Abstract
Насекомые изменить свои ответы на раздражители через опыт их сопоставления стимулов с событий, важных для выживания (например, продукты питания, товарищей, угроз). Есть несколько поведенческие механизмы, посредством которых насекомое учится существенные ассоциации и относит их к этим событиям. Важно понять эту поведенческую пластичность для программ, направленных на оказание помощи насекомых, которые являются выгодными для сельского хозяйства. Это понимание также может быть использован для обнаружения решения для биомедицинских и сельскохозяйственных проблем, создаваемых насекомых, которые выступают в качестве переносчиков болезней и вредителей. Протокол кондиционирования Хоботок Расширение отклика (PER) была разработана для медоносных пчел (Apis MELLIFERA) более 50 лет назад, чтобы изучить, как они воспринимают и узнать о цветочных запахов, которые сигнализируют нектар и пыльцу ресурсов, выделяемых для колонии потребности для выживания. Процедура PER обеспечивает надежную и удобную в службе основу для изучения несколько различных экологически соответствующую механизмы поведенческой пластичности. Это можно легко адаптировать для использования с несколькими других видов насекомых и других поведенческих рефлексов. Эти протоколы могут быть легко использованы в сочетании с различными средствами для контроля нейронной активности в центральной нервной системе с помощью электрофизиологических или биоимиджинга, или для манипулирования целевых нейромодуляторного пути. Это надежный тест для быстрого выявления сублетальный воздействие на поведение, вызванное экологического стресса, токсинов и пестицидов.
Мы покажем, как протокол PER является просто реализовать с помощью двух процедур. Один подходит в качестве лабораторного упражнения для студентов или для быстрых анализов влияния экспериментального лечения. Другой предоставляет больше тщательный контроль переменных, что очень важно для изучения поведенческих кондиционирования. Мы покажем, как несколько мер по поведенческой реакции, начиная от бинарных да / нет, чтобы более непрерывной переменной, как задержки и длительности расширения хоботка может быть использован для тестирования hypotheseс. И мы обсудим некоторые подводные камни, которые исследователи обычно сталкиваются, когда они используют процедуру в первый раз.
Introduction
Многие насекомые узнать о экологически соответствующих стимулов, и они затем изменить их поведенческие ответы на эти раздражители, чтобы адаптироваться к новым прогнозных отношений в своей среде. Несколько различных механизмов может лежать в основе этого поведения пластичность (например, неассоциативная, ассоциативная / Павлова и оперантного / инструментальный 1). Эти типы пластичности отличаются тем, как стимулы или поведения, связанные с важными событиями, такими как возникновения пищи, мат, или опасности. Понимание этих форм пластичности является очень важным для фундаментальных исследований в том, как нервная система изменяет кодировать новые воспоминания 2. Это также важно для понимания адаптивных поведения насекомых, которые являются важными переносчиками заболеваний (например, мухи цеце и комаров) и насекомых, которые в сельском хозяйстве важно, либо в растениеводстве (медоносных пчел) или как вредителей.
Изучение поведения пластичность в любом Анималь требуется уровень экспериментального контроля над числом переменных, что не достижимо в области 1. Это требует разработки надежной протокола кондиционирования, которые могут быть использованы в более контролируемых условиях, но которые все еще актуален для поведения в естественных условиях. Мед пчелы (Apis MELLIFERA) является прекрасной моделью для как разработать протокол для выполнения контролируемых анализы поведенческой пластичности 3,4. Хоботок Расширение отклика (PER) в медоносных пчел является естественной поведенческой рефлекс, в котором пчела расширяет свой хоботок в ответ на усиков стимуляции с раствором сахара. Во время нормального кормления поведения, PER происходит, когда пчела находит нектар в цветке. К счастью, пчелы охотно демонстрируют эту простую и легко поддающиеся количественному поведение в лаборатории. Это дает возможность учиться, в контролируемых условиях, механизмы, влияющие на этот экологически соответствующую поведение 5. PER чан также использоваться в рамках протокола кондиционирования для расследования стимула восприятие и обучения и памяти в различных условиях лечения, которые предназначены для выявления поведенческих и нервных механизмов, лежащих в основе пластичности 6.
С первых исследованиях Кувабара 7, PER кондиционирования широко используется для выявления неассоциативное, ассоциативную и оперантного механизмы, лежащие в основе поведения пластичность в медоносных пчел 8. Эти механизмы идентичны тем, которые показали в исследованиях свободно летающих пчел 9. В отличие от исследований свободно летающих пчел, протоколы НА кондиционирования могут быть связаны с электрофизиологии 10,11 или живых клеток флуоресценции изображений 12-14 мозга. Кроме того, протоколы НА позволяют экспериментальной манипуляции нервных путей через фармакологических или молекулярно-генетических методов лечения для проверки гипотез о роли конкретных компонентов сети, таких как Neuromodulators 15,16. Протоколы НА также предоставили важную способ оценить сублетальные последствия изменений экологических условий, а также токсинов на здоровье и нагула эффективности медоносных пчел 17.
Эта процедура описывает два способа доставки запах параллельно. Способ 1 является версия запаха и безусловный раздражитель (сахароза) поставки, который обеспечивает недорогой и технически простой метод для представления запах и сахарозы награду. Этот метод хорош для базовой подготовки и при автоматизации не представляется возможным. Это отличный способ представить эту технику к классе или преподавательской лаборатории. Во время кондиционирования для экспериментов с участием более сложные задачи и в сочетании физиологические оценки запаха восприятия, обучения, или памяти, это очень важно, чтобы аккуратно и точно регулировать начало, доставки продолжительность сроков раздражители. Для наиболее надежной доставки стимула, использовать средства автоматизации доставки запах Aй точный метод доставки вознаграждения. Способ 2 применяет автоматизированные доставку запаха и более точное сахарозы доставку. Это технически более сложным и требует более для первоначальной настройки, чем метод 1, но это значительно увеличивает согласованность сроков и количества стимулов, используемых для кондиционирования и должны быть использованы, когда это возможно.
Protocol
1 Запах (условный раздражитель) Настройка картриджа
- В начале эксперимента, настройки нескольких картриджей запаха для всех различных запахов, необходимых для испытаний кондиционирования.
- Используйте вытяжной шкаф для разбавления запаха и подготовки запах картриджа. Никогда не открывайте бутылки запахов за пределами этой вытяжкой, так как запахи быстро распространилась по всей лаборатории и потенциально подвергайте медоносных пчел на запах перед кондиционированием. Кроме того, носите перчатки при настройке запах картриджи и тщательно вымыть позже, чтобы не подвергать медоносных пчел к запахам, а справиться с ними.
- Убедитесь, что каждый запах картридж четко обозначена с цветовой кодировкой этикетке запах, для которой он впервые использовал. Никогда не используйте запах картридж (шприца или поршня) для более чем одного запаха, так как там может быть остаточный запах на картридже.
- Подготовка Запахи и запах смеси
- Развести запахи в любом гексан или минерального масла в дesired концентрация.
Примечание: Изменение концентрации запаха или представления смеси двух или более отдушек может позволить для исследования дополнительных аспектах, как пчелы чувствуют запахи и узнать условной связи. Запах смеси могут быть также просто, как 50:50 бинарной смеси или же сложным, как несколько запахов, которые имитируют природные обонятельные стимулы. Снижение концентрации запаха также увеличивает сложность задачи.- Запахи будет истощаться повторного использования картриджа (Рисунок 2). Чтобы избежать проблем с истощением сделать достаточно патронов, чтобы иметь возможность перейти на новый картридж каждый 10-12 использует.
- Развести запахи в любом гексан или минерального масла в дesired концентрация.
- Подготовка запах картриджей
- Способ 1
- Для этого метода используют 20 мл пластиковые шприцы с диаметром 15 мм круга фильтровальной бумаги прижат к резиновой конце плунжера для запаха картриджей.
- Удалите поршень из шприца и использовать канцелярскую кнопку, чтобы прикрепить кусок FilteR бумаги на конце плунжера.
- С помощью микропипетки, чтобы поместить по 10 мкл запаха на фильтровальную бумагу, и снова вставить поршень в цилиндр шприца. Надавите на поршень до отметки 15 мл на цилиндре шприца.
- Способ 2
- Для этого метода, использовать 1 куб.см стекла или пластика туберкулиновых шприцев (или модифицированные пипетки аналогичного объема и формы) с полоской фильтровальной бумаги внутри и резиновой или силиконовой ограничителем в широком конце шприца для запаха картриджей.
- Удалите поршень из 1 куб.см туберкулин шприца. Цилиндр шприца будет корпус картриджа запаха.
