drücken Sie vorsichtig die Biene in der Nähe der Schlauch so ihre Mundwerkzeuge über den Rand des Schlauches zu verlängern. Schieben der Streifen Klebeband zwischen dem Kopf und dem Brustkorb auf der dorsalen Seite des Bienen und fest an das freie Ende an der Seite des Kabelbaums.
      1. Stellen Sie sicher, dass die Band auf dem Kabelbaum ist glatt und straff. Es sollte keine benannte seinceable Lücken zwischen der Vorderseite des Bienenbaum und dem Band, und das Band sollte auf der Oberseite des Flachkabelbaum zu legen. Wenn es Lücken gibt die Biene nicht in der Lage, seine Rüssel richtig zu verlängern, oder es kann entkommen. Also, stellen Sie sicher, dass die Biene die Vorderbeine nicht zwischen der Vorderseite des Kabelbaum und dem Klebeband herausragt.
  4. Die Fütterung der Bienen und die Verfütterung an Anlage Intervall
    1. Etwa 30 min nach Gespann - nachdem die Bienen haben die Ersteinrichtung erholt - füttern die Bienen 3-4 ul 0,5 M Saccharose (in Wasser). Dieser Betrag wird für eine ausreichende Fütterung zu Anlage Intervall von 3-4 Stunden sein.
      1. Im allgemeinen Zulauf 1 ul 0,5 M Saccharose etwa jede Stunde Wartezeit zwischen Zuführung und Konditionierung sicherzustellen, die Bienen überleben das Intervall vorhanden sind hungrig genug am Anfang Anlage motiviert werden, die klimatisierte Assoziation zu lernen. In einem Labor aufbewahrt bei einer warmen Temperatur oder, wenn usingen eine unterschiedliche Konzentration von Saccharose, stellen Sie die Menge zugeführt oder das Zeitintervall entsprechend.
        HINWEIS: Bei einer Fütterung zu Anlage Abstand von 24 h, sicherzustellen, dass alle Bienen sind bis zur Sättigung mit 0,5 oder 1 M Saccharose mindestens 24 h zugeführt, bevor Anlage beginnt. Bei Raumtemperatur, Bienen benötigen etwa 24 Stunden, bevor sie motiviert genug, um gut in eine Konditionierungsprotokoll reagieren.
        HINWEIS: Verwenden Sie eine niedrigere Konzentration von Saccharose-Lösung für die Fütterung der Bienen als die während der Konditionierung als Belohnung eingesetzt, um die Bienen von immer weniger empfindlich auf die Konzentration von Saccharose während Anlage eingesetzt, die Lernleistung 18 reduzieren können, zu verhindern Konzentration.
      2. Füttern die Bienen in einem Gebiet, weit entfernt von den Trainingsbereich. Kontakt mit dem unbedingten Reiz (Saccharose) in der Konditionierungsanlage könnte Kontext vor anschließender Konditionierung auf den Geruch beeinflussen.
    2. Während des Intervalls zwischen Zuführung und conditioning legen die Bienen auf der Arbeitsplatte in einer ruhigen Gegend des Labors, um unnötige Störungen zu vermeiden. Wenn das Labor hat eine niedrige Luftfeuchtigkeit, legen die Bienen in einem Kunststoff-Behälter mit feuchten Papiertüchern während des Zeitintervalls. Dies verhindert Austrocknung, da die Bienen sterben, wenn sie zu niedrige Luftfeuchtigkeit für längere Zeiträume ausgesetzt sind.
      HINWEIS: Die Nutzbarmachung und Fütterung Protokoll innerhalb eines Experiments nicht ändern! Verwenden Sie nur einen bestimmten Zeitintervall zwischen der Einrichtung und Fütterung der Bienen und beginnen Anlage für jedes Experiment, so dass die Bienen sind alle genau die gleiche Art und Weise behandelt.

