Abstract
Insekter ændre deres svar på stimuli gennem erfaring for at knytte disse stimuli med begivenheder er vigtige for overlevelse (f.eks, mad, hjælpere, trusler). Der er flere adfærdsmæssige mekanismer, hvorigennem et insekt lærer fremtrædende foreninger og relaterer dem til disse begivenheder. Det er vigtigt at forstå denne adfærdsmæssige plasticitet til programmer, der sigter mod at hjælpe insekter, der er til gavn for landbruget. Denne forståelse kan også bruges til at opdage løsninger på biomedicinske og landbrugsmæssige problemer skabt af insekter, der fungerer som sygdomsvektorer og skadedyr. Snabel Extension Response (PER) konditionering protokol blev udviklet til honningbier (Apis mellifera) mere end 50 år siden for at studere, hvordan de opfatter og lære om blomstermotiver lugte, der signalerer nektar og pollen ressourcer En koloni behov for at overleve. PER procedure giver en robust og let at ansætte rammer for at studere flere forskellige økologisk relevant mechamer af adfærdsmæssige plasticitet. Det er let at tilpasse til brug sammen med flere andre insektarter og andre adfærdsmæssige reflekser. Disse protokoller kan let anvendes i forbindelse med forskellige midler til overvågning af neurale aktivitet i CNS via elektrofysiologiske eller bioimaging eller til at manipulere målrettede neuromodulatory veje. Det er en robust analyse til hurtigt at indikere subletale effekter på adfærd forårsaget af miljømæssige stressfaktorer, toksiner eller pesticider.
Vi viser, hvordan PER protokol er let at gennemføre ved hjælp af to procedurer. Den ene er velegnet som et laboratorium øvelse for studerende eller for hurtige analyser af effekten af en eksperimentel behandling. Den anden giver en mere grundig kontrol af variable, hvilket er vigtigt for studier af adfærdsmæssige condition. Vi viser, hvordan flere foranstaltninger for adfærdsmæssig reaktion spænder fra binære ja / nej til mere kontinuerlig variabel ligesom ventetid og varigheden af snabel forlængerrør kan anvendes til at teste Hypothesesek. Og vi diskutere nogle faldgruber, som forskere ofte støder på, når de bruger proceduren for første gang.
Introduction
Mange insekter lærer om økologisk relevante stimuli, og de derefter ændre deres adfærdsmæssige reaktioner på disse stimuli med henblik på at tilpasse sig nye forudsigende relationer i deres miljø. Flere forskellige mekanismer kan ligge til grund for denne adfærdsmæssige plasticitet (f.eks nonassociative, associativ / Pavlov, og operant / instrumental 1). Disse typer af plasticitet forskellige i, hvordan de stimuli, eller adfærd er forbundet med vigtige begivenheder, såsom forekomsten af mad, en kammerat, eller fare. Forståelsen af disse former for plasticitet er meget vigtigt for grundlæggende forskning i, hvordan nervesystemet ændrer at indkode nye erindringer 2. Det er også vigtigt for at forstå de adaptive adfærd af insekter, der er vigtige vektorer for sygdomme (f.eks tsetse og myg) og insekter, der er landbrugsmæssigt vigtigt, enten i den vegetabilske produktion (honningbier) eller som skadedyr.
Studere adfærdsmæssige plasticitet i nogen animal kræver et niveau af eksperimentel kontrol over en række variabler, der ikke kan opnås inden 1. Det kræver udvikling af en robust konditionering protokol, som kan anvendes under mere kontrollerede forhold, men som stadig er relevante for opførsel under naturlige forhold. Honningbien (Apis mellifera) er en fremragende model for, hvordan man kan udvikle en protokol til at udføre kontrollerede analyser af adfærdsmæssige plasticitet 3,4. Snabel Extension Response (PER) i honningbier er en naturlig adfærdsmæssig refleks, hvor honningbien udvider sine snabel reaktion på antennal stimulering med en sukkeropløsning. Under normal fourageringsadfærd, PER opstår, når honningbien finder nektar i en blomst. Heldigvis vil honningbier let udviser denne enkle og let kvantificerbare adfærd i laboratoriet. Dette gør det muligt at studere, i en kontrolleret indstilling, de mekanismer, der påvirker dette økologisk relevant adfærd 5. PER CAn også anvendes inden for en konditionering protokol til at undersøge stimulus perception og indlæring og hukommelse under forskellige behandlingsbetingelser, som er designet til at afsløre de adfærdsmæssige og neurale mekanismer, der ligger til grund for plasticitet 6.