- Снимите резиновый наконечник черный от поршень шприца и отрезать закрытого конца резиновым наконечником.
Примечание: Этот резиновое кольцо будет действовать как ограничитель для уменьшения всасывания от воздушного потока на арене, которые преждевременно привлечь запах из картриджа и более сдержанным медоносной пчелы. С другой стороны, силиконовые трубки (4,8 мм OUTEДиаметр г) нарезать 5 мм секции работают как ограничители.
- Промойте внутреннюю часть цилиндра шприца и резины / силикона ограничитель с 70% этанола (для удаления большей части остаточного запаха от предыдущего использования), и пусть они высохнуть на воздухе.
- Поместите 0,2 х 4 см полоску фильтровальной бумаги в широком открытии ствола таким образом, что бумага проходит 1-2 см за пределы отверстия.
- С помощью микропипетки, чтобы поместить 3-10 мкл запаха на фильтровальную бумагу, не позволяя запах прикоснуться к концу шприца. Пипетки, могут использоваться для того же запаха, но убедитесь, что используете свежий наконечник настроить следующий запах.
- Включите широкое отверстие цилиндра шприца вверх так фильтровальную бумагу быстро скользит в трубке. Вставьте ограничитель в широким отверстием цилиндра шприца.
- Убедитесь, что каждый запах картридж четко обозначена с цветовой кодировкой этикетке запах он впервые использовал для. Никогда не используйте запах картридж (шприца или Ограничictor) для более чем одного запаха, так как там может быть остаточный запах на нем.
- Мяч до конца безворсовой ткани, смочите его с 70% этанола, и использовать его для тщательно протрите внешнюю поверхность картриджа, чтобы удалить остатки запаха на внешней стороне картриджа.
- Способ 1
2 Сбор, запретительного и Кормление пчел
- Подготовка Bee сдерживающих жгуты
- Делаем простые запретительные жгуты для медоносных пчел из пластиковых соды соломки, жесткий пластиковой трубки, или обработанной металлической трубки (все примерно 0,9 см внутренний диаметр и имеют 1-2 мм толщиной стенки). Используйте крепкие жгуты для процедур, связанных с хирургии.
- Вырезать 3 см разделы трубки. Тогда, частично обрезать примерно половину верхних 1 см жгута, чтобы сделать его легче держать пчел на месте, пока крепления проводов.
- Отрежьте 0,2 х 6 см полосу клейкой ленты и подключите один конец к одной стороне пчелы жгута, ЛеаВинг другой конец свободным.
- Сбор рабочих пчел
- Соберите работников от входа в колонию, поскольку они паузу перед отъездом из колонии или, как они возвращаются из нагула.
ПРИМЕЧАНИЕ: поместить лист проволочной сетки, с отверстиями только достаточно крупных для рабочих пчел, чтобы пролезть, над входом замедляет возвращающихся рабочих вниз и делает его легче захватить их, прежде чем они попадают в колонию. - Поместите сцинтилляционный флакон над пчелы, пока он не взлетает в него. Держите флакон с момента открытия по горизонтали или вниз в то время как крышка крепится так пчела не взлететь из флакона. Поместите только один пчелу в каждом флаконе. Убедитесь, что крышка имеет отверстие в нем, чтобы иметь возможность для надлежащего газообмена.
- Сбор пчел быстро, чтобы минимизировать время, которое они проводят в пробирках. Держите флаконы с пчелами в них в маленькой коробке, в тени.
- Перевести коробку с флаконах и пчел в лаборатории, и поместите флаконы в воды со льдом SLУрри, пока пчелы не перестанут двигаться. После того, как пчела неподвижна, снять флакон со льда немедленно, чтобы избежать чрезмерного воздействия холода, и поместить пчелу в упряжке запрета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы не рекомендуем размещать пчел в холодильнике или морозильной камере, так как это очень трудно контролировать, когда пчелы становятся неподвижными, в результате чрезмерного воздействия холода. Когда освоение более 10 пчел, перенести только несколько пчел в водно-ледяной взвеси в то время.
- Соберите работников от входа в колонию, поскольку они паузу перед отъездом из колонии или, как они возвращаются из нагула.
- Сдерживая Пчелы
- Поместите пчелу в упряжке с его спинной грудной клетки, обращенной к вырывом часть трубы и голову чуть выше верхней части трубки. Аккуратно нажмите на пчелу, близкий к трубке так ее ротовой аппарат выходит за края трубы. Вставьте полосу клейкой ленты в между головой и грудной клетки на спинной стороне пчелы и прочно прикрепить свободный конец в сторону жгута.
- Убедитесь, что лента на жгуте гладкая и упругая. Там не должно быть никаких NotIceable промежутки между передней подвеске пчелы и ленты, и ленты должна плоско лежать на верхней части упряжи. Если есть пробелы пчела не может быть в состоянии расширить свой хоботок правильно или это может уйти. Кроме того, убедитесь, что передние ноги пчелы не выступающие между передней подвеске и клейкой лентой.
- Поместите пчелу в упряжке с его спинной грудной клетки, обращенной к вырывом часть трубы и голову чуть выше верхней части трубки. Аккуратно нажмите на пчелу, близкий к трубке так ее ротовой аппарат выходит за края трубы. Вставьте полосу клейкой ленты в между головой и грудной клетки на спинной стороне пчелы и прочно прикрепить свободный конец в сторону жгута.
- Кормление пчел и кормления Conditioning Interval
- Около 30 мин следующее освоение - после того, как пчелы оправились от первоначальной настройки - кормить пчел 3-4 мкл 0,5 М сахарозы (в воде). Эта сумма будет достаточно для интервала подачи-до-кондиционирования 3-4 ч.
- В общем, кормить 1 мкл 0,5 М сахарозы примерно каждый час времени ожидания между кормлением и кондиционирования для обеспечения пчелы выжить интервал еще достаточно голоден в начале кондиционирования быть мотивированы, чтобы узнать условной связи. В лаборатории хранится в теплой температуре или, если Uпеть другую концентрацию сахарозы, регулировать количество подаваемого или временной интервал соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: При кормлении к кондиционирования интервалом 24 ч, убедитесь, что все пчелы кормят в насыщения с 0,5 или 1 М сахарозы, по крайней мере 24 часов, прежде чем кондиционер начнет. При комнатной температуре, пчелы требуют примерно 24 час, прежде чем они достаточно мотивированы, чтобы эффективно реагировать на протокол кондиционирования.
Примечание: использовать более низкую концентрацию раствора сахарозы для кормления пчел, чем концентрации, используемой в качестве награды во время выдержки, чтобы предотвратить пчел стать менее чувствительны к концентрации сахарозы, используемой во воздуха, что может уменьшить производительность обучения 18. - Поток пчел в районе вдали от полигоне. Воздействие безусловного раздражителя (сахарозы) в контексте кондиционирования перед кондиционирования может повлиять последующее кондиционирование на запах.
- В общем, кормить 1 мкл 0,5 М сахарозы примерно каждый час времени ожидания между кормлением и кондиционирования для обеспечения пчелы выжить интервал еще достаточно голоден в начале кондиционирования быть мотивированы, чтобы узнать условной связи. В лаборатории хранится в теплой температуре или, если Uпеть другую концентрацию сахарозы, регулировать количество подаваемого или временной интервал соответственно.
- В перерыве между кормлением и сonditioning разместить пчел на столешницу в тихом районе в лабораторию, чтобы избежать ненужных помех. Если лаборатория имеет низкую влажность окружающего, разместить пчел в пластиковый контейнер с влажными бумажными полотенцами в течение интервала времени. Это предотвращает высыхание, так как пчелы могут погибнуть, если они подвергаются воздействию низкой влажности в течение длительного периода времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не изменить протокол освоение и подачи в эксперименте! Используйте только один конкретный временной интервал между настройке и кормления пчел и начинают кондиционирование для каждого эксперимента так пчелы все обработанной точно так же.
- Около 30 мин следующее освоение - после того, как пчелы оправились от первоначальной настройки - кормить пчел 3-4 мкл 0,5 М сахарозы (в воде). Эта сумма будет достаточно для интервала подачи-до-кондиционирования 3-4 ч.
3 Кондиционер
- Тестирование на сахарозы Чувствительность
- Через несколько минут до начала кондиционирование, проверить мотивацию пчел, чтобы накормить, прикоснувшись свои антенны с небольшим капли 0,5 М раствора сахарозы (той же концентрации используется во время кормления). Не позволяйте им кормить во время этого теста. Если они отвечают Exteнахождении их хобота, они, вероятно, достаточно заинтересованы в изучении и может быть использован для протокола.