3. Anlage

  1. Prüfung auf Saccharose-Empfindlichkeit
    1. Ein paar Minuten vor Beginn Anlage, testen der Bienen Motivation, indem Sie ihre Antennen mit einem kleinen Tröpfchen von 0,5 M Saccharose-Lösung (die gleiche Konzentration während der Fütterung verwendet wird) zu ernähren. Erlauben Sie sie nicht während dieses Tests zu ernähren. Wenn sie von EXTE reagierennden ihre Rüssel, sind sie wahrscheinlich ausreichend motiviert zu lernen und kann für das Protokoll verwendet werden.
  2. Design-Experiment
    HINWEIS: Dieses Protokoll kann geändert werden, um eine breite Palette von Lernprotokollen, um viele Aspekte von Lernen und Gedächtnis Fähigkeiten Honigbienen 'untersuchen zu passen. Unter den vielen Parameter, die eingestellt werden können, sind die: Inter-Prozess-Intervall, die Anzahl der Bienen zu einem bestimmten Zeitpunkt, Inter-Stimulus-Intervall, Art und Konzentration und Anzahl der Gerüche, der Art und Konzentration des unbedingten Reiz, der Anzahl und Reihenfolge trainiert Versuche (Abbildung 1; Tabelle 1) 19-21. Bei der Gestaltung der genaue Protokoll für jeden Versuch Anlage, ist es sehr wichtig, die inter-Testintervall konsistent über Personen zu halten. Ein interTestIntervall, zu kurz, zu lang oder nicht die Leistung der Bienen beeinträchtigen ist. Siehe die Diskussion für eine vollständige Behandlung dieses Themas.
    HINWEIS: Bienes wird die Aufgabe schneller, wenn sie in einer warmen Umgebung sind zu lernen. Daher halten die Temperatur der Trainingsumgebung konsistent und warm (29-30 ° C, wenn möglich).
  3. Bereitstellung der Geruch (bedingten Reiz)
    1. Methode 1
      1. Einrichten der Geruch Delivery System
        1. Montieren Sie die Kunststoff 20-ml-Spritze mit dem Geruch behandelten Filterpapier geladen, so es ist stabil und das kleine Ende wird bei der Biene Antennen direkt konfrontiert sind. Stellen Sie den Kolben in der 15-ml-Marke zu positionieren und die Spritze so der Kolben ist leicht zugänglich.
      2. Präsentation der Geruch Stimulus
        1. Zu Beginn eines jeden Versuch, legen Sie die Biene in der Baum an der Stange in der Anlage Arena mit ihren Fühlern wies direkt auf die Geruchspatrone. Lassen Sie die Biene zu akklimatisieren, um die Arena für 15-25 sec vor Beginn der Geruchsreiz, um Störungen durch die abrupte Änderung in ihrer visuellen Umgebung während der Geruchsreiz zu reduzieren.
          1. Wenn die Biene beginnt, auf den Geruch Patrone sofort, nachdem es in der Arena platziert ist Anlage reagieren, kann es zu Geruchs auf der Patrone Spitze sein. Entfernen Sie die verunreinigenden Geruch durch Waschen der Kartusche mit einem fusselfreien Tuch in 70% Ethanol getränkt. Wenn das nicht das Problem zu lösen, ersetzen Sie die Patrone.
        2. Drücken Sie den Kolben der Spritze mit einer konstanten Rate, so wird der Kolben vollständig innerhalb 4 Sekunden gedrückt. Überwachen Reaktion der Biene, um den Geruch vor der Vorlage der unbedingte Reiz.
        3. Nach jedem Versuch, damit die Biene in der Arena Anlage für ein anderes 15-25 sec Ruhe. Bewegen der Biene zu früh nach der Studie wird die Wirksamkeit der einzelnen Versuchsanlage deutlich reduzieren.
    2. Methode 2
      1. Einrichten der Geruch Delivery System
        1. Luftquelle und Durchfluss
          1. Als Quelle für die Geruchsluftlieferverwenden ein Aquarium Luftsprudler Pumpe oder einen Labortisch Druckluftversorgung, wenn das Labor mit ihr ausgestattet.
            HINWEIS: Ein typisches Aquarium Luftsprudler Pumpe eine Luftströmungsrate in der Nähe von 400 ml / min (7 ml / s) zu haben; über die 4 sec Geruchsreiz, wird mit 28 ml Luft durch eine 1 ml-Kartusche zu fließen.
          2. Verwenden eines Durchflussmessers in Übereinstimmung mit der Rohrleitung der Luftzuführungsvorrichtung, um die Strömungsgeschwindigkeit für die Luftzufuhr zu regulieren. Stellen Sie die Durchflussmesser bis der Durchflussmenge beträgt 400 ml / min. Überprüfen Sie die Durchflussmenge bei der Eröffnung der Geruch Patrone mit einem separaten Durchflussmesser.
          3. Verbinden des Luftstroms, um den Geruch Patrone durch ein System von Kunststoffrohrleitungen und Ventile.
            HINWEIS: Das Zeitmessgerät unten diskutiert öffnet die Ventile zum richtigen Zeitpunkt in der Studie. Kunststoffverbinder befestigen Sie die Luftstromsystem, um den Geruch Patrone durch eine Art Verbundenheit mit Luer Spritzenzylinder der Patrone.
          4. Unabhängig von der Luftquelle, überprüfen Sie die Durchflussmenge regelmäßig zu make, dass die Leitung intakt ist und die Strömungsgeschwindigkeit wird mit der gewünschten Rate gehalten wird.
      2. Automatisierte Geruch Lieferung
        1. Verwenden einer programmierbaren Logiksteuerung (PLC), die Lieferung des Geruchs zu automatisieren.
          HINWEIS: Die SPS ist so programmiert, dass die Ventile an den Geruch Lieferung Luftstrom 6 Sekunden nach Beginn des Programms (per Knopfdruck ausgelöst) zu öffnen, die Ventile für 4 sec offen zu halten, und einen akustischen Signalzuführung über einen kleinen Lautsprecher, 3 sec nach Reizbeginn Geruch zu signalisieren, den Experimentator zu Saccharose zu liefern.
        2. Verwenden Sie eine kleine LED, die den Zeitpunkt der Geruchsreiz bei jeder Studie zeigen. Wenn möglich verwenden Sie eine rote LED, da Bienen Photorezeptoren sind weg von mehr [rot] Wellenlängen und zu kürzeren [uv] Wellenlängen verschoben, so dass sie nicht gut sehen. Positionieren Sie das hinter und unter dem Bienen LED, außerhalb ihres Gesichtsfeldes, so wird das Licht ein versehentliches bedingten Reiz nicht geworden.
          HINWEIS: Die light hilft auch überprüfen, ob die SPS einwandfrei funktioniert und ist nützlich bei der Analyse von Videoaufzeichnungen der Antworten der Bienen während der Prüfung Studien.
      3. Die Abgasanlage
        1. Einrichtung eines Abgasanlage hinter der Biene zu helfen, ziehen Sie die Luft an der Biene und die geruchsbelastete Luft aus dem Klima Arena zu evakuieren, um eine diskrete Zeitrahmen für jede Präsentation der Geruch erhalten.
          HINWEIS: Wenn es ein Vakuumsystem im Labor, ändern Sie die Vakuumanschluss und befestigen Sie eine Leitung von Trocknerschlauch, um die erforderlich ist, um den Luftstrom zu evakuieren Anlage Arena bieten. Wenn es nicht ein Vakuumsystem, ein kleines elektrisches Gebläse in Übereinstimmung mit dem Trockenrohr untergebracht führte zu einem Abzug oder durch ein Fenster genügt.
      4. Zu Beginn eines jeden Tages, prüfen Sie die elektrischen und Luftanschlüsse des Geruchsliefersystem und Abgasanlage. Drücken Sie die Starttaste auf den Geruch Abgabesystem und verfolgen die Zeit zwischen dem Drücken derButton und wenn die Ventile offen (ein leises Klicken und die LED leuchtet auf), und wenn die Musik der unbedingte Reiz bis heute (ein akustisches Signal) ertönt. Überprüfen Sie die Luftzufuhr, indem Sie einen feuchten Fingerspitzen vor dem Stecker, der an den Geruch Patrone befestigt werden. Es sollte ein starker Luftstrom nur dann, wenn die Ventile geöffnet sind. Prüfen Sie die Abgasanlage durch den Besitz eines fusselfreien Tuch bis zur Öffnung des Abgassystems, um sicherzustellen, wird der Luftstrom ist stark genug, um richtig zu evakuieren die Luft aus dem Anlage Arena.
    3. Montage der Geruch Cartridge
      1. Legen Sie etwas Knete entweder auf der Arbeitsplatte oder auf einem kleinen Plexiglas stehen, um die Biene und Geruch Patrone direkt vor dem Abgassystem zu positionieren. Das Glas Geruch Spritze in den Ton und so einstellen, die Öffnung in der breiten Ende an den Kopf der Biene hingewiesen. Das Ende der Spritze sollte 1-2 cm von der Biene sein. Wählen Sie einen Abstand in diesem Bereich und konstant sein.
      2. Sicher stellen das passende Verbindungs ​​die Patrone an den Luftschlauch und Ventilsystem über den schmalen Glasmehl Ende der Spritze.
    4. Präsentation der Geruch Stimulus
      1. Zu Beginn eines jeden Versuch, legen Sie die genutzt Biene auf der Stange in der Anlage Arena mit ihren Fühlern wies direkt auf die Geruchspatrone. Lassen Sie die Bienen Ruhe in der Arena für 15-25 sec vor Beginn der Geruchsreiz, damit sie daran gewöhnt, seine neue Umgebung zu werden.
        HINWEIS: Wenn die Biene beginnt, auf den Geruch Patrone sofort, nachdem er in der Arena platziert Anlage reagieren, kann es zu Geruchs auf der Patrone Spitze sein. Entfernen Sie die verunreinigenden Geruch durch Waschen der Kartusche mit einem fusselfreien Tuch in 70% Ethanol getränkt. Wenn das nicht das Problem zu lösen, ersetzen Sie die Patrone.
      2. Drücken Sie die Start-Taste, um die Timing-Mechanismus für die Geruchs Lieferung initiieren. Überwachen Reaktion der Biene, um den Geruch nach StimulusBeginn und vor der Vorlage des unbedingten Reiz.
      3. Nach jedem Versuch, damit die Biene in der Arena Anlage für ein anderes 15-25 sec bis zur anfänglichen Gedächtnisbildung ermöglichen ausruhen. Bewegen der Biene zu früh nach der Studie wird die Wirksamkeit der einzelnen Versuchsanlage deutlich reduzieren.
  4. Liefert die Saccharose (unbedingter Reiz)
    1. Methode 1
      1. Für diese Methode mit einem Zahnstocher, um die Saccharose zu liefern.
        HINWEIS: Es ist am besten, einen Kunststoff zu verwenden, da die Zahnstocher Zahnstocher aus Holz kann einen Geruch, die Reaktionen der Bienen auf den bedingten Reiz beeinflussen wird.
      2. Tauchen Sie die Spitze der Zahnstocher in den Saccharose-Lösung, und wenn es Zeit ist, den unbedingten Reiz präsentieren, halten Sie die Zahnstocher vor der Biene und damit die Biene, die Saccharose aus den Zahnstocher für ca. 1 sec zu lecken.
      3. Ersetzen Sie die Zahnstocher regelmäßig, um Ablagerungen zu vermeiden, von suCrose.
    2. Methode 2
      1. Saccharose Delivery System
        ANMERKUNG: Eine genauere Möglichkeit die unbedingter Reiz liefern, ist durch Verwendung von Mikrospritzen, die genau liefern können kleine Mengen (zehntel Mikroliter) der Saccharose Belohnung.
        1. Wickeln Sie das Mikrometer der Spritze so weit wie möglich. Laden Sie das Mikrometer Spritzenzylinder mit der Saccharoselösung. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in der Glasteil und montieren Sie die Spritze. Füllen der Nabe der Nadel mit der Saccharose-Lösung, bevor sie auf das schmale Ende des Spritzenzylinders. Um sicherzustellen, dass die Flüssigkeit in der Nadel ist eigentlich Saccharose und nicht Wasser aus dem Waschen der Nadel, wickeln Sie das Mikrometer vorwärts 1-2 ul vor Beginn des Experiments.
    3. Saccharose Präsentation
      1. Halten Sie die Spitze der Nadel ca. 2 cm von der Biene, während der Geruch wird vorgestellt. Verwenden Sie den Rand der Trainingsarena zu verhindernSchütteln Sie die Spritze wie die Bewegung kann die Biene abzulenken. Sie die Nadel zu nahe in Erwartung der Fütterung Signal nicht erhalten, so dass da auch vorzeitig die Biene die Aufmerksamkeit verschieben aus dem Geruch der Saccharose.
      2. Sobald die Fütterung Signal ertönt, berühren Sie leicht die Antennen, bis die Biene erweitert sein Rüssel, dann füttern die Biene. Dies sollte benötigen nur eine sehr leichte Berührung oder zwei zu den Antennen.
        1. Verwenden Sie eine Belohnung Menge zwischen 0,2 und 0,8 ul. Die Biene ist leicht zu konsumieren die gesamte Tröpfchen innerhalb der Frist für die unbedingte Reiz (~ 1-2 sec) zugeteilt. Verwenden Sie nicht "ad libitum" Fütterung von einem großen Tröpfchen, die die Biene ernährt sich für einige Sekunden, kann aber nicht ganz verbrauchen.
        2. Achten Sie auf Saccharose aufbauen auf der Antenne, die Reaktion der Bienen, um nachfolgende Präsentationen der Belohnung reduzieren. Ändern Sie die Fütterung Verfahren, wenn dies geschieht.
        3. Um eine genaue Kopplung der Geruchs gewährleistenCue und der Saccharose Belohnung, stellen Sie sicher, um die Tröpfchen des Saccharose-Lösung, die Biene so bald wie möglich nach dem Ton zu präsentieren.
          HINWEIS: Timing zwischen dem Einsetzen des CS (Geruch) und US (Saccharose) ist kritisch. Idealerweise sollte der Geruch Präsentation und Saccharose Präsentation kurz überlappen. Wenn mehr als ein paar Sekunden vergehen zwischen dem Ende des CS und Lieferung von den USA wird Anlage Leistung verringern.