Siden de første undersøgelser foretaget Kuwabara 7 har Per condition været meget anvendt til at afsløre nonassociative, associativ og operant mekanismer, der ligger til grund for adfærdsmæssige plasticitet i honningbier 8. Disse mekanismer er identiske med dem afsløret i studier af frit flyvende honningbier 9. I modsætning til studier af frit flyvende honningbier kan PER conditioning protokoller kobles med elektrofysiologi 10,11 eller live-cell fluorescensimagografi 12-14 af hjernen. Desuden PER protokoller mulighed for eksperimentel manipulation af nervebanerne via farmakologiske eller molekylærgenetiske behandlinger for at afprøve hypoteser om roller specifikke dele af nettet, såsom NEURomodulators 15,16. PER protokoller har også givet en vigtig måde at evaluere de subletale virkninger af miljømæssige forhold samt toksiner om sundhed og fouragering effektiviteten af honningbier 17.
Denne procedure beskriver to lugt levering metoder parallelt. Metode 1 er en version af lugt og ubetinget stimulus (saccharose) levering, der giver en billig og teknisk enkel metode til at præsentere lugt og saccharose belønning. Denne metode er god til grundlæggende uddannelse og hvornår automatisering er ikke mulig. Det er en glimrende måde at introducere denne teknik til et klasseværelse eller undervisning laboratorium. Under condition til forsøg med mere vanskelige opgaver, og koblede fysiologiske vurderinger af lugt perception, læring, eller hukommelse, er det meget vigtigt præcist og præcist regulere debut, varighed levering timingen af stimuli. For den mest pålidelige stimulus levering, skal du bruge et middel til at automatisere lugt levering ennd en præcis metode til belønning levering. Metode 2 beskæftiger automatiseret lugt levering og mere præcis saccharose levering. Det er teknisk mere avanceret og kræver mere for den indledende opsætning end metode 1, men det øger sammenhængen i timingen og mængden af stimuli, der bruges til konditionering og bør så vidt muligt anvendes.
Protocol
1. Lugt (betinget stimulus) Cartridge opsætning
- I begyndelsen af forsøget, sætte flere lugt patroner til alle de forskellige lugte, der er nødvendige til konditionering forsøg.
- Benyt en emhætte for lugt fortynding og forberedelse lugt patron. Aldrig åbne flasker af lugte uden for denne stinkskab, da lugt vil sprede sig hurtigt i hele laboratoriet og potentielt udsætter de honningbier til lugt før condition. , Slid også handsker, når du installerer lugt patroner og vaskes grundigt bagefter at undgå at udsætte honningbier for lugte, mens du håndterer dem.
- Sørg for, at hver lugt patron er tydeligt mærket med en farvekodet etiket af lugten, for hvilke det første er brugt. Brug aldrig lugt patron (sprøjtecylinder eller stempel) i mere end én lugt, da der kan være resterende lugt på patronen.
- Forberedelse Lugte og lugt Blandinger
- Fortynd lugte i enten hexan eller mineralsk olie til desired koncentration.
BEMÆRK: Ændring af koncentrationen af lugt eller præsentere blandinger af to eller flere lugtstoffer kan give mulighed for undersøgelse af yderligere aspekter af, hvordan bier fornemme lugte og lære den betingede foreningen. Lugt blandinger kan være så simpelt som et 50:50 binær blanding eller så komplekst som flere lugte, der efterligner naturlige olfaktoriske stimuli. Reduktion af koncentrationen af lugt øger også vanskelig opgave.- Lugte bliver forarmet med genbrug af patronen (figur 2). For at undgå problemer fra udtynding gør nok patroner til at kunne skifte til en ny patron hver 10-12 bruger.
- Fortynd lugte i enten hexan eller mineralsk olie til desired koncentration.
- Forberedelse Lugt Patroner
- Metode 1
- Til denne metode, bruger 20 ml plast sprøjter med en cirkel med en diameter på filterpapiret 15 mm fastgjort til gummi ende af stemplet for duft patroner.
- Fjern stemplet fra sprøjten og bruge en kortnål at fastgøre stykke filter papir til enden af stemplet.
- Brug en mikropipette til at placere 10 ul af lugt på filtrerpapiret, og sæt stemplet i sprøjtecylinderen. Tryk stemplet til 15 ml-mærket på sprøjten tønde.