- Эксперимент Дизайн
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол может быть изменен, чтобы соответствовать широкий спектр протоколов обучения, чтобы исследовать многие аспекты обучения и памяти возможностями медоносных пчел. Среди многих параметров, которые можно регулировать являются: Inter-испытание интервал, количество пчел подготовленных в данный момент времени, интервала между стимулом, типа и концентрации и количество запахов, типа и концентрации безусловного раздражителя, количество и последовательность испытаний (фиг.1; Таблица 1) 19-21. При проектировании точное протокол для каждого испытания кондиционирования, очень важно, чтобы сохранить между пробную интервал последовательную через лиц. Между пробная интервал, что слишком короткая, слишком длинная или несовместимы ухудшают производительность пчел. Смотрите обсуждение для полного лечения этой теме.
ПРИМЕЧАНИЕ: Beeс узнаете задачу быстрее, если они находятся в теплом помещении. Поэтому держать температуру среды обучения последовательным и тепло (29-30 ° C, если это возможно). - Доставка запах (условный раздражитель)
- Способ 1
- Настройка системы Запах поставки
- Установите пластиковую 20 мл шприц, в который загружена запаха обращению фильтровальной бумаги так она стабильна и маленький конец сталкивается непосредственно на антеннах пчелы. Установите поршень на отметке 15 мл и расположите шприц так поршень легко добраться.
- Представляя запах Стимул
- В начале каждого испытания, поместите пчелу в упряжке на вешалке на арене кондиционирования с его антенны прямо указал в сторону картриджа запаха. Пусть пчелы акклиматизироваться к арене для 15-25 сек до начала запаха стимул для снижения нарушений, вызванных резким изменением его визуальных обстановке во время запаха стимула.
- Если пчела начинает реагировать на запах картриджа сразу после его помещают на арене кондиционирования, может быть запах на кончике картриджа. Снимите загрязняющих запах промывкой картридж на игру в безворсовой ткани, смоченной в 70% этанола. Если это не решает проблему, замените картридж.
- Нажмите поршень шприца с постоянной скоростью, так что поршень полностью нажатой в течение 4 сек. Монитор ответ пчелы к запаху, прежде чем представлять безусловный раздражитель.
- После каждого испытания, позволяют пчела отдохнуть на арене кондиционирования для другого 15-25 сек. Перемещение пчел слишком скоро после суда позволит значительно снизить эффективность каждого испытания кондиционирования.
- В начале каждого испытания, поместите пчелу в упряжке на вешалке на арене кондиционирования с его антенны прямо указал в сторону картриджа запаха. Пусть пчелы акклиматизироваться к арене для 15-25 сек до начала запаха стимул для снижения нарушений, вызванных резким изменением его визуальных обстановке во время запаха стимула.
- Настройка системы Запах поставки
- Способ 2
- Настройка системы Запах поставки
- Воздушный поток Источник и расхода
- В качестве источника воздушного потока для доставки запахаиспользовать аквариумный аэратор насос или лабораторном столе питания сжатым воздухом, если лаборатория оснащена него.
ПРИМЕЧАНИЕ: Типичный аквариум аэратор насос будет иметь расход воздуха около 400 мл / мин (7 мл / сек); по 4 сек запаха стимула, 28 мл воздуха будет проходить через картридж емкостью 1 мл. - С помощью расходомера в соответствии с трубки на аппарате подачи воздуха для регулирования скорости потока для подачи воздуха. Регулировка расходомера, пока скорость потока не является 400 мл / мин. Проверить расход газа на открытии картриджа запаха с отдельным расходомера.
- Подключение воздуха к картриджу запаха с помощью системы пластиковых труб и клапанов.
ПРИМЕЧАНИЕ: счетчик времени обсуждаются ниже открывает клапаны в соответствующее время в суде. Пластиковые разъемы прикрепить воздушного потока системы картриджа запаха через крепления типа Luer к шприца картриджа,. - Независимо от источника воздушного потока, проверьте расход периодически маке, что линия не повреждена и скорость потока поддерживают на уровне требуемой скоростью.
- В качестве источника воздушного потока для доставки запахаиспользовать аквариумный аэратор насос или лабораторном столе питания сжатым воздухом, если лаборатория оснащена него.
- Воздушный поток Источник и расхода
- Автоматизированная Запах Доставка
- Используйте программируемый логический контроллер (PLC) для автоматизации доставку запахом.
ПРИМЕЧАНИЕ: PLC программируется открыть клапаны на поставки запах поток воздуха 6 сек после начала программы (инициированный нажатием кнопки), держать клапаны открытые на 4 сек, и звуковой предупредительный сигнал кормления, через небольшой динамик, 3 сек после запаха начала стимула, чтобы сигнализировать экспериментатору для доставки сахарозы. - Используйте маленькую светодиод для индикации сроки проведения запаха стимула во время каждого испытания. Если можно использовать красный светодиод, так как фоторецепторы пчел сдвинуты от длинных [красный] длин волн и в сторону коротких [УФ] длин волн, поэтому они не могут видеть это хорошо. Расположите LED позади и ниже пчелы, за пределами их поля зрения, так что свет не станет непреднамеренное условный раздражитель.
ПРИМЕЧАНИЕ: ЛигаHT также помогает убедиться, что PLC работает правильно и полезно при анализе видеозаписи ответов пчел во время тестирования испытаний.
- Используйте программируемый логический контроллер (PLC) для автоматизации доставку запахом.
- Выхлопная система
- Настройте систему выпуска за пчелой, чтобы помочь вытащить воздух мимо пчелы и эвакуировать запах-Ладена воздух с арены кондиционирования для поддержания дискретный сроки для каждого презентации запаха.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть вакуумная система в лаборатории, изменить вакуумный порт и приложите водовод из труб сушилки для обеспечения потока воздуха, необходимого для эвакуации арену кондиционирования. Если нет вакуумная система, небольшой вентилятор расположен в соответствии с трубки сушилки привело к вытяжным шкафом или через окно хватит.
- Настройте систему выпуска за пчелой, чтобы помочь вытащить воздух мимо пчелы и эвакуировать запах-Ладена воздух с арены кондиционирования для поддержания дискретный сроки для каждого презентации запаха.
- В начале каждого дня, проверьте электрические и воздушные соединения системы доставки запах и выхлопной системы. Нажмите кнопку запуска на системе доставки запах и отслеживать время между нажатиемКнопка и когда клапаны открываются (тихий щелчок и LED загорается) и когда биток представить безусловного раздражителя (звуковой сигнал) звучит. Проверьте подачу воздуха путем размещения влажную пальца перед разъема, который будет прикреплен к картриджа запаха. Там должна быть сильная струя воздуха только тогда, когда клапаны открыты. Проверьте выхлопную систему, удерживая безворсовой ткани до открытия выхлопной системы, чтобы убедиться, поток воздуха достаточно сильна, чтобы правильно эвакуации воздуха с арены кондиционирования.
- Настройка системы Запах поставки
- Монтаж Запахи картриджа
- Поместите немного пластилина либо на столешницу или на небольшом оргстекла стоять позиционировать пчелы и запах картридж непосредственно перед выхлопной системы. Поместите стекло запах шприц в глине и отрегулируйте его так, открытие в широком конце направлена на голове пчелы. Конец шприца должна быть 1-2 см от пчелы. Выбор расстояние в пределах этого диапазона и постоянной.
- Надежно разместить фитинг, соединяющий картридж с трубкой воздуха и системой клапанов над узкой притертой концу шприца.
- Представляя запах Стимул
- В начале каждого испытания, поместите запряженную пчелу на вешалке на арене кондиционирования с его антенны прямо указал в сторону картриджа запаха. Пусть пчелы отдохнуть на арене для 15-25 сек до начала запаха стимул, чтобы позволить это, чтобы привыкнуть к его новому окружению.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если пчела начинает реагировать на картридже запаха немедленно после помещения на арене кондиционирования, может быть запах на кончике картриджа. Снимите загрязняющих запах промывкой картридж на игру в безворсовой ткани, смоченной в 70% этанола. Если это не решает проблему, замените картридж. - Нажмите кнопку Пуск, чтобы начать часовой механизм для доставки запаха. Монитор ответ пчелы к запаху после стимуланачало и до предъявления безусловного раздражителя.
- После каждого испытания, позволяют пчела отдохнуть на арене кондиционирования для другого 15-25 сек, чтобы позволить для формирования первоначального памяти. Перемещение пчел слишком скоро после суда позволит значительно снизить эффективность каждого испытания кондиционирования.