4. Prüfung

  1. Nach Anlage Nutzung unverstärkt Testversuche zu beurteilen, wie gut die Bienen gelernt und / oder erinnern die klimatisierte Vereins.
    HINWEIS: Siehe die Diskussion für eine detaillierte Erklärung für die Bedeutung der "Antworten auf unverstärkte Testversuche zusätzlich zu den Bienen der Bienen Performance-Analyse in den Studien Anlage und eine Erklärung über den Zweck der Anzahl von Testversuchen und Test Gerüche.
  2. Konsolidierungszeit
    1. AnschlussAnlage, entweder sofort zu verabreichen Testversuch oder ermöglichen die Bienen durch eine Konsolidierungsphase ruhen.
      HINWEIS: Die Länge der Konsolidierungsphase, das Zeitintervall zwischen Konditionierung und Prüfung wird auf das Ziel des Experiments abhängt. Wenn der Zweck ist es, Lernschwierigkeiten oder Kurzzeitgedächtnis zu untersuchen, kann die Leistung der Bienen auf Testversuche unmittelbar nach oder einige Stunden nach Anlage ausgewertet werden. Wenn das Experiment beinhaltet die Untersuchung des Langzeitgedächtnisses, sind die Testversuchen mindestens 24 Stunden nach dem Ende des Anlage gegeben werden.
    2. Wenn die Testversuche sind mehr als 24 Stunden nach der Konditionierung, füttern die Bienen bis zur Sättigung mit 0,5 M Saccharose folgenden Anlage und mindestens einmal pro Tag danach, bis 12-24 Stunden vor dem Test-Studien.
      1. Um sicherzustellen, dass die Bienen Sättigung erreicht, füttern sich gegen von ihnen mehrere verschiedene Male, bis sie nicht mehr ihre Rüssel in Reaktion erstrecken sich berühren ihre AntenneE mit Saccharose. Sie können soviel wie 40 ul verbrauchen bis zur Sättigung zu erreichen.
    3. Halten die Bienen in einem befeuchteten Behälter, um ihre Trocknungs und Sterben in der Konsolidierungsphase zu verhindern.
  3. Test Trials
    1. Verwenden Sie nur neu erstellten Geruchspatronen zum Testen.
      HINWEIS: Die für die Erfassung verwendete Kartuschen differentiell abgereichert werden, so dass der Teststimulus wird nicht in den Studien, Gerüche und einzelne Bienen und deshalb könnte die Beständigkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse wesentlich beeinflussen.
    2. Während des Tests, pflegen die gleiche Inter-Prozess-Intervall und andere Parameter wie in der Konditionierungsphase des Experiments verwendet.
    3. Während der Test Studien präsentieren Sie nicht den unbedingten Reiz, da die Anwesenheit einer Belohnung wird die Reaktion der Bienen auf den bedingten Reiz verändern, möglicherweise Maskierung subtilerer Wirkungen der Anlage Protokoll oder einer Behandlung.
    4. Nehmen Sie Videos aller of der Testversuche in der Lage, später Reaktionen der Bienen zu messen mehrere Aspekte, um den Geruch (en) sein.