- Metode 2
- Til denne metode, skal du bruge 1 cc glas eller plastik tuberkulin sprøjter (eller modificerede pipetter af lignende volumen og form) med en strimmel af filtrerpapir inde og en gummi eller silikone begrænseren i den brede ende af sprøjtecylinderen for lugt patroner.
- Fjern stemplet fra en 1 cc tuberculinsprøjte tønde. Sprøjtecylinderen bliver kroppen af lugt patronen.
- Fjern den sorte gummi tip fra sprøjtens stempel og afbrød den lukkede ende af gummi spids.
Bemærk: Denne gummiring vil fungere som en begrænser til at reducere sugning fra luftstrømmen i arenaen, der tidligt vil trække lugt ud af patronen og over behersket honningbien. Alternativt silikoneslange (4,8 mm outer diameter) skåret i 5 mm sektioner arbejde som restrictors.
- Skyl indersiden af sprøjtecylinderen og gummi / silikone begrænseren med 70% ethanol (for at fjerne meget af den resterende lugt fra tidligere anvendelse) og lad dem lufttørre.
- Placer en 0,2 x 4 cm strimmel af filtrerpapir i bred åbning af tønden, så papiret strækker 1-2 cm ud over åbningen.
- Brug en mikropipette til at placere 3-10 pi af lugten på filtrerpapiret uden at lade lugt rører enden af sprøjtecylinderen. Pipettespidsen kan genanvendes til samme lugt, men sørg for at bruge en frisk spids til at oprette den næste lugt.
- Drej bred åbning af sprøjtecylinderen opad, så filtrerpapiret glider hurtigt ind i røret. Indsæt begrænseren i den brede åbning af sprøjtecylinderen.
- Sørg for, at hver lugt patron er tydeligt mærket med en farvekodet etiket af lugten er det første bruges til. Brug aldrig lugt patron (sprøjtecylinderen eller restrictor) for mere end en lugt, da der kan være resterende lugt på det.
- Ball op slutningen af en fnug-fri væv, suge det med 70% ethanol, og bruge det til aftør den ydre overflade af patronen for at fjerne eventuel resterende lugt på ydersiden af patronen.
- Metode 1
2. Udtagning, fastholdelse, og fodring af bier
- Forberedelse Bee Fastholdende Seler
- Lave enkle fastholdende seler for honningbier ud af plast soda strå, hård plast slanger, eller bearbejdes metalrør (alle er cirka 0,9 cm indvendig diameter og har 1-2 mm vægtykkelse). Brug robuste seler til procedurer, der involverer kirurgi.
- Skær 3 cm afsnit af slangen. Derefter delvis trimme væk cirka halvdelen af de øverste 1 cm selen for at gøre det lettere at holde bi på plads, medens fastgørelse af selen.
- Skær en 0,2 x 6 cm strimmel af gaffatape og vedhæfte den ene ende til den ene side af bi seletøj, leaVING den anden ende fri.
- Indsamling bier
- Saml arbejdstagere fra indgangen til kolonien, da de pause før flyafgang fra kolonien eller som de vender tilbage fra at søge føde.
BEMÆRK: Placering af et stykke trådnet, med huller lige stor nok til bier at kravle igennem, over indgangen forsinker de regnskabsførende arbejdere ned, og gør det lettere at fange dem, før de kommer ind i kolonien. - Placer et scintillationshætteglas over bi indtil den flyver op i det. Hold hætteglasset med åbningen vandret eller nedad, mens låget er fastgjort, så den bi ikke flyve op ud af hætteglasset. Anbring kun ét bi i hvert hætteglas. Sørg for, at låget har et hul i det for at give mulighed for tilstrækkelig gasudveksling.
- Saml bierne hurtigt at minimere den tid, de tilbringer i hætteglassene. Opbevar hætteglassene med bier i dem i en lille boks i skyggen.
- Overfør boks med hætteglas og bier til laboratoriet, og placere hætteglas i et is-vand slUrry indtil bierne stopper med at bevæge. Når en bi er ubevægelig Tag hætteglasset fra isen øjeblikkeligt for at undgå overeksponering for kulde, og placer bi i en fastholdende sele.
BEMÆRK: Vi anbefaler ikke at placere bierne i køleskabet eller fryseren, da det er vanskeligt at overvåge, når bierne bliver immobile, hvilket resulterer i overdreven udsættelse for kulde. Ved at udnytte mere end 10 bier overfører kun få bier til is-vand-opslæmning ad gangen.