- В начале каждого испытания, поместите запряженную пчелу на вешалке на арене кондиционирования с его антенны прямо указал в сторону картриджа запаха. Пусть пчелы отдохнуть на арене для 15-25 сек до начала запаха стимул, чтобы позволить это, чтобы привыкнуть к его новому окружению.
- Способ 1
- Доставка сахарозы (безусловного раздражителя)
- Способ 1
- Для этого метода, использовать зубочистку, чтобы доставить сахарозы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это лучше всего использовать пластиковую зубочистку поскольку деревянные зубочистки может иметь запах, который будет влиять на ответы пчел на условный раздражитель. - Опустите кончик зубочистки в растворе сахарозы, и, когда пришло время, чтобы представить безусловного раздражителя, удерживайте зубочистку перед пчелы и позволяют пчела лизать сахарозу от зубочисткой в течение приблизительно 1 сек.
- Замените зубочистку регулярно, чтобы избежать накопления суCrose.
- Для этого метода, использовать зубочистку, чтобы доставить сахарозы.
- Способ 2
- Сахароза Система доставки
ПРИМЕЧАНИЕ: Более точный способ доставки на безусловного раздражителя через использование микрометра шприцы, которые могут качественно доставлять небольшие суммы (десятых долей мкл) из сахарозы награды.- Ветер микрометр шприца назад, насколько это возможно. Загрузите микрометр шприца с раствором сахарозы. Убедитесь, что нет пузырьков в стеклянной части и собрать шприц. Заполните ступицу иглы с раствором сахарозы перед установкой ее на узком конце цилиндра шприца. Чтобы убедиться, что жидкость в иглу на самом деле сахароза, а не вода от мытья иглу, ветер микрометр вперед 1-2 мкл до начала эксперимента.
- Сахароза Система доставки
- Сахароза Презентация
- Держите кончик иглы примерно 2 см от пчелы в то время как запах представлена. Используйте край Тренировочной арене, чтобы предотвратитьвстряхивая шприц как движение может отвлечь пчел. Не поймите иглу слишком близко в ожидании сигнала кормления, так как это будет также досрочно переключить внимание пчелы от запаха к сахарозы.
- Как только звучит сигнал кормления, слегка касались антенны, пока пчелы не распространяется хоботок, то кормить пчел. Это должны требовать только очень легкое прикосновение или два к антеннам.
- Используйте количество вознаграждение от 0,2 до 0,8 мкл. Пчела должна легко занять всю каплю в течение срока, отведенного для безусловного раздражителя (~ 1-2 сек). Не используйте "вволю" кормления из большого капельке, что пчела питается в течение нескольких секунд, но не может полностью потребляют.
- Следите за сахарозы построить на антенне, что позволит снизить реакцию пчелы для последующих презентаций награды. Изменение процедуры подачи, если это происходит.
- Для обеспечения точной спаривание запахкий и награда сахароза, убедитесь представить капельку раствора сахарозы пчеле как можно скорее после сигнала.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки между наступлением CS (запах) и США (сахарозы) имеет решающее значение. В идеале, презентация запах и сахароза презентация должна кратко перекрываются. Если больше, чем несколько секунд пройти между конце CS и доставке США, производительность кондиционирования будет уменьшаться.
- Способ 1
4 Тестирование
- После использования кондиционирования неармированных испытания тестовых чтобы оценить, насколько хорошо пчелы научились и / или запомнить условной связи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите обсуждение для детального объяснения важности анализа "ответы на неармированных испытаний тестовых помимо пчел Пчелы выступления в судебных процессах кондиционирования и объяснения с целью ряда тестовых испытаний и тестов запахов. - Консолидация Время
- Послекондиционирования, либо вводить немедленно тест суда или разрешить пчелы отдыхать через период консолидации.
Примечание: длительность периода консолидации, интервал времени между кондиционирования и испытаний, будет зависеть от цели эксперимента. Если цель состоит в изучении различий обучения или кратковременную память, производительность пчел на тестовых испытаниях можно оценить сразу же после или через несколько часов после кондиционирования. Если эксперимент предполагает расследование долгосрочную память, тестовые испытания должны быть не менее чем за 24 ч после окончания кондиционирования. - Если тест испытания более 24 ч следующее кондиционирование, не кормить пчел, чтобы насыщения 0,5 М сахарозы следующее кондиционирование и по крайней мере один раз в день после до 12-24 часов, после чего в результате испытаний.
- Чтобы убедиться, что пчелы достигли насыщения, кормить каждый из них несколько различных раз, пока они больше не расширить свои хоботок в ответ на прикосновения их антеннуэлектронной сахарозой. Они могут потреблять столько, сколько 40 мкл для достижения насыщения.
- Держите пчел в увлажненной контейнер для предотвращения их высушивания и умирает в период консолидации.
- Послекондиционирования, либо вводить немедленно тест суда или разрешить пчелы отдыхать через период консолидации.
- Тестовые испытания
- Используйте только недавно подготовленные запах картриджи для тестирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Картриджи, используемые для приобретения может быть дифференциально истощены, так что тест стимул не будет соответствовать по испытаний, запахов и отдельных пчел и, следовательно, может существенно повлиять на последовательность и устойчивость результатов. - Во время тестирования, сохранить тот же между пробную интервал и другие параметры, используемые в фазе кондиционирования эксперимента.
- Не представить безусловного раздражителя во время тестовых испытаний, так как присутствие в награду будет изменять реакцию пчел на условный раздражитель, потенциально маскируя более тонкие эффекты протокола кондиционирования или лечения.
- Запись видео из всех уплотнительныее тестовых испытаний, чтобы иметь возможность позже измерить множественные аспекты ответов пчел на запах (ы).
- Используйте только недавно подготовленные запах картриджи для тестирования.
5 Запись ответов пчел
- Двоичной (Наличие / отсутствие) Подсчет PER
- Используйте двоичный системы баллов PER во кондиционирования испытаний и во время тестирования испытаний. Оценка ответов как положительный или отрицательный; это удовлетворительным для многих видов анализа с учетом размера выборки 20-40 пчел в группе лечения. Точная топология ответов может быть сложным 22. Важно установить легко увидеть и забить критерий для положительного ответа.
- Оценка ответа пчела в качестве положительного (+), когда пчелы расширяет свой хоботок за линию сделанного, соединяющая вершины открытых челюстями. Только забить положительный ответ, когда пчелы расширяет хоботок после запаха начала, но до запаха смещения.
- Оценка ответа пчелы, как негативный (-), когда нет электроннойXTension хоботка в ходе судебного разбирательства или если хоботок расширенных после смещения одоранта.
- Избегайте пытается забить частичные ответы. Чтобы сделать тонкие различия в поведении пчел, использовать технику видеоанализа, описанной ниже.
- Используйте двоичный системы баллов PER во кондиционирования испытаний и во время тестирования испытаний. Оценка ответов как положительный или отрицательный; это удовлетворительным для многих видов анализа с учетом размера выборки 20-40 пчел в группе лечения. Точная топология ответов может быть сложным 22. Важно установить легко увидеть и забить критерий для положительного ответа.
- Видео Анализ дополнительных измерений в (Фильм 1)
- Соберите дополнительную информацию от испытаний поведения, анализируя видеозаписи ответов пчелы к запаху.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти измерения могут также обеспечить более высокий временное разрешение на обследование ответов пчел к запахам, особенно, когда есть не разница в наличии / отсутствии озвучивания PER между группами лечения. - Запись видео
- Всегда используйте неармированных тестирования или вымирания испытаний для видеозаписей. Наличие награду изменит реакцию пчел к запаху, изменяя длительность расширения хоботка.
- Установите видеокамеру на штативе выше Тренировочной арене и сфокусировать камеру на передней части головы пчелы, так усики и хоботок в фокусе.
- Расположите небольшой светодиод, который указывает запах презентацию стимулов, в районе за пчеле, которая видна на видео, чтобы использовать его для выявления запаха начало и окончание во время анализа.
- Начните запись 20 сек до запаха начала и продолжения записи не менее 20 сек после запаха смещение до нарушая пчелу.
- Анализ Видео
- Загрузить видео в видео программное обеспечение для редактирования, такие как IMOVIE или Final Cut Pro, с возможностью измерения временных интервалов между конкретными кадров видео.
- Проанализируйте реакцию пчел к запаху для дискретного периода времени, начиная с наступлением запаха стимула (например, 10 или 20 сек).