5. Aufnahme der Bienen Antworten

  1. Binary (Anwesenheit / Abwesenheit) Scoring von PER
    1. Verwenden Sie eine binäre Scoring-System von PER während Anlage Studien und während der Prüfung Studien. Antworten als Ergebnis entweder positiv oder negativ; Dies ist für viele Arten von Analysen mit einer Stichprobengröße von 20-40 Bienen pro Behandlungsgruppe zufriedenstellend. Die genaue Topologie der Antworten können komplexe 22 sein. Es ist wichtig, ein einfach zu sehen und zu punkten Kriterium für eine positive Reaktion zu etablieren.
      1. Ergebnis der Reaktion eines Bienen als positiv (+), wenn die Biene ihren Rüssel reicht über die Linie, indem die Spitzen der Mandibeln geöffnet werden. Nur ein Tor eine positive Reaktion, wenn die Biene ihren Rüssel nach erstreckt Geruch, aber vor Beginn Geruch ausgeglichen.
      2. Ergebnis der Reaktion eines Biene als negativ (-), wenn es keine Extension der Rüssel während der Prüfung oder, wenn der Rüssel ist nach dem Offset der Geruchsstoff erweitert.
      3. Vermeiden Sie versuchen, teilweise Antworten punkten. Feinere Unterscheidungen im Verhalten der Bienen machen, verwenden Sie die Video-Analyse-Technik im Folgenden erläutert.
  2. Videoanalyse der Messungen zusätzlich pro (Film 1)
    1. Zusätzliche Informationen von Verhaltenstests zu sammeln durch die Analyse von Videos von Antworten einer Biene um einen Geruch.
      ANMERKUNG: Diese Messungen können auch eine höhere zeitliche Auflösung für die Untersuchung der Bienen Antworten auf die Gerüche, insbesondere, wenn es eine Differenz in der Gegenwart / Abwesenheit des PRO-Scoring zwischen den Behandlungsgruppen.
    2. Die Videos
      1. Verwenden Sie immer unverstärkt Test oder Aussterben Studien für Videoaufnahmen. Die Anwesenheit der Belohnung wird die Reaktion der Bienen, um den Geruch zu verändern, modifizieren die Dauer der Rüssel-Erweiterung.
      2. Stellen Sie eine Videokamera auf einem Stativ über der Trainingsarena und Fokus der Kamera auf der Vorderseite der Kopf der Biene, so dass die Antennen und Rüssel sind scharf.
      3. Positionieren Sie den kleinen LED-Licht, das Geruchsstimuluspräsentation zeigt, in einem Bereich hinter der Biene, die sichtbar ist in dem Video, um es zu benutzen, um Geruch zu Beginn und während der Analyse-Offset zu identifizieren.
      4. Starten Sie die Aufnahme 20 Sekunden vor Beginn und Geruch weiterhin die Aufnahme für mindestens 20 Sekunden nach Geruch, bevor die Biene zu stören ausgeglichen.
    3. Videoanalyse
      1. Laden Sie die Videos in Video-Editing-Software wie iMovie oder Final Cut Pro, mit der Fähigkeit des Messzeitintervalle zwischen bestimmten Frames im Video.
      2. Analysieren der Antwort der Bienen, den Geruch für eine diskrete Zeitdauer beginnend mit dem Einsetzen des Geruchsreiz (beispielsweise 10 oder 20 Sekunden).
      3. Verwenden Sie die folgenden allgemeinen Messungen zur Bewertung PER:
        1. Messen Sie dieDauer der Rüssel-Erweiterung, die die Gesamtzeit, die der Rüssel erstreckt sich über den Unterkiefer zu Unterkiefer Linie (oben beschrieben).
          HINWEIS: Eine Biene kann sich zurückziehen und ihre Rüssel mehrfach während der 10-20 Sekunden Zeitfenster. Messen Sie jeden Rüssel Erweiterung individuell und berechnen die Gesamtdauer. Analyse der Anzahl und Dauer der einzelnen Rüssel Verlängerung kann auch wertvolle Informationen.
        2. Messen Sie die Latenzzeit der Rüssel-Erweiterung, die die Zeit zwischen Beginn Geruch ist, wenn die LED leuchtet auf, und der ersten Erweiterung Rüssel.
        3. Zählen und Zeit Glossal Verlängerungen relativ zu dem Beginn der Riechstoff, der ersten Verlängerung oder andere Zeitparameter.
        4. Verfolgen Antennallobus Wanderung 23, die auch zeigen, charakteristischen Geruch orientierten Veränderungen.
          HINWEIS: Im Film 1 sind die Antennenbewegungen mit Video-Tracking-Software verfolgt worden, um die Änderung in der Antennenbewegungen veranschaulichen in als Reaktion auf ein Geruchsreiz.

Representative Results

Wir stellen zwei Beispiele für die Verwendung der oben beschriebenen PRO-Protokolle. Das erste Beispiel hat die Verwendung von Verfahren 2 zu untersuchen, wie Honigbienen wahr verschiedene Gerüche in Abhängigkeit von dem Molekular Ähnlichkeit als CS 5,24,25 verwendet Geruch. Der zweite ist ein Beispiel für die Verwendung von Methode 1 und einige der Vorsichtsmaßnahmen, die beim Beginn PER Anlage Experimente im Forschungslabor Gebrauch genommen werden müssen.

Studien wie diese sind verwendet worden, um die Geruchs "Wahrnehmungsraum" der Bienen und Motten in Verbindung beschreiben mit BioImaging 13 oder elektrophysiologische Analysen 26. Honigbienen (n = 20) wurden konditioniert, um den Geruchsstoff Dekanats mit Saccharose Verstärkung über 12 Vorwärts-Paarung Anlage Studien (3A) zu verknüpfen. Etwa 10% der Honigbienen hat 'spontan' auf der ersten Studie, die normal ist. Danach wird der Prozentsatz responded in den nächsten Studien zu erhöhen, bis 100% der Honigbienen hat auf der fünften Versuch und jede weitere Prüfung. Mehrere Studien haben gezeigt, dass dieser Anstieg der Reaktion ist spezifisch für die Vorwärtskopplungsanlage (1) in Bezug auf mehrere wichtige Kontrollverfahren 3. Nach der Akquisitionsphase wurde jede Honigbiene auf einer Reihe von Testversuchen unverstärkt (3B), die Exposition gegenüber dem Geruch CS und auf mehrere andere Geruchsstoffe, die systematisch von der CS in der molekularen Strukturen unterschieden sich beteiligt unterzogen. Honigbienen reagierte am stärksten auf die CS. Ihre Reaktionen auf die anderen Duftstoffe verringert als Funktion der systematischen Änderungen in der Struktur, mit den niedrigsten Antworten auf die Geruchsstoffe wenigstens wie der CS.

In Abbildung 4 sind die Ergebnisse aus einer aktuellen Workshop, in dem Studenten gelernt haben, zum ersten Mal, wie man Bienen mit Methode 1 dargestellt zu konditionieren. Studenten Tannen t Anlage Honigbienen durch Vorwärtspaarung methycyclohexanone (MCH) oder Octanol (OCT) mit Saccharose Verstärkung (4A). Antworten Prozent niedriger waren auf dem ersten Versuch und erhöht bei zukünftigen Studien, was darauf hinweist, dass die Bienen gelernt, den Geruch-Saccharose Vereins. Es gab Unterschiede in dem Maße, wie die Bienen lernten die konditionierten Assoziation zwischen den verschiedenen Gruppen von Studenten. Nach unserer Erfahrung können diese Arten von Differenzen aufgrund der Geruch, der wie der CS verwendet wurde, zu den ungenauen Elemente im Verfahren (Verfahren 1) oder auf den Ausbildungsstand der Experimentatoren. Im dritten Fall, wird schnell Leistung mehr im Einklang mit zunehmender Erfahrung die Experimentatoren. Nach der Konditionierung wurde jede Honigbiene zweimal mit je Geruch getestet. In Gruppen von Honigbienen, die mit zukunfts Paarung von OCT oder MCH konditioniert worden war, die Antwort war, wie erwartet, am stärksten in den klimatisierten Geruch (4B).

ent "> Die zweite Gruppe von Honigbienen, die nach vorne Paarung an Oktober erlebt wurde parallel zu einer anderen Gruppe, in der der Geruch Oktober wurde rückwärts mit Saccharose gepaart Anlage. Rückwärts-Paarung ist eine von mehreren Arten von Kontrollverfahren, um zu zeigen, dass der Anstieg in Reaktion ist spezifisch für Paarung weiterzuleiten und nicht durch einen anderen Prozess, wie unspezifische Erregung von Sensibilisierung. Für Abwärts Paarung, die Saccharose USA und Geruch CS werden in umgekehrter Reihenfolge zu dem, was in Abbildung 1 zeigt von hinten Paarung vorgestellt. Acquisition Daten nicht gezeigt, weil der CR kann nicht erzielt wurden gegeben werden die Präsentation des Geruchs CS nach Vorlage von Saccharose. Als würde für assoziative Anlage vorhergesagt werden, die Antwortstufen Oktober waren in der Vorwärts gepaart Gruppe in Bezug auf die Rückwärtsgruppe (4C) höher.