- Saml arbejdstagere fra indgangen til kolonien, da de pause før flyafgang fra kolonien eller som de vender tilbage fra at søge føde.
- Fastholdende Bier
- Placer bi selen med dorsale thorax overfor udskårne del af slangen og hovedet lige over toppen af slangen. Tryk forsigtigt bi tæt på slangen så sine munddele rage ud over kanten på slangen. Skub strimmel af tape i mellem hovedet og brystkasse på den dorsale side af bi og fast lægger den frie ende til siden af selen.
- Sørg for, at båndet på selen er glat og stram. Der bør ikke være anmeldtceable huller mellem forsiden af bi selen og båndet, og båndet skal ligge fladt på toppen af selen. Hvis der er huller bien måske ikke være i stand til at udvide sine snabel korrekt, eller det kan undslippe. Sørg også for, biens forreste ben ikke stikker ud mellem forsiden af selen og gaffatape.
- Placer bi selen med dorsale thorax overfor udskårne del af slangen og hovedet lige over toppen af slangen. Tryk forsigtigt bi tæt på slangen så sine munddele rage ud over kanten på slangen. Skub strimmel af tape i mellem hovedet og brystkasse på den dorsale side af bi og fast lægger den frie ende til siden af selen.
- Fodring af bier og fodring af Conditioning Interval
- Omkring 30 minutter efter udnyttelse - efter bierne har genvundet fra den oprindelige opsætning - fodre bierne 3-4 pi 0,5 M saccharose (i vand). Dette beløb vil være tilstrækkeligt til en fodring-til-conditioning interval på 3-4 timer.
- I almindelighed, fodre 1 pi 0,5 M saccharose til cirka hver time ventetiden mellem fodring og konditionering at sikre bierne overlever intervallet endnu er sultne nok i begyndelsen af conditioning for at være motiveret til at lære den betingede foreningen. I et laboratorium holdes ved en varm temperatur, eller hvis usynge en anden koncentration af saccharose, justere fodret beløb eller tidsintervallet i overensstemmelse hermed.
BEMÆRK: Med en fodring konditionering interval på 24 timer, så sørg for alle bierne fodres til mættelse med 0,5 eller 1 M sucrose i mindst 24 timer før konditionering vil begynde. Ved stuetemperatur bier kræver cirka 24 timer, før de er motiveret nok til at reagere godt i en konditionering protokol.
BEMÆRK: Brug en lavere koncentration af saccharose løsning til tilførsel af bier end den koncentration, der anvendes som en belønning under konditioneringen for at forhindre bierne bliver mindre følsomme over for koncentrationen af saccharose anvendes under konditionering, hvilket kan reducere indlæring 18. - Feed bierne i et område langt væk fra træningsområdet. Eksponering for ubetinget stimulus (saccharose) konditionering sammenhæng før konditionering kunne påvirke efterfølgende konditionering til lugt.
- I almindelighed, fodre 1 pi 0,5 M saccharose til cirka hver time ventetiden mellem fodring og konditionering at sikre bierne overlever intervallet endnu er sultne nok i begyndelsen af conditioning for at være motiveret til at lære den betingede foreningen. I et laboratorium holdes ved en varm temperatur, eller hvis usynge en anden koncentration af saccharose, justere fodret beløb eller tidsintervallet i overensstemmelse hermed.
- I intervallet mellem fodring og conditioning placere bierne på køkkenbordet i et roligt område i laboratoriet for at undgå unødvendige forstyrrelser. Hvis laboratoriet har lav luftfugtighed, placere bier i en plastikbeholder med våde papirhåndklæder under tidsinterval. Dette forhindrer udtørring, eftersom bierne kan dø, hvis de udsættes for lav fugtighed i længere tidsperioder.
BEMÆRK: Du må ikke ændre beherske og fodring protokol inden et eksperiment! Brug kun én bestemt tidsinterval mellem etablering og fodring af bier og begynder condition for hvert forsøg, så bierne alle behandles på nøjagtig samme måde.
- Omkring 30 minutter efter udnyttelse - efter bierne har genvundet fra den oprindelige opsætning - fodre bierne 3-4 pi 0,5 M saccharose (i vand). Dette beløb vil være tilstrækkeligt til en fodring-til-conditioning interval på 3-4 timer.