- Используйте следующие общие измерения для оценки PER:
- Измерьтепродолжительность расширения хоботка, который является общее время, что хоботок выходит за пределы нижней челюсти-к-нижняя челюсть линии (описано выше).
ПРИМЕЧАНИЕ: Пчела может продлить и убрать свой хоботок многократно в течение временного окна 10-20 сек. Измерьте каждое расширение хоботок индивидуально, и рассчитать общую продолжительность. Анализируя количество и продолжительность каждого отдельного расширения хоботка также может предоставить ценную информацию. - Измерьте задержку расширения хоботка, который является время между запаха начала, когда светодиод загорается, и первое продление хоботка.
- Количество и время Glossal расширения относительно наступления одоранта, первое продление, или других временных параметров.
- Отслеживание усиков движения 23, которые также показывают характерным запахом, ориентированных на изменения.
ПРИМЕЧАНИЕ: В кино 1, усиков движения были отслеживаться с отслеживая видео программного обеспечения, чтобы проиллюстрировать изменения в усиков движений яРеакция на запах стимула.
- Измерьтепродолжительность расширения хоботка, который является общее время, что хоботок выходит за пределы нижней челюсти-к-нижняя челюсть линии (описано выше).
- Соберите дополнительную информацию от испытаний поведения, анализируя видеозаписи ответов пчелы к запаху.
Representative Results
Приведем два примера использования протоколов ЗА описанных выше. Первый пример использовал метод 2, чтобы изучить, как пчелы воспринимают различные запахи, как в зависимости от молекулярной сходство с запахом используется в качестве CS 5,24,25. Второй пример использования метода 1 и некоторые меры предосторожности, которые должны быть приняты, когда начинают использовать PER кондиционирования экспериментов в научно-исследовательской лаборатории.
Исследования, подобные этому, были использованы для описания обонятельный 'восприятия пространства »из медоносных пчел и бабочек в сочетании с биоимиджинга 13 или электрофизиологические анализирует 26. Медоносные пчелы (п = 20) были обусловлены ассоциировать одоранта деканаль сахарозой арматуры более 12 вперед спаривания испытаний кондиционирования (Рисунок 3А). Примерно 10% из медоносных пчел ответил 'спонтанно' на первом суде, что вполне нормально. После этого процент, что ОтвечаетD увеличить в течение ближайших нескольких испытаний до 100% из медоносных пчел не ответил на пятом проб и каждого последующего судебного разбирательства. Несколько исследований показали, что это увеличение в ответ специфичен к переднему состоянии спаривания (Рисунок 1) по отношению к ряду важных процедур контроля 3. После этапа приобретения, каждый мед пчелы был подвергнут серии неармированных испытаний тестовых (Рисунок 3B), в котором участвовали воздействия запаха CS и нескольких других пахучих веществ, которые систематически отличаются от базовой станции в молекулярных структур. Медоносные пчелы самая заметная реакция на CS. Их ответы на других пахучих веществ снизилось в зависимости от систематических изменений в структуре, с самыми низкими ответов на одорантов наименее как CS.
На рисунке 4, результаты недавнего семинара, в которых студенты узнали, впервые, как состояние пчел, используя метод 1 проиллюстрированы. Учащиеся ели т кондиционером медоносных пчел от переднего спаривания methycyclohexanone (MCH) или октанолом (ОКТ) с сахарозой арматуры (Рисунок 4а). Процент ответы были ниже на первом суде и увеличился на последующих испытаний, с указанием, что пчелы научились запах-сахароза ассоциацию. Были различия в степени, что пчелы научились условный ассоциации по всей различных групп учащихся. По нашему опыту, эти виды различий может быть связано с запахом, который был использован в качестве CS, к неточных элементов в методе (метод 1), или к уровню подготовки экспериментаторов. В третьем случае, производительность быстро становится более согласуется с повышенной опыта экспериментаторов. После кондиционирования, каждый мед пчелы дважды испытывалась с каждым запахом. В группах медоносных пчел, которые были условными с передней спаривания октября или МЧ, ответ был, как и ожидалось, сильнейший на условный запахом (Рисунок 4B).
ЛОР "> Вторая группа медоносных пчел, которые испытали вперед сопряжение с октября было обусловлено параллельно в другую группу, в которой запах ОКТ назад в паре с сахарозой. назад спаривание является одним из нескольких видов контрольных процедур, чтобы продемонстрировать, что увеличение в ответ специфично направить спаривание, а не в связи с другим процессом, таких как неспецифический возбуждения от сенсибилизации. Для обратной спаривания, сахароза США и запах CS представлены в обратном порядке тому, как показано на рисунке 1. Сбор данных из отсталой спариванием не показано, потому что CR не может быть забивали учитывая презентация запаха CS после презентации сахарозы. Как можно было бы предсказать ассоциативного кондиционирования, уровни реагирования на октябрь были выше в прямом паре группы по отношению к отсталого (Рисунок 4C).7fig1highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рис.1 Схемы эксперимента для кондиционирования с использованием форвардных спаривание. Таблице 1 определений терминов, используемых в этом рисунке. () CS (запах) предшествует и перекрывается с США (раствор / вода сахароза). Отношения между CS и США показали, является оптимальным для кондиционирования медоносных пчел и бабочек. Но оптимальный ISI может зависеть от протокола кондиционирования и животных видов 1. (B) Breakdown и временные параметры CS, CR, США и UR. CR, что происходит либо до США презентации или во время неармированных "тест" испытаний является зависимой мера для экспериментальных протоколов.
Рисунок 2 Запах истощение с повторным картриджей. Для этих данных, запах картриджи былинастройки с гексанола, как описано в тексте. Гексанолом обычно используется как CS в исследованиях ЗА; Тем не менее, фактическая скорость разрушения будет зависеть от запаха и растворителя. Картриджи были затем использованы только на 4 сек каждую минуту в течение 8 испытаний (при условии 5 медоносных пчел / суда в стандартном эксперименте, который будет равняться 40 применений). Разведения в указанном растворителе, которые были относительно стандарт для в экспериментах, были 2,0 М (А) и 0,2 М (В). (А, В) запаха отбирали после первого и восьмого испытаний путем адсорбции на твердой фазе микроэкстракции (ТФМЭ) волокна, которые затем десорбируется на газовом хроматографе. Относительные площади под пиками были выше после первого пробного отношению к восьмому для обоих растворителей и для обеих концентрациях (Вилкоксона подобранных пар подписали тестовый ранг р <0,05 [*] или выше), который показывает, что менее запах был доставлен из картриджа после картридж был использован несколько раз. (C, D) те же данные, показывающие только восьмое тр IAL с оси у расширенной. Это показывает, что истощение было немного больше по отношению к гексан минеральном масле, но только в более низкой концентрации.
Рисунок 3 Приобретение и тест с использованием деканаль как CS и метода 2 к кондиционирования. () Trial-на-испытательного ответ (CR) в течение 12 вперед испытаний спаривания (рисунок 1). Данные взяты из п = 20 медоносных пчел условных в четыре группы по 5 медоносных пчел в каждой. МСИ было 3 сек, а ITI было 6 мин. (В) неармированных тесты с использованием запахов, которые отличаются от деканаль по длине и / или положением карбонильной углерода углеродной цепи. Запахи были представлены в рандомизированном серии по четырем группам и перемежались с усиленными испытаний с деканаль (каждые 2:58 испытаний), чтобы избежать вымирания ЧР.
Рисунок 4 Данные мастерской, в течение которого аспирантов были обучены состояние пчел, используя по методу 1. данные (а) Приобретение от трех групп пчел условных до октанола (п = 23 и 15 для Gps 1 и 2, соответственно) и метилциклогексанон (п = 10) (B) КЛ во неармированных тестов с обеих запахов.; четыре исследования, представленные в случайных рядов по группам. (C) неармированных тесты с обеих запахов в две группы медоносных пчел, один вперед в паре (Gp 1, N = 23) и один назад в паре (п = 25).
| Срок (аббревиатура) | Определение | Соответствующий пример |
| Условного раздражителя (CS) | стимул, который вызывает мало или вообще не ответ на первый и сигнализирует США | ЗАПАХ |
| Условный рефлекс (CR) | Ответ на CS после объединения с США | Хоботок РАСПРОСТРАНЕНИЕ |
| Безусловного раздражителя (США) | Биологически значимых стимул, который вызывает ответную реакцию | САХАРОЗА / ВОДЫ РЕШЕНИЕ |
| Безусловного рефлекса (УР) | Реакция на США | Хоботок РАСПРОСТРАНЕНИЕ |
| Интер-Стимул интервал (ISI) | Время между началом и CS начала США | ЗАПАХ чтобы сахароза интервала |
| Интер-Trial интервал (ITI) | Время между последовательными CS-американских пар для одного животного | ЗАПАХ (пробная н), чтобы запах (пробная п + 1) интервал |
Таблица 1 ImВАЖН Терминология., на рисунке 1 в качестве иллюстрации этих терминов. Для PER кондиционирования CR и UR одинаковы, хотя для других типов объединений и рефлексы CR и UR могут отличаться.