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Abbildung 1. Diagramme der Versuchsplanung für Anlage mit zukunfts Paarung. Siehe Tabelle 1 für Definitionen der in dieser Abbildung verwendeten Begriffe. (A) Die CS (Geruch) vorangeht und überschneidet sich mit den USA (Saccharose / Wasser-Lösung). Die Beziehung zwischen der CS und US gezeigt ist optimal für Anlage Bienen und Motten. Aber die optimale ISI finden Sie auf der Anlage Protokoll-und Tierarten 1 abhängen. (B) Pannenhilfe und relative Zeit von CS, CR, USA, und UR. Der CR, die entweder vor oder während der US-Präsentation unverstärkten 'test' Studien auftritt, ist die abhängige Maß für experimentelle Protokolle.

Figur 2
Abbildung 2. Geruch Erschöpfung mit Wiederverwendung von Patronen. Für diesen Daten wurden GeruchspatronenSet-up mit Hexanol, wie im Text beschrieben. Hexanol wird allgemein als CS PRO Studien verwendet; Jedoch wird die tatsächliche Geschwindigkeit der Verarmung auf den Geruch und Lösungsmittel abhängen. Patronen wurden dann noch einmal 4 Sekunden jede Minute über 8 Studien (unter der Annahme, 5 Honigbienen / Versuch in einem Standard-Experiment, das 40 Anwendungen entsprechen würde) verwendet. Die Verdünnungen in der angegebenen Lösungsmittel, die für die PRO-Experimente relativ üblich waren, wurden 2,0 M (A) und 0,2 M (B). (A, B) Der Geruch wurde nach der ersten und der achten Studien durch Adsorption an einer festen Phase abgetasteten Mikroextraktion (SPME) Faser, die dann auf einen Gaschromatographen desorbiert wurde. Die relativen Flächen unter den Peaks höher waren nach dem ersten Versuch in Bezug auf die achte für beide Lösungsmittel und für beide Konzentrationen (Wilcoxon matched pairs Vorzeichen-Rangtest p <0,05 [*] oder höher), die zeigt, dass weniger Geruch wurde von der Patrone geliefert nachdem die Kassette hatte eine Anzahl von Malen. (C, D) die gleichen Daten, die gerade die achte tr verwendet ial mit dem erweiterten y-Achse. Es zeigt, dass Verarmungs geringfügig größer für Hexan, bezogen auf Mineralöl, sondern nur bei der niedrigeren Konzentration.

Figur 3
Abbildung 3. Erwerb und Test mit Dekanats als CS und Verfahren 2 bis Anlage. (A) Test-by-trial-Reaktion (CR) über 12 Vorwärts-Paarung Studien (Abbildung 1). Die Daten stammen aus n = 20 Honigbienen in vier Gruppen von jeweils 5 Honigbienen konditioniert. Der ISI war 3 Sekunden und die ITI war 6 min. (B) unverstärkt Tests mit Gerüchen, die von Dekanats von Kohlenstoffkettenlänge und / oder die Position des Carbonylkohlenstoff abweichen. Die Gerüche wurden in einer randomisierten Serie über die vier Gruppen vor und wurden mit verstärkten Versuchen mit Dekanats (alle zwei bis drei Versuche), um Aussterben der CR vermeiden setzt.

e_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 4
Abbildung 4. Die Daten aus einem Workshop, in dem Studenten wurden ausgebildet, um Bienen zu konditionieren mit PER-Methode 1. (a) Erwerb von Daten aus drei Gruppen von Honigbienen Anlage zu Octanol (n = 23 und 15 für die GPS-1 bzw. 2) und Methylcyclohexanon (n = 10), (B) CRs bei unverstärkten Tests mit beiden Gerüche. vier Studien in zufälliger Reihe über Gruppen vorgestellt. (C) unverstärkt Tests mit beiden Gerüche in zwei Gruppen von Honigbienen, eine zukunfts gepaart (Gp 1, n = 23) und eine nach hinten gepaart (n = 25).

Begriff (Abkürzung) Definition Relevante Beispiel
Bedingten Reiz (CS) EinReiz, der eine geringe oder keine Reaktion auslöst, an ersten und signalisiert US GERUCH
Konditionierte Reaktion (CR) ein Die Antwort auf das CS nach Verbindung mit dem US Rüssel EXTENSION
Unbedingten Reiz (US) Ein biologisch wichtige Impulse, die eine Antwort entlockt Saccharose / Wasser-Lösung
Unbedingte Reaktion (UR) ein Die Reaktion auf die US Rüssel EXTENSION
Inter-Stimulus-Intervall (ISI) Die Zeit zwischen dem Beginn des KS und Einsetzen der US Geruch SUCROSE Intervall
Inter-Testintervall (ITI) Die Zeit zwischen aufeinander CS-US-Paarungen für ein einzelnes Tier Geruch (Studie n), um Geruch (Test n + 1)-Intervall

Tabelle 1. Imwichtige Begriffe. Siehe für eine Darstellung dieser Begriffe Abbildung 1 a. Für PRO Anlage der CR und UR sind die gleichen, wenn auch für andere Arten von Verbänden und Reflexe der CR und UR können abweichen.

Film 1. Ein Video einer Honigbiene, Durchführung und PRO nachdem sie konditioniert worden, um einen Geruch zu reagieren. Beachten Sie die PRO Reaktion der Biene ca. 1,5 sec nach Beginn Geruch. Tracking-Software abgebildet, die Antennenbewegungen als Reaktion auf Präsentation der Geruch. Die in der oberen rechten Ecke des Videozeichneten Linien veranschaulichen die tatsächlichen Antennenbewegungen. Die beiden Grafiken unten auf dem Bildschirm zeigen anten Bewegungen auf der X-(links) und Y (rechts) koordiniert. Die vertikalen Linien in der Grafik in dem Video zu sehen geben, von links nach rechts, Licht an, PRO, Licht aus und Rüssel Rückzug.

Discussion

Dieses Protokoll präsentierte zwei zuverlässige Methoden zur Konditionierung mit der pro Verfahren. Dies sind zwei von mehreren Verfahren, die erfolgreich eingesetzt 27, 21 haben. Wir beschäftigen Methode 2 für alle experimentellen Studien mit an, wie es durchgängig zuverlässig ist, auch über verschiedene Experimentatoren.