3. Conditioning
- Testning for Saccharose Følsomhed
- Et par minutter før de påbegynder condition, teste biernes motivation til at brødføde ved at røre deres antenner med en lille dråbe af 0,5 M saccharoseopløsning (den samme koncentration anvendes under fodring). Må ikke tillade dem at fodre under denne test. Hvis de reagerer ved extende deres snabel, er de sandsynligvis tilstrækkelig motiveret til at lære og kan bruges til protokollen.
- Eksperiment Design
BEMÆRK: Denne protokol kan ændres til at passe til en bred vifte af læring protokoller med henblik på at undersøge mange aspekter af honningbier 'indlæring og hukommelse kapaciteter. Blandt de mange parametre, der kan justeres, er: Inter-retssagen interval, antal bier uddannet på et givet tidspunkt, inter-stimulus interval, type og koncentration og antallet af lugte, type og koncentration af det ubetinget stimulus, antallet og rækkefølgen forsøg (figur 1, tabel 1) 19-21. Ved udformningen af præcise protokol for hver konditionering retssag, er det meget vigtigt at holde den inter-retssagen interval konsistent på tværs af individer. En mellemstatslig retssag interval, der er for kort, for lang eller usammenhængende vil forringe biernes præstationer. Se diskussionen for en fuld behandling af dette emne.
BEMÆRK: Bees vil lære opgaven hurtigere, hvis de er i et varmt miljø. Derfor holde temperaturen af uddannelsen miljø konsekvent og varm (29-30 ° C, hvis det er muligt). - Indfrielse af lugt (betinget stimulus)
- Metode 1
- Opsætning af Lugt Delivery System
- Monter plast 20 ml sprøjte fyldt med lugt-behandlede filtrerpapir, så det er stabilt og den lille ende vender direkte på biens antenner. Sæt stemplet på 15 ml mærket og placer sprøjten, så stemplet er let tilgængelig.
- Præsentation lugten Stimulus
- Ved begyndelsen af hvert forsøg, skal du placere bi i selen på pind i konditionering arena med dets antenner pegede direkte mod lugt patron. Lad bi akklimatisere sig til skueplads for 15-25 sekunder før du begynder lugt stimulus for at mindske forstyrrelser forårsaget af den pludselige ændring i sin visuelle omgivelser under lugt stimulus.
- Hvis bi begynder at reagere på lugt patronen umiddelbart efter den er placeret i konditionering arena, kan der være lugt på patronen tip. Fjern kontaminerende lugt ved at vaske patronen med en fnugfri serviet vædet i 70% ethanol. Hvis det ikke løser problemet, skal du udskifte patronen.
- Tryk på sprøjtens stempel ved en konstant hastighed, så stemplet er helt trykket inden 4 sek. Overvåg biens reaktion på lugt før præsentere ubetinget stimulus.
- Efter hvert forsøg, tillader bien til at hvile i konditionering arena for en anden 15-25 sek. Flytning af bi for tidligt efter retssagen vil reducere effektiviteten af hver konditionering retssag.
- Ved begyndelsen af hvert forsøg, skal du placere bi i selen på pind i konditionering arena med dets antenner pegede direkte mod lugt patron. Lad bi akklimatisere sig til skueplads for 15-25 sekunder før du begynder lugt stimulus for at mindske forstyrrelser forårsaget af den pludselige ændring i sin visuelle omgivelser under lugt stimulus.
- Opsætning af Lugt Delivery System
- Metode 2
- Opsætning af Lugt Delivery System
- Airflow Kilde og Flow Rate
- Som kilde luftstrøm for lugt leveringbruge et akvarium belufter pumpe eller en lab bænk trykluft forsyning, hvis laboratoriet er udstyret med det.
BEMÆRK: En typisk akvarium perlator pumpe vil have en luftmængde nær 400 ml / min (7 ml / sek); over 4 sek lugt stimulus, vil 28 ml luft strømme gennem en 1 ml patron. - Brug en flowmåler på linje med slangen af luft levering apparat til at regulere hastigheden af flow for luftforsyningen. Juster flowmåleren indtil vandføringen er 400 ml / min. Kontrollér flowet ved åbningen af lugten patron med en separat flowmåler.
- Slut luftstrømmen til lugt patron gennem et system af plastrør og ventiler.
BEMÆRK: tidtagningsanordning diskuteret nedenfor åbner ventilerne på et passende tidspunkt i forsøget. Plastkonnektorer vedhæfte luftstrømmen system lugt patronen gennem en Luer typen tilknytning til patronens sprøjtecylinderen. - Uanset luftstrømmen kilde, kontrollere flowet regelmæssigt at make, at linjen er intakt og strømningshastigheden holdes på den ønskede hastighed.