Фильм 1. видео мед пчелы выполняющего PER после того, как были приучены реагировать на запах. Обратите внимание на реакцию PER пчелы примерно 1,5 сек следующую запаха начала. Отслеживание программного обеспечения отображается усиков движений в ответ на презентации запаха. Линии построенные в правом верхнем углу видео изображают фактические усиков движения. Два графика в нижней части экрана показывают усиков движений на X (слева) и Y (справа) координатах. Вертикальные линии на графике показано на видео показывают, слева направо, свет, PER, свет и хоботок опровержение.
Discussion
Этот протокол представила две надежные методы для кондиционирования, используя процедуру PER. Это два из нескольких методов, которые были успешно использованы 27, 21. У нас работают Способ 2 для всех экспериментальных исследований с использованием PER как это последовательно надежный, даже в разных экспериментаторов.
Та же базовая процедура была адаптирована для различных видов исследований с медоносных пчел, в том числе использования различных стимулов для кондиционирования и различных поведенческих рефлексов. Он также был связан с исследований генетической основе различий в обучении 28,29, физиологические корреляты обонятельной восприятия и памяти в мозге 13,14,30, и модулирующие и молекулярно-генетические основы поведения 15,16,31 . В связи с передовыми знаниями экологической значимости обонятельной обучения в медоносных пчел, который начался с первых исследованиях Карла фон Фриша более 100 лет назад
Основная процедура является мощным в том, что он может быть применен, чтобы исследовать проблемы в других видов, а также. Два вида моли, Мандука Секста и Spodoptera littoralis, были использованы в исследованиях ЗА исследовать нейронную основу идентификации запаха и обонятельных способностей 32,33 обучения каждого вида. НА эксперименты с плодовыми мушками предоставили много интересных идей в каскады молекулярных сигнальных участвующих в chemosensation и обучения 34. И PER недавно был использован для изучения привыкания в блошиный (Rhodnius prolixus) 35, важную с переносчиками болезней.
В целом, процедура является устойчивым к изменениям в способе; Использование Dметоды ifferent, скорее всего, производят такую же относительную разницу между группами лечения. Несмотря на относительно простой процедурой, несколько проблем может иногда предотвратить медоносных пчел от обучения запаха-сахароза ассоциацию. Следующие темы возможные изменения к протоколу и некоторые из наиболее распространенных проблем, которые могут возникнуть во время PER кондиционирования.
Соображения по количеству и типу испытаний в Протоколе кондиционирования
Любой протокол обучения потребует воздействие на пчел к ряду испытаний на этапе сбора данных. Это число во многом зависит от сложности задачи. Медоносные пчелы можете узнать простую задачу после одного судебного разбирательства, но они должны, по крайней мере три испытания, чтобы индуцировать образование долгосрочный накопительный. Как и ожидалось, медоносные пчелы потребует значительно больше испытаний, чтобы адекватно изучать сложную задачу. Как правило, существует максимальное число испытаний, за которым пчелы больше не существенно не улучшитьИК производительность. Этот максимум зависит от конкретной задачи, типы запахов и концентрациях, и концентрации сахарозы.
При использовании более одного типа проб с различных запахов, представить различные типы пробные в псевдослучайной последовательности держать пчел от запоминания простой последовательности запаха презентаций вместо того чтобы учиться различия между запахов 36. В этих псевдослучайных последовательностей, должно быть равное количество испытаний для каждого из типов запаха. Кроме того, вероятность того, что суда одного типа запаха предшествуют и следуют той же запахом, или любой из других запахов, должны быть равны для всех запахов. В течение двух запахов - А и В - использовать следующую последовательность: ABBABAAB. За восемь испытаний каждый запах представлена четыре раза. Объединить идентичные последовательности, чтобы достичь желаемого количества испытаний для каждого запаха.
Независимо от эксперимента, есть несколько параметров, которые должны оставатьсяКонстанта с целью оптимизации обучения. Перекрытие между CS и США имеет решающее значение для эффективного кондиционирования. Между пробная интервал (рисунок 1, таблица 1) должна быть постоянной и оптимизировать, потому что неправильность или слишком короткий или слишком длинный между пробная интервал может значительно влиять на эффективность протокола кондиционирования 1.
Соображения о важности и дизайна поведенческих испытаний тестирования
Ответы, записанные во время «этапа приобретения" эксперимента, когда CS и США представлены вместе, может быть полезно. Тем не менее, нужно учитывать, что условия запах презентаций может отличаться от одного типа суда в другой. Во время усиленных исследований, запах после чего сахарозы представлена в сочетании с визуального стимула (перемещение устройства для доставки сахарозы капли), которые могут влиять на реакцию пчелы. И пчелы имеют только три вторыхс, чтобы показать ответ (четыре секунды из запаха стимуляции минус один сек перекрытия сахарозой презентации; Рисунок 1). Если эксперимент предполагает пчел учатся различать два запахи (например, усиленный и неармированные), неармированные запах представлены на альтернативных испытаний происходит без зрительного стимула презентации награды и пчелы имеют полные четыре секунды, чтобы ответить. Таким образом, ответы на двух запахов не являются полностью сопоставимыми во время сбора. С любого протокола кондиционирования, не следует полностью полагаться на кривых приобретения 1. Чтобы лучше выяснить, что пчелы научились, ввести серию неармированных испытаний тестовых, в течение которого ни запах усиленную, которая гарантирует, что тестирование всех раздражителей происходит в одинаковых условиях.
В зависимости от конкретной цели эксперимента, тестирование может состоять из отдельных испытаний, условного запаха или серии испытаний с условной одили или сочетание условного и новых запахов. Один тест испытание условного запахом обеспечивает простой количественный анализ, помните ли пчелы 'условный запах. Тем не менее, ответ на первый тестовый суда может отражать уровень мотивации пчел, а также их отзыве условного запахом. Серии испытаний, либо серию испытаний экстинкции условного запаха или серии отдельных тестов условного и одного или нескольких новых запахов, также может быть использован для оценки памяти. Серия вымирания испытаний может оценить, насколько сильно помню пчелы 'условный ассоциацию. Чем сильнее напомним тем больше число испытаний, необходимых для тушения условного рефлекса. Серия одиночных испытаний условных и новых запахов может также оценить специфику память пчел условного запахом.
Кроме того, необходимо, чтобы состояние и проверить как контроль и обработанные группы в тех же временных точках. Comparчисле производительность пчел вскоре после кондиционирования для пчел, предназначенных для более длительных периодов времени является проблематичным вследствие воздействия сахарозы США путем подачи пчел насыщения. Например, снижение производительности после длительных интервалах может быть связано с распадом памяти или это может быть связано с изменениями в мотивационной государства и / или обучения, вызванных неармированном воздействия США, что делает результаты неоднозначны. Поэтому выступление группы лечения всегда должна оцениваться по отношению к контрольной группе условного и испытанной в тех же точках времени.
Запах Концентрация и Integrity
Есть несколько способов, в которых концентрация и целостность запахом (CS) может быть нарушена. Наиболее распространенной проблемой с доставкой запаха является истощение запаха картриджей от чрезмерного (Рисунок 2). Замена картриджей 10-12 использования (каждые 2 или 3 испытания с группами 5 медоносных пчел), чтобы избежать этой ловушки. Важно также использоватьсвежие картриджи для испытаний,, так как использованные картриджи можно по-разному, истощенные и, таким образом, представляют неравные запах раздражители. Другой распространенной проблемой является запах загрязнения картридж в связи с использованием этого картриджа в течение более одного запаха без полного его очистки. Грязный или загрязненных воздушный поток может также непреднамеренно занести дополнительную обонятельный стимул (активированный уголь фильтры могут предотвратить фонового загрязнения). Это особенно проблематично, когда муфта НА кондиционирования с измерениями физиологических ответов на запах. Дырявый запах картриджи представляют собой проблему, так как пчелы подвергаются запах до начала судебного разбирательства, что снижает важность заботы о запаха стимула. Свободной одежде подачу воздуха для доставки запаха может привести к небольшим или никаким доставки запаха, когда клапан открывается, искусственно уменьшая реакцию пчел к предполагаемому запахом.