Das gleiche Grundverfahren hat zu viele verschiedene Arten von Studien mit Honigbienen, einschließlich der Verwendung von unterschiedlichen Stimuli Anlage und unterschiedliche Verhaltensreflexe angepasst. Es wurde auch auf Untersuchungen über die genetische Basis von Unterschieden in der Lern 28,29, die physiologische Korrelate der geruchlichen Wahrnehmung und Gedächtnis im Gehirn 13,14,30 verbunden worden, und die modulierende und molekularen genetischen Grundlagen des Verhaltens 15,16,31 . Aufgrund der fortgeschrittenen Kenntnisse der ökologischen Relevanz von olfaktorischen Lernen für Bienen, die vor über 100 Jahren mit den ersten Studien, die von Karl von Frisch gestartet 17 zu untersuchen.

Die prinzipielle Vorgehensweise ist leistungsstark, dass es angewendet werden, um Probleme in anderen Spezies als auch untersucht werden. Zwei Schmetterlingsarten, Manduca sexta und Spodoptera littoralis, haben in Studien und PRO verwendet worden, um die neuronalen Grundlagen der Geruchsidentifikation und Geruchs Lernfähigkeit 32,33 jeder einzelnen Art zu untersuchen. PRO Experimente mit Fruchtfliegen haben viele Einblicke in die molekularen Signalkaskaden in Chemosensorik und Lern 34 beteiligt sind. Und PER wurde kürzlich zur Gewöhnung auf dem Floh (Rhodnius prolixus) 35, eine wichtige Krankheitsüberträger zu studieren.

Im Allgemeinen ist das Verfahren robust gegenüber Änderungen der Verfahren; die Verwendung von different Methoden wird wahrscheinlich produzieren die gleiche relative Unterschied zwischen den Behandlungsgruppen. Trotz der relativ einfaches Verfahren, mehrere Probleme können manchmal verhindern Honigbienen vom Lernen die geruchs Saccharose Vereins. Die folgenden Themen sind mögliche Änderungen des Protokolls und einige der Probleme, die während PRO Anlage entstehen können.

Überlegungen zu Anzahl und Art der Prüfungen in der Anlage Protokoll

Jede Lern ​​Protokoll Exposition der Bienen zu einer Reihe von Studien in der Akquisitionsphase erfordern. Diese Anzahl hängt weitgehend von der Schwierigkeit der Aufgabe. Honigbienen können eine einfache Aufgabe nach einem einzigen Versuch zu lernen, aber sie müssen von mindestens drei Studien zur langfristigen Gedächtnisbildung induzieren. Wie erwartet, wird die Honigbienen deutlich mehr Studien erforderlich, um eine schwierige Aufgabe angemessen zu lernen. Im Allgemeinen gibt es eine maximale Anzahl von Versuchen über die Bienen nicht mehr wesentlich verbessern dieir Leistung. Dieses Maximum hängt von der spezifischen Aufgabe, den Geruch Arten und Konzentrationen und der Saccharose-Konzentration.

Bei der Verwendung von mehr als einer Art von Versuch mit verschiedenen Gerüchen, präsentieren die verschiedenen Versuchstypen in einer Pseudo-Zufallsfolge, um die Bienen aus Auswendiglernen eine einfache Abfolge von Geruch Präsentationen anstatt zu lernen, die Unterschiede zwischen den Gerüchen 36 zu halten. In diesen Pseudo-Zufallsfolgen, muss eine gleiche Anzahl von Versuchen für jedes der Geruchsarten sein. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit einer Studie mit einem Geruchstyp durch Vor und nach dem gleichen Geruch oder eine der anderen Gerüche, muss für alle Gerüche werden. Für zwei Gerüche - A und B - nutzen Sie die folgende Sequenz: ABBABAAB. Über acht Studien jeder Geruch wird vier Mal vorgestellt. Verketten identischen Sequenzen, um die gewünschte Anzahl von Studien für jede Geruchs erreichen.

Unabhängig von der experimentellen Design gibt es einige Parameter, bleiben müssenKonstante, um die Lern ​​optimieren. Die Überlappung zwischen der CS und dem US ist entscheidend für die effektive Anlage. Die Inter-Prozess-Intervall (Abbildung 1, Tabelle 1) muss konstant sein und optimiert werden, weil Unregelmäßigkeiten oder eine zu kurze oder zu lange zwischenProbeIntervall kann deutlich die Wirksamkeit des Protokolls 1 Anlage beeinflussen.

Überlegungen über die Bedeutung und Gestaltung von Behavioral Testing Trials

Antworten während der "Erfassungsphase" von einem Experiment, wenn die CS und US werden gemeinsam präsentiert aufgezeichnet, kann nützlich sein. Doch Vorsicht, dass die Geruchspräsentationsbedingungen können von einer Art von Studie zu Land unterschiedlich. Während verstärkt Studien wird der Geruch gefolgt von Sucrose in Kombination mit einem visuellen Reiz (Bewegung der Einrichtung zum Abgeben des Tröpfchens Saccharose), die Reaktion der Bienen beeinflussen können dargestellt. Und die Bienen haben nur 3 Sekundens, um eine Antwort (Abbildung 1 von vier Sekunden nach Geruch Stimulation minus einer Sekunde Überlappung mit Saccharose Präsentation) zu zeigen. Wenn das Experiment beinhaltet die Bienen lernen, zwei Gerüche zu unterscheiden (zB verstärkte und unverstärkte), der unverstärkten Geruch auf alternative Studien vorgestellt tritt ohne den visuellen Reiz der Belohnung Präsentation und die Bienen haben die vollen vier Sekunden, um zu reagieren. Daher werden die Reaktionen auf die beiden Gerüche nicht während der Akquisition vollständig vergleichbar. Mit jedem Anlage Protokoll, nicht allein auf Erwerb Kurven 1 angewiesen sind. Um besser zu ermitteln, was die Bienen gelernt haben, stellen eine Reihe von unverstärkten Testversuche, bei denen weder Geruch verstärkt, die dafür sorgt, dass die Prüfung aller Reize unter gleichen Bedingungen stattfindet.

Je nach dem spezifischen Zweck des Experiments kann das Testen der einzelnen Testversuche der konditionierten Geruch oder eine Reihe von Studien mit dem konditionierten OD bestehenoder oder eine Kombination aus den aufbereiteten und neuartige Geruchsbildung. Ein einzelner Test-Studie mit dem Geruch Anlage bietet einen einfachen Test, ob die Bienen erinnere mich an den Geruch konditioniert. Allerdings kann die Reaktion auf den ersten Testversuch der Bienen Motivation Ebene sowie deren Abberufung des Anlage Geruch zu reflektieren. Eine Reihe von Testversuchen, entweder eine Reihe von Studien Erlöschen der bedingten Geruch oder einer Reihe von Einzeltests der konditionierten und einen oder mehrere neue Gerüche, können auch verwendet werden, um Speicher zu beurteilen. Die Reihe der vom Aussterben Studien beurteilen kann, wie stark die Bienen erinnern die klimatisierte Vereins. Je stärker die Rückruf die größere Anzahl von Studien benötigt, um die bedingte Reaktion zu löschen. Eine Reihe von Einzeltests von konditionierten und neue Gerüche können auch prüfen, die Spezifität des Speicheranlage Geruch der Bienen.