- Som kilde luftstrøm for lugt leveringbruge et akvarium belufter pumpe eller en lab bænk trykluft forsyning, hvis laboratoriet er udstyret med det.
- Airflow Kilde og Flow Rate
- Automatiseret Lugt Levering
- Brug en programmerbar logisk styreenhed (PLC) til at automatisere levering af lugt.
BEMÆRK: PLC'en er programmeret til at åbne ventiler til lugt levering luftstrøm 6 sek efter indledningen af den program (ved at trykke på en knap), holde ventilerne åbne i 4 sekunder, og lyder en hørbar fodring signal via en lille højttaler, 3 sek efter lugt stimulus indtræden at signalere forsøgslederen til at levere saccharose. - Brug en lille lysdiode til at angive tidspunktet for lugt stimulus under hvert forsøg. Hvis det er muligt at bruge en rød LED, da biernes fotoreceptorer forskydes væk fra længere [red] bølgelængder og mod kortere [uv] bølgelængder, så de ikke kan se det godt. Placer LED bag og under bi, uden for deres synsfelt, så lyset ikke bliver en utilsigtet betinget stimulus.
BEMÆRK: Light hjælper også kontrollere, at PLC'en fungerer korrekt, og er nyttig til at analysere videooptagelser af biernes svar under test forsøg.
- Brug en programmerbar logisk styreenhed (PLC) til at automatisere levering af lugt.
- Udstødningssystemet
- Oprette et udstødningssystem bag bien til at hjælpe med at trække luften forbi bi og at evakuere lugt-laden luft fra konditioneringen arena til at opretholde en diskret tidsramme for hver præsentation af lugten.
BEMÆRK: Hvis der er et vakuum-system i laboratoriet, ændre vakuum-port og vedhæfte en ledning af tørretumbler slange til at give den luftgennemstrømning, der kræves for at evakuere konditionering arena. Hvis der ikke er et vakuum-system, en lille elektrisk ventilator anbragt i overensstemmelse med tørretumbler slange førte til et stinkskab eller gennem et vindue vil være tilstrækkeligt.
- Oprette et udstødningssystem bag bien til at hjælpe med at trække luften forbi bi og at evakuere lugt-laden luft fra konditioneringen arena til at opretholde en diskret tidsramme for hver præsentation af lugten.
- Ved begyndelsen af hver dag, skal du kontrollere de elektriske og flyforbindelser af lugt delivery system og udstødningssystem. Tryk på startknappen på lugt delivery system og spore tiden mellem at trykke påknappen, og når ventilerne åben (en stille klik, og LED-lys tændes), og når cue til at præsentere den ubetinget stimulus (en hørbar tone) lyder. Kontrollér luft levering ved at placere en fugtig fingerspids foran stikket, der vil blive knyttet til den lugt patron. Der bør være en stærk luftstrøm, når ventilerne er åbne. Kontroller udstødningssystemet ved at holde en fnugfri væv op til åbningen af udstødningssystemet for at sikre, at luftstrømmen er stærk nok til at kunne evakuere luften fra conditioning arena.
- Opsætning af Lugt Delivery System
- Montering af Lugt Cartridge
- Placer nogle modellervoks enten på køkkenbordet eller på en lille plexiglas står til at placere bi og lugt patron direkte foran udstødningssystemet. Placer glasset lugt sprøjten i ler og tilpasse det, så åbningen i den brede ende er rettet mod biens hoved. Den ende af sprøjten skal være 1-2 cm fra bi. Vælg en afstand inden for dette område og være konstant.
- Sikker placere montering forbinder patronen til luftslangen og ventilsystem over smal slebet glas ende af sprøjten.
- Præsentation lugten Stimulus
- Ved begyndelsen af hvert forsøg, skal du placere den spændte bi på den pind i konditionering arena med dets antenner pegede direkte mod lugt patron. Lad bi hvile i arenaen for 15-25 sekunder før du begynder lugt incitament til at gøre det muligt at vænne sig til sine nye omgivelser.