Раствор сахарозы и безусловного раздражителя (Награда)
крепление, концентрация, и целостность раствора сахарозы, используемой как США имеют жизненно важное значение для успеха эксперимента. Кондиционер является функцией от количества и концентрации раствора сахарозы и воды, используемой в США 37. Микрометра шприцы, используемые в способе 2 позволяют очень точно (до 0,2 мкл) контролем США поставки, и мы рекомендуем использовать их для обоих методов, описанных. Использование зубочистки (метод 1) является достаточным для обстоятельств, в которых не могут быть использованы дорогие шприцы, например, в обучении больших групп студентов, работа в поле, или с более низкими бюджетами. Тщательное выполнение Способ 1 прекрасно до тех пор, как выбор времени поддерживается с регулярной замены зубочистки, чтобы избежать накопления сахарозы (и концентрацию доставлено). Тем не менее, с помощью зубочистки это более трудно точно контролировать и оценивать количество и величину США доставлено, что очень важно для кондиционирования исследований 1. Концентрация сахарозы необходимообеспечить достаточное вознаграждение, чтобы сохранить пчел мотивированы, чтобы узнать условной связи может зависеть от сложности задачи и внутреннего состояния пчел или времени года. Более сложные задачи требуют более высокой раствор сахарозы для пчел »успешно учиться задачу. CAN наращивание Mold в растворах сахарозы даже при 5 ° С, который поставит под угрозу целостность решения, влияющие на здоровье и восприятие награды пчел во время эксперимента. Лучше всего заменить решение каждые несколько дней.
Точность, Ремень, и Согласованность CS и США Доставка
Наиболее важный вопрос о надлежащей реализации процедуры PER, или в этом отношении любой процедуры кондиционирования, включает точности, времени и последовательности CS и США доставку (рисунок 1). Следователи, которые являются новыми в порядке часто являются неточными о поставке одного или обоих раздражителей. ISI?что не в состоянии обеспечить перекрытия CS и США привести к снижению производительности кондиционирования. PLC автоматизирует звуковой сигнал для экспериментатор доставить сахарозы 3 сек после начала поставки запаха. Следователи должны провести сахарный / капля воды, близкий к пчеле для быстрой доставки после сигнала. Эти процедуры помогают увлечь последовательную ISI. Размещение секундомер на арене кондиционирования обеспечивает удобное размещение времени судебного разбирательства, а также мониторинг время пчел на арене как до, так и после родов раздражителей. Таким образом, в ITI может быть относительно последовательными и вся процедура может быть запущена с контролируемой скоростью. ITI, что слишком короткие, например, менее чем 1 мин, или слишком долго может привести к снижению производительности кондиционирования 1.
Сезонные, экологические, и контекстная Воздействие на Honey Bee Performance
Производительность медоносных пчел "может быть существенным влиянием его окрестностяхкак до, так и во время кондиционирования. Часто, колебания температуры и пищевой наличии, которые приходят со сменой времен года изменит мотивацию пчел, чтобы учиться. Когда цветы цветут, мотивация пчел, чтобы узнать кондиционером объединение в лаборатории уменьшается 38. Когда колония подчеркнул - от экстремальных температур, нехватки продовольствия, или заболевания, связанных стресса - пчелы 'покажет снижение их производительности обучения внутри. Медоносные пчелы хранится в полете комнате может узнать также на некоторое время, но там тоже стресс болезни и старение ухудшение технических характеристик обучения в течение долгого времени. Контекст во кондиционирования также может снизить производительность пчел. Любые посторонние запахи, движение и другие стимулы могут отвлечь пчел из экспериментальных стимулов. Чтобы избежать этой проблемы, поддерживать разумно последовательный, упрощенную визуальный контекст.
Генотип и опыт влияет на производительность на
<р = класса "jove_content"> Honey Bee работники могут значительно отличаться по производительности на любой процедуры кондиционирования за счет целевой специализации, генотип, или других факторов окружающей среды 20. Таким образом, важно, чтобы стандартизировать, насколько это возможно, виды животных, используемых в эксперименте, с тем чтобы уменьшить между индивидуальные различия. В колонии во главе с открытого повязана королевы, а это значит, что она повязана с различными дронами, рабочие будут отличаться в отцовской генотипа. Генетический фон может привести к драматическим различиям в сенсорной отзывчивости 39 и обучения производительность 29. Использование колонии во главе с дамами инструментально осемененных спермой от отдельных дронов 28 уменьшает этот между индивидуальные различия.Протоколы, описанные выше, включает в себя способ сбора меда пчелы работников от входа в гнездо. Тем не менее, эти пчелы отличаются друг от друга по отношению к возрасту или поведенческой задачи. Они могут быть молодые (inexperienCED) или старше (более опытные) комбайны. Они могут быть молодые пчелы мед делающие первые ознакомительные полеты. Или они могут быть сторожевые пчелы. Для уменьшения изменчивости, отмечают пчел с быстрой сушки эмали или маркировочного шильдика либо по мере их появления, как взрослых (для контроля возраста) и / или, как они начинают нагула (для контроля за опыт). Тогда, спустя несколько дней, собрать отмеченные пчел для кондиционирования. Работники, которые занимаются поведения медсестер могут быть собраны из кадров внутри улья. Медсестры могут быть идентифицированы при вставке головы в расплода ячейки, чтобы кормить и ухаживать за личинки внутри.
Использование Virgin Queens или дронов для PER кондиционирования
В дополнение к рабочих пчел, девственные медоносных пчел королев и дроны могут быть легко обработаны в порядке PER для исследований, направленных на развитие генетических линий медоносных пчел, которые отличаются в изучении производительности 28. Виргинские кошки должны быть собраны вскоре после гоеу выйти из окукливания и помещают непосредственно в запретительных жгутов без обезболивания. Молодые, незрелые дроны, собранные из выводка гребень внутри колонии, как правило, не мотивированы, чтобы учиться. После того как они начали спаривания рейсы, беспилотники легко узнать PER задачи 28. Они должны быть собраны, как они возвращаются из брачного полета и поддерживается в течение ночи в маленькой клетке в колонии, используемой для выращивания маток. Не пытайтесь использовать их накануне кондиционирования; они не выживают хорошо в упряжь на ночь. Пару часов до кондиционирования беспилотники могут быть собраны из клеток и помещены в удерживающих ремней безопасности без обезболивания.
Выводы
Эта процедура PER, на пути методов, составляет отправной точкой для проектирования PER эксперименты. Большинство протоколов НА потребует, что процедура, описанная быть изменены в некотором роде для реализации конкретных целей эксперимента и Проживаниее групп несколько лечение. Это легко осуществить. Однако надлежащая реализация требует внимания к деталям и практики. После того, как освоили это может быть мощным процедура для добавления в качестве исследовательского инструмента в течение нескольких фундаментальных и прикладных научно-исследовательских программ с различными видами насекомых.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано финансирование из NIH NCRR (R01 RR014166 в BHS), NIH NIDCD (R01 DC011422 BHS со-PI), в Министерство сельского хозяйства США (J Трамбл PI; BH Смит со-PI) и Университета штата Аризона. Финансирование семинара для обучения студентов (данные на рисунке 4) была предоставлена научного общества Чили.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-1KG | |
| Odorant Compounds (for example) | |||
| 1-hexanol | Sigma-Aldrich | 471402-100ML | For additional examples |
| 2-octanone | Sigma-Aldrich | W280208-800G-K | of odorants, see any of |
| heptanol | Sigma-Aldrich | 51778-5ML | the papers on olfactory |
| gerianol | Sigma-Aldrich | 163333-25G | processing from the |
| nonanal | Sigma-Aldrich | 131210-100ML | Smith lab. |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-1L | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760-1L | Make sure it’s odorless. |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
| Scintillation vials | Sigma-Aldrich | Z190535-1PAK | Use a small drill bit to bore a small hole in the cap of the vials. |
| Bee harness | Custom-made from 0.9 cm diameter plastic soda straws or hard plastic/metal tubing. | ||
| Duct tape | |||
| Kimwipes | Sigma-Aldrich | Z188956-1PAK | |
| Wash bottles | Sigma-Aldrich | Z560847-3EA | For the 70% ethanol. |
| Dryer tubing | |||
| FOR METHOD 1 ONLY | |||
| 20 ml disposable plastic syringes | Cole-Parmer | WU-07945-18 | |
| 15 mm filter paper circles | Sigma-Aldrich | Z274844-1PAK | |
| Pushpins | |||
| Toothpicks | |||
| FOR METHOD 2 ONLY | |||
| Gilmont Micrometer syringe, 0.2 ml | Cole-Parmer | EW-07840-00 | |
| Gilmont micrometer syringe tip | Cole-Parmer | EW-07841-00 | |
| 26 G 3/8” Leur hub hypodermic needles | Fisher Scientific | 14-826-10 | |
| 1 cc tuberculin syringes (plastic/glass) | Sigma-Aldrich | Z181641-1EA OR Z192090-200EA | Glass tuberculin syringes are available, but plastic syringes are much less expensive and will work well for a limited number of uses. |
| Small rubber/silicone restrictors | Cole-Parmer | EW-95702-02 | Made from 4.8 mm outer diameter silicone tubing or the rubber tips of the 1 cc syringe plungers. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| 75 x 100 mm filter paper | Sigma-Aldrich | Z695106-500EA | |
| Direct Logic 05 Programmable Logic Controller |  Koyo Electronics Industries Co, Ltd |
||
| 1 mm, 4 mm, & 6 mm inner diameter PVC or silicone tubing | Cole-Parmer | Various | Cole-Parmer has a wide selection of suitable tubing. |
| Polypropylene connectors & leur fittings | Cole-Parmer | Various | Cole-Parmer has a wide selection of connectors and fittings for many tube sizes. |
| 65 mm Correlated Flowmeter | Cole-Parmer | EW-03216-08 | Aluminum with glass float; for liquids and gases, with valve. |
| OR | |||
| Tetra Whisper 300 (Tetratek DW96-2) Aquarium Air Pump | Aquacave |
AE-TETRA-300 | |
| LIF series Solenoid Valves for .042 " ID Tubing, Configuration "E" | The Lee Company |
LFAA1200118H | Neoprene, 430 SS, 302 SS, 280 mW |
| PC-Board 12VDC 70dB Piezo Buzzer | RadioShack |
273-074 | |
References
- Rescorla, R. A. Behavioral studies of Pavlovian conditioning. Annu Rev Neurosci. 11, 329-352 (1988).
- Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera). Journal of Comparative Psychology. 97, 107-119 (1983).
- Giurfa, M., Sandoz, J. C. Invertebrate learning and memory: Fifty years of olfactory conditioning of the proboscis extension response in honeybees. Learn Mem. 19, 54-66 (2012).
- Smith, B. H., Wright, G. A., Daly, K. S. The Biology of Floral Scents. Dudareva, N., Pichersky, E. , CRC Press. 263-295 (2006).
- Menzel, R., Giurfa, M. Dimensions of cognition in an insect, the honeybee. Behav Cogn Neurosci Rev. 5, 24-40 (2006).
- Kuwabara, M. Bildung des bedingten Reflexes von Pavlovs Typus bei der Honigbiene, Apis mellifera. Journal of the Faculty of Science, Hokkaido University, Zoology. 13, 458-464 (1957).
- Menzel, R. The honeybee as a model for understanding the basis of cognition. Nat Rev Neurosci. 13, 758-768 (2012).
- Menzel, R. Neurobiology of comparative cognition. Kesner, R. P., Olton, D. S. , Lawrence Erlbaum. 237-292 (1990).
- Hammer, M., Menzel, R. Learning and memory in the honeybee. Journal of Neuroscience. 15, 1617-1630 (1995).
- Strube-Bloss, M. F., Nawrot, M. P., Menzel, R. Mushroom body output neurons encode odor-reward associations. J Neurosci. 31, 3129-3140 (2011).
- Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in kenyon cells of the honeybee mushroom body. Front Syst Neurosci. 2, (2008).
- Fernandez, P. C., Locatelli, F. F., Person-Rennell, N., Deleo, G., Smith, B. H. Associative conditioning tunes transient dynamics of early olfactory processing. J Neurosci. 29, 10191-10202 (2009).
- Locatelli, F. F., et al. Nonassociative plasticity alters competitive interactions among mixture components in early olfactory processing. Eur J Neurosci. 37, 63-79 (2013).
- Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. Journal of Neuroscience. 23, 5370-5380 (2003).
- Mussig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. J Neurosci. 30, 7817-7825 (2010).
- Hladun, K. R., Smith, B. H., Mustard, J. A., Morton, R. R., Trumble, J. T. Selenium toxicity to honey bee (Apis mellifera L.) pollinators: effects on behaviors and survival. PLoS One. 7, e34137 (2012).
- Wiegmann, D. D., Smith, B. H. International Journal of Comparative Psychology. 22, 141-152 (2009).
- Drezner-Levy, T., Shafir, S. Parameters of variable reward distributions that affect risk sensitivity of honey bees. J Exp Biol. 210, 269-277 (2007).
- Drezner-Levy, T., Smith, B. H., Shafir, S. The effect of foraging specialization on various learning tasks in the honey bee (Apis mellifera). Behavioral Ecology & Sociobiology. 64, 135-148 (2009).
- Shafir, S., Menda, G., Smith, B. H. Caste-specific differences in risk sensitivity in honeybees, Apis mellifera. Animal Behaviour. 69, 859-868 (2005).
- Smith, B. H., Menzel, R. An analysis of variability in the feeding motor program of the honey bee; the role of learning in releasing a modal action pattern. Ethology. 82, 68-81 (1989).
- Erber, J., Pribbenow, B., Kisch, J., Faensen, D. Operant conditioning of antennal muscle activity in the honey bee (Apis mellifera L). Journal of Comparative Physiology A-Sensory Neural & Behavioral Physiology. 186, 557-565 (2000).
- Smith, B. H., Menzel, R. The use of electromyogram recordings to quantify odorant discrimination in the honey bee, Apis mellifera. Journal of Insect Physiology. 35, 369-375 (1989).
- Stopfer, M., Bhagavan, S., Smith, B. H., Laurent, G. Impaired odour discrimination on desynchronization of odour-encoding neural assemblies. Nature. 390, 70-74 (1997).
- Daly, K. C., Christensen, T. A., Lei, H., Smith, B. H., Hildebrand, J. G. Learning modulates the ensemble representations for odors in primary olfactory networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 10476-10481 (2004).
- Matsumoto, Y., Menzel, R., Sandoz, J. C., Giurfa, M. Revisiting olfactory classical conditioning of the proboscis extension response in honey bees: a step toward standardized procedures. J Neurosci Methods. 211, 159-167 (2012).
- Chandra, S. B., Hosler, J. S., Smith, B. H. Heritable variation for latent inhibition and its correlation with reversal learning in honeybees (Apis mellifera). Journal of Comparative Psychology. 114, 86-97 (2000).
- Chandra, S. B., Hunt, G. J., Cobey, S., Smith, B. H. Quantitative trait loci associated with reversal learning and latent inhibition in honeybees (Apis mellifera). Behavior Genetics. 31, 275-285 (2001).
- Hammer, M. The neural basis of associative reward learning in honeybees. Trends in Neurosciences. 20, 245-252 (1997).
- Frisch, K. The Dance Language and Orientation of Bees. , Harvard University Press. (1965).
- Daly, K. C., Smith, B. H. Associative olfactory learning in the moth Manduca sexta. J Exp Biol. 203, 2025-2038 (2000).
- Fan, R. J., Anderson, P., Hansson, B. Behavioural analysis of olfactory conditioning in the moth spodoptera littoralis (Boisd.) (Lepidoptera: noctuidae). J Exp Biol. 200. 23 (Pt 23), 2969-2976 (1997).
- Paranjpe, P., Rodrigues, V., VijayRaghavan, K., Ramaswami, M. Gustatory habituation in Drosophila relies on rutabaga (adenylate cyclase)-dependent plasticity of GABAergic inhibitory neurons. Learn Mem. 19, 627-635 (2012).
- Vinauger, C., Lallement, H., Lazzari, C. R. Learning and memory in Rhodnius prolixus: habituation and aversive operant conditioning of the proboscis extension response. J Exp Biol. 216, 892-900 (2013).
- Smith, B. H., Abramson, C. I., Tobin, T. R. Conditional withholding of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera) during discriminative punishment. Journal of Comparative Psychology. 105, 345-356 (1991).
- Smith, B. H. An analysis of blocking in odorant mixtures: an increase but not a decrease in intensity of reinforcement produces unblocking. Behav Neurosci. 111, 57-69 (1997).
- Gerber, B., et al. Honey bees transfer olfactory memories established during flower visits to a proboscis extension paradigm in the laboratory. Animal Behaviour. 52, 1079-1085 (1996).
- Rueppell, O., et al. The genetic architecture of sucrose responsiveness in the honeybee (Apis mellifera L). Genetics. 172, 243-251 (2006).