Es ist auch zwingend notwendig, um zu konditionieren und testen sowohl Kontrolle und behandelten Gruppen zu den gleichen Zeitpunkten. Comparing die Leistung der Bienen bald nach Anlage für Bienen über einen längeren Zeitraum gehalten ist aufgrund der Exposition gegenüber dem US-Saccharose, indem die Bienen bis zur Sättigung problematisch. Zum Beispiel könnte eine Abnahme der Leistung nach langen Intervallen aufgrund von Speicher Zerfall oder es könnte aufgrund von Änderungen der Motivationszustand und / oder Lernen durch unverstärkte Engagement am US-induziert sein, so dass die Ergebnisse nicht eindeutig. Daher sollte die Leistung einer Behandlungsgruppe immer relativ zu einer Kontrollgruppe, konditioniert und in den gleichen Zeitpunkten getestet, beurteilt werden.

Geruchsstoffkonzentration und Integrität

Es gibt mehrere Möglichkeiten, in denen die Konzentration und Integrität des Geruchs (CS) verglichen werden kann. Die am weitesten verbreitete Problem mit Geruchs Lieferung ist die Erschöpfung der Geruchspatronen durch Überbeanspruchung (Abbildung 2). Ersetzen Sie die Patronen 10-12 Nutzungen (alle 2 oder-3-Studien mit Gruppen von 5 Honigbienen), um diese Gefahr zu vermeiden. Es ist auch wichtig zu bedienenfrische Patronen für Testversuche, da gebrauchte Patronen können unterschiedlich aufgebraucht sein und somit ungleichen Geruch Reize. Ein weiteres allgemeines Problem ist geruchsPatrone Kontamination durch Verwendung der Kartusche für mehr als einen Geruch, ohne vollständig reinigen. Eine schmutzige oder kontaminierte Luftstrom kann auch unbeabsichtigt führen zusätzliche Geruchsreizes (Aktivkohlefilter können Hintergrundbelastung zu verhindern). Dies ist besonders problematisch, wenn die Kopplung PER Anlage mit Messungen der physiologischen Reaktionen auf den Geruch. Leaky Geruchspatronen stellen ein Problem dar, da die Bienen ausgesetzt sind geruchs bevor der Prozess beginnt, was den Stellenwert der Geruchsreiz reduziert. Locker sitz auf der Luftzufuhr für die Geruchs Lieferung kann in wenig oder gar keine Geruchs Lieferung führen, wenn das Ventil geöffnet wird, künstlich Reaktion der Bienen auf die vorgesehene Verringerung der Geruch.

Saccharose-Lösung und unbedingten Reiz (Belohnung)

Die eineHalterung, Konzentration und Integrität der wie die USA verwendet Saccharose-Lösung sind entscheidend für den Erfolg des Experiments. Anlage ist eine Funktion der Menge und Konzentration der Saccharose-Wasser-Lösung als US 37 verwendet. Die Mikrometer-Spritzen in Methode 2 verwendet werden, erlauben eine sehr präzise (bis zu 0,2 ul) Kontrolle von US-Lieferung, und wir empfehlen die Verwendung von ihnen für beide Methoden beschrieben. Verwendung der Zahnstocher (Methode 1) ist ausreichend für Umstände, unter denen die teuren Spritzen kann nicht verwendet werden, wie in der Ausbildung große Gruppen von Studenten, Arbeit auf dem Feld, oder mit geringeren Budgets. Sorgfältige Umsetzung der Methode 1 ist in Ordnung, solange Timing wird mit regelmäßigen Austausch der Zahnstocher gehalten, um den Aufbau von Saccharose (und die gelieferte Konzentration) zu vermeiden. Verwendung Zahnstocher ist es jedoch schwieriger, genau zu steuern und die Schätzung der Menge und der Größe der US geliefert, die für Studien Anlage 1 ist. Die Konzentration von Saccharose zu benötigteneine ausreichende Belohnung, um die Bienen motiviert, um das konditionierte Verein erfahren Sie auf der Schwierigkeit der Aufgabe und inneren Zustand der Bienen oder der Jahreszeit abhängig zu halten. Die schwierigeren Aufgaben erfordern einen höheren Saccharose-Lösung für die Bienen ", um die Aufgabe erfolgreich zu lernen. Schimmel kann Aufbau in Saccharoselösungen selbst bei 5 ° C, die die Integrität der Lösung beeinträchtigt wird, die Gesundheit und die Wahrnehmung der Belohnung der Bienen beeinflussen während des Experiments. Es ist am besten, um die Lösung alle paar Tage zu ersetzen.

Präzision, Timing, und die Konsistenz der CS und US-Lieferung

Die entscheidende Frage über die richtige Umsetzung einer pro Verfahren, oder für diese Angelegenheit jeder Konditionierungsverfahren beinhaltet Präzision, Timing und Konsistenz von CS und US-Lieferung (Abbildung 1). Die Ermittler, die neu in das Verfahren sind häufig ungenau sind über Lieferung von einem oder beiden Reize. ISI, die für die CS überlappen zu lassen scheitern und US in den armen Anlage Leistung führen. Die SPS automatisiert ein akustisches Signal für den Experimentator zu Saccharose 3 Sekunden nach dem Beginn der Geruch Lieferung zu liefern. Die Ermittler sollten die Saccharose / Wasser-Tröpfchen in der Nähe des Bienen für die schnelle Lieferung, nachdem das Signal zu halten. Diese Verfahren helfen mitzureißen eine konsistente ISI. Platzieren einer Stoppuhr durch die Arena Anlage ermöglicht die komfortable Platzierung Zeit der Studie sowie die Überwachung der Bienen Zeit in der Arena vor und nach der Lieferung von Reizen. So werden die ITI relativ konsistent sein und die gesamte Prozedur kann bei einer kontrollierten Tempo ausgeführt werden. ITI, die zu kurz sind, beispielsweise weniger als 1 min, oder zu lang kann zu schlechter Leistung Anlage 1 führen.

Saisonale, ökologische und Kontext-bezogene Auswirkungen auf die Honigbiene Leistungs

Leistung Honigbienen 'durch seine Umgebung deutlich beeinflusst werdensowohl vor als auch während der Konditionierung. Häufig werden die Temperaturschwankungen und die Verfügbarkeit von Nahrungsmitteln, die mit dem Wechsel der Jahreszeiten kommen der Bienen Motivation zum Lernen zu verändern. Wenn die Blüten in voller Blüte, um die Bienen Motivation lernen die klimatisierte Verein im Labor nimmt 38. Wenn die Kolonie wird betont - von extremen Temperaturen, Nahrungsmittelknappheit, Krankheit oder Stress - die Bienen "wird eine Verringerung ihrer Lernleistung im Inneren zeigen. Honigbienen in einem Flugraum kann auch für eine Weile gehalten lernen, aber es gibt auch den Stress der Krankheit und Alterung ihrer Lernleistung im Laufe der Zeit verschlechtern. Der Kontext während der Konditionierung kann auch die Leistung der Bienen zu verringern. Etwaige Fremdgeruch, Bewegung und andere Reize können die Biene aus den experimentellen Stimuli abzulenken. Um dieses Problem zu vermeiden, halten Sie einen einigermaßen konsistent, vereinfachte visuelle Kontext.