BEMÆRK: Hvis bi begynder at reagere på lugten patronen straks efter at blive placeret i konditionering arena, kan der være lugt på patronen tip. Fjern kontaminerende lugt ved at vaske patronen med en fnugfri serviet vædet i 70% ethanol. Hvis det ikke løser problemet, skal du udskifte patronen. - Tryk på knappen Start for at indlede timing mekanisme til lugt levering. Overvåg biens reaktion på lugt efter stimulusindtræden og inden forelæggelsen af ubetinget stimulus.
- Efter hvert forsøg, tillader bien til at hvile i konditionering arena for en anden 15-25 sek at tillade indledende hukommelse dannelse. Flytning af bi for tidligt efter retssagen vil reducere effektiviteten af hver konditionering retssag.
- Ved begyndelsen af hvert forsøg, skal du placere den spændte bi på den pind i konditionering arena med dets antenner pegede direkte mod lugt patron. Lad bi hvile i arenaen for 15-25 sekunder før du begynder lugt incitament til at gøre det muligt at vænne sig til sine nye omgivelser.
- Metode 1
- Indfrielse af Saccharose (ubetinget stimulus)
- Metode 1
- Til denne metode, skal du bruge en tandstik til at levere saccharose.
BEMÆRK: Det er bedst at bruge en plastik tandstikker, da træ tandstikkere kan have en lugt, der vil påvirke biernes reaktioner på betinget stimulus. - Dyp spidsen af tandstikker i rørsukkeropløsningen, og, når det er tid til at præsentere den ubetinget stimulus, holde tandstikker foran bi og lade bi at slikke saccharose fra tandstikker ca. 1 sek.
- Udskift tandstikker regelmæssigt for at undgå ophobning af suCrose.
- Til denne metode, skal du bruge en tandstik til at levere saccharose.
- Metode 2
- Saccharose Delivery System
BEMÆRK: En mere præcis måde at levere den ubetinget stimulus er gennem brug af mikrometer sprøjter, som nøjagtigt kan levere små mængder (tiendedele af en mikroliter) af saccharose belønning.- Sno mikrometer af sprøjten så langt tilbage som muligt. Indlæse mikrometer sprøjtecylinder med rørsukkeropløsningen. Sørg for, at der ikke er bobler i glasset del og samle sprøjten. Fyld navet af nålen med rørsukkeropløsningen før det placeres på den smalle ende af sprøjtecylinderen. For at sikre at væsken i nålen er faktisk saccharose og ikke vand fra vask af nålen, spænd mikrometer fremad 1-2 pi, før du begynder eksperimentet.
- Saccharose Delivery System
- Saccharose Præsentation
- Hold spidsen af nålen ca. 2 cm fra bi mens lugt præsenteres. Brug kanten af uddannelsen arena for at forhindreryste sprøjten som bevægelsen kan distrahere bi. Må ikke få nålen for tæt i forventning om fodring signal, da dette også vil tidligt skifte biens opmærksomhed fra lugt til saccharose.
- Så snart fodring lyder, lige rører antenner indtil bien udvider sine snabel, så fodre bi. Dette bør kun kræver en meget let berøring eller to til antenner.
- Brug en belønning beløb mellem 0,2 og 0,8 gl. Bien bør let forbruge hele dråben inden for det tidsrum afsat til ubetinget stimulus (~ 1-2 sek). Brug ikke "ad libitum" fodring fra en stor dråbe, som bien feeds på flere sekunder, men kan ikke helt forbruge.
- Hold øje med saccharose bygge op på antennen, hvilket vil reducere biens reaktion på de efterfølgende præsentationer af belønning. Ændre proceduren fodring hvis dette sker.
- For at sikre en nøjagtig parring af lugtcue og saccharose belønning, så sørg for at præsentere den lille dråbe af saccharose løsning på bi snarest muligt efter tonen.
BEMÆRK: Timing mellem forekomst af CS (lugt) og USA (saccharose) er kritisk. Ideelt set bør lugt præsentation og præsentation saccharose kortvarigt overlapper hinanden. Hvis mere end et par sekunder gå mellem afslutningen af CS og levering af USA vil condition ydeevne formindskes.
- Metode 1
4. Test
- Efter konditionering brug uarmerede testforsøg at vurdere, hvor godt bierne lærte og / eller huske den betingede foreningen.
Bemærk: Se diskussionen om en detaljeret redegørelse for betydningen af at analysere biernes svar på uarmerede testforsøg i tillæg til biernes resultater i de conditioning forsøg, og en forklaring af formålet med antallet af test forsøg og test lugte. - Konsolidering Tid
- Eftercondition, enten administrere en umiddelbar test forsøg eller tillade bierne til at hvile gennem en konsolidering periode.
BEMÆRK: Længden af konsolideringen periode, tidsintervallet mellem konditionering og prøvning vil afhænge af formålet med eksperimentet. Hvis formålet er at undersøge forskelle læring eller korttidshukommelse, kan biernes ydeevne på testforsøg evalueres umiddelbart efter eller flere timer efter condition. Hvis forsøget indebærer undersøger langtidshukommelsen, bør prøver, gives mindst 24 timer efter afslutningen af condition. - Hvis testen forsøg er mere end 24 timer efter konditionering, fodre bierne til mættelse med 0,5 M sucrose efter konditionering og mindst en gang om dagen bagefter indtil 12-24 timer før test forsøg.
- For at sikre bierne har nået mæthed, fodre hver af dem flere forskellige tidspunkter, indtil de ikke længere udvide deres snabel som reaktion på at røre deres antenneE med saccharose. De kan forbruge så meget som 40 pi at nå mæthed.
- Hold bierne i en fugtig beholder for at forhindre deres udtørrende og dø under konsolideringen periode.
- Eftercondition, enten administrere en umiddelbar test forsøg eller tillade bierne til at hvile gennem en konsolidering periode.
- Testforsøg
- Brug kun frisklavet lugt patroner til test.
BEMÆRK: De patroner, der bruges til anskaffelse kan være forskelligt udtømt, så testen stimulus ikke vil være konsistent på tværs af studier, lugte, og de enkelte bier og dermed i væsentlig grad kan påvirke konsistensen og robusthed af resultaterne. - Under testen opretholde den samme inter-trial interval, og andre parametre, som anvendes i konditioneringen fase af forsøget.
- Må ikke præsentere den ubetinget stimulus under testforsøg, da tilstedeværelsen af en belønning vil ændre biernes reaktion på betinget stimulus, potentielt maskering mere subtile effekter af konditionering protokollen eller en behandling.
- Optag videoer af alle of test forsøg at være i stand til senere at måle forskellige aspekter biernes reaktioner på lugt (r).
- Brug kun frisklavet lugt patroner til test.
5. Optagelse biernes Svar
- Binary (Presence / Fravær) Scoring af PER
- Brug et binært pointsystem af PER under konditioneringen forsøg og under test forsøg. Score reaktioner som enten positiv eller negativ; dette er tilfredsstillende for mange slags analyser med en prøvestørrelse på 20-40 bier pr behandlingsgruppe. Den præcise topologi af svarene kan være indviklede 22. Det er vigtigt at etablere en let at se og score kriterium for et positivt svar.
- Score en bi svar som positive (+), når bi udvider sine snabel ud over den linje, der forbinder spidserne af de åbnede mandiblerne. Kun score et positivt svar, når bi udvider sin snabel efter lugt debut, men før lugt offset.
- Score en bi svar som negativ (-), når der ikke er eXtension af snabel under retssagen, eller hvis snabel forlænges efter forskydningen af lugtstof.
- Undlad at prøve at score delvis respons. For at gøre finere sondringer i biernes adfærd, skal du bruge video-analyse teknik beskrevet nedenfor.
- Brug et binært pointsystem af PER under konditioneringen forsøg og under test forsøg. Score reaktioner som enten positiv eller negativ; dette er tilfredsstillende for mange slags analyser med en prøvestørrelse på 20-40 bier pr behandlingsgruppe. Den præcise topologi af svarene kan være indviklede 22. Det er vigtigt at etablere en let at se og score kriterium for et positivt svar.
- Video Analyse af ekstra per Målinger (Movie 1)
- Indhente yderligere oplysninger fra adfærd test ved at analysere videoer af en bi svar til en lugt.
BEMÆRK: Disse målinger kan også give en højere tidsmæssig opløsning til undersøgelse af biernes svar på de lugte, især når der ikke er en forskel i tilstedeværelse / fravær scoring af PER mellem behandlingsgrupper. - Optagelse af videoer
- Brug altid uarmerede prøveemner eller ophører forsøg for videooptagelser. Tilstedeværelsen af belønning vil ændre biernes reaktion på lugt, ændre varigheden af snabel forlængelse.
- Indstil et videokamera på en trefod over uddannelsen arena og fokusere kameraet på forsiden af biens hoved, så antennerne og snabel er i skarp fokus.
- Placer små LED lys, hvilket indikerer lugt stimulus præsentation, i et område bag bi, der er synlig