Genotyp und Erfahrung wirkt sich pro Vorstellung

<p class = "jove_content"> Honigbiene Arbeiter erheblich in der Leistung auf jedem Konditionierungsverfahren wegen Aufgabe Spezialisierung, Genotyp, oder andere Umweltfaktoren 20 abweichen. Daher ist es wichtig, zu standardisieren, so viel wie möglich, die Arten der Tiere in einem Experiment verwendet, um interindividuelle Schwankung zu verringern. In einer Kolonie von einer offen begattete Königin, was bedeutet, sie mit vielen verschiedenen Drohnen gepaart führte, werden die Arbeiter in väterlicher Genotyp unterscheiden. Genetischen Hintergrund kann zu dramatischen Unterschiede in der sensorischen Reaktions 39 und 29 Lernleistung führen. Mit Kolonien, die von Königinnen instrumentell durch Spermien aus einzelnen Drohnen besamt 28 geführt reduziert diese interindividuellen Schwankungen.

Die oben beschriebenen Protokolle, umfasst ein Verfahren zum Sammeln Honigbiene Arbeiter aus dem Nesteingang. Allerdings sind diese Bienen unterscheiden sich voneinander in Bezug auf das Alter oder Verhaltens Aufgabe. Sie können jung sein (inexperienCED) oder älter (mehr erfahren) Sammlerinnen. Sie können junge Honigbienen, die ihre erste Orientierung Flüge sein. Oder sie können Schutz Bienen sein. Um die Variabilität zu verringern, markieren die Bienen mit einem schnell trocknenden Lackfarbe oder Kennzeichnung Tags entweder so wie sie als Erwachsene (für Age Control) und treten / oder wie sie Nahrungssuche (für Erfahrungen zu kontrollieren) beginnen. Dann, ein paar Tage später, sammeln die Bienen für die deutliche Anlage. Arbeiter, die in der Pflege tätig sind, können das Verhalten von den Rahmen in den Bienenstock gesammelt werden. Krankenschwestern können positiv identifiziert werden, wenn sie ihre Köpfe in eine Brutzelle einfügen, um für die Larve innerhalb füttern und pflegen.

Mit Virgin Queens oder Drohnen für PRO Anlage

Neben der Arbeiter Honigbienen, Bienenköniginnen Jungfrau und Drohnen können ohne weiteres in einer pro Verfahren für ein Studium an der Entwicklung genetischen Linien von Honigbienen, die in Lernleistung 28 unterscheiden sollen konditioniert werden. Virgin Königinnen sollten nach th bald gesammelt werdeney ergeben sich aus der Verpuppung und direkt in Rückhaltegurte ohne Betäubung gesetzt. Junge, unreife Drohnen aus der Brutwaben in der Kolonie gesammelt werden, sind in der Regel nicht motiviert zu lernen. Nachdem sie begonnen haben Paarungsflüge, Drohnen leicht zu lernen und PRO Aufgaben 28. Sie sollten gesammelt werden, da sie von einem Hochzeitsflug in einer Kolonie für die Aufzucht von Königinnen zurück und gepflegt über Nacht in einem kleinen Käfig. Versuchen Sie nicht, um sie am Tag vor Anlage nutzen; sie nicht gut in Bäume über Nacht zu überleben. Ein paar Stunden vor der Konditionierung können die Drohnen aus den Käfigen gesammelt und ohne Betäubung in die Haltegurte angebracht werden.

Schlussfolgerungen

Dies PER Verfahren in der Art der Verfahren, beträgt ein Ausgangspunkt für die Gestaltung PER Experimenten. Die meisten Protokolle und PRO wird verlangen, dass das Verfahren in irgendeiner Weise umrissen geändert werden die spezifischen Ziele des Experiments und Unterkünfte zu implementierene mehrere Behandlungsgruppen. Es ist einfach zu implementieren. Allerdings erfordert die ordnungsgemäße Umsetzung Liebe zum Detail und Praxis. Einmal gemeistert es kann ein leistungsfähiges Verfahren, um als Forschungswerkzeug für mehrere grundlegende und angewandte Forschungsprogramme mit verschiedenen Insektenarten hinzufügen.

Acknowledgments

(; BH Smith Co-PI J Trumble PI) und der Arizona State University Diese Forschung wurde unterstützt durch Mittel aus NIH NCRR (R01 RR014166 BHS), NIH NIDCD (R01 DC011422 BHS Co-PI), dem US-Landwirtschaftsministerium unterstützt. Die Finanzierung für den Workshop für Studenten (Daten in Abbildung 4) zu trainieren wurde von der Science Foundation of Chile zur Verfügung gestellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose Sigma-Aldrich S9378-1KG
Odorant Compounds (for example)
    1-hexanol Sigma-Aldrich 471402-100ML For additional examples
    2-octanone Sigma-Aldrich W280208-800G-K of odorants, see any of
    heptanol Sigma-Aldrich 51778-5ML the papers on olfactory
    gerianol Sigma-Aldrich 163333-25G processing from the
    nonanal Sigma-Aldrich 131210-100ML Smith lab.
Hexane Sigma-Aldrich 296090-1L
Heavy mineral oil Sigma-Aldrich 330760-1L Make sure it’s odorless.
Ethanol Sigma-Aldrich 459836-1L
Scintillation vials Sigma-Aldrich Z190535-1PAK Use a small drill bit to bore a small hole in the cap of the vials.
Bee harness Custom-made from 0.9 cm diameter plastic soda straws or hard plastic/metal tubing.
Duct tape
Kimwipes Sigma-Aldrich Z188956-1PAK
Wash bottles Sigma-Aldrich Z560847-3EA For the 70% ethanol.
Dryer tubing
FOR METHOD 1 ONLY
20 ml disposable plastic syringes Cole-Parmer WU-07945-18
15 mm filter paper circles Sigma-Aldrich Z274844-1PAK
Pushpins
Toothpicks
FOR METHOD 2 ONLY
Gilmont Micrometer syringe, 0.2 ml Cole-Parmer EW-07840-00
Gilmont micrometer syringe tip Cole-Parmer EW-07841-00
26 G 3/8” Leur hub hypodermic needles Fisher Scientific 14-826-10
1 cc tuberculin syringes (plastic/glass) Sigma-Aldrich Z181641-1EA OR Z192090-200EA Glass tuberculin syringes are available, but plastic syringes are much less expensive and will work well for a limited number of uses.
Small rubber/silicone restrictors Cole-Parmer EW-95702-02 Made from 4.8 mm outer diameter silicone tubing or the rubber tips of the 1 cc syringe plungers.
Name Company Catalog Number Comments
Parafilm Sigma-Aldrich P7793-1EA
75 x 100 mm filter paper Sigma-Aldrich Z695106-500EA
Direct Logic 05 Programmable Logic Controller Koyo Electronics Industries Co, Ltd
1 mm, 4 mm, & 6 mm inner diameter PVC or silicone tubing Cole-Parmer Various Cole-Parmer has a wide selection of suitable tubing.
Polypropylene connectors & leur fittings Cole-Parmer Various Cole-Parmer has a wide selection of connectors and fittings for many tube sizes.
65 mm Correlated Flowmeter Cole-Parmer EW-03216-08 Aluminum with glass float; for liquids and gases, with valve.
OR
Tetra Whisper 300 (Tetratek DW96-2) Aquarium Air Pump Aquacave AE-TETRA-300
LIF series Solenoid Valves for .042 " ID Tubing, Configuration "E" The Lee Company LFAA1200118H Neoprene, 430 SS, 302 SS, 280 mW
PC-Board 12VDC 70dB Piezo Buzzer RadioShack 273-074

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References

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Smith, B. H., Burden, C. M. A… More

Smith, B. H., Burden, C. M. A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research. J. Vis. Exp. (91), e51057, doi:10.3791/51057 (2014).

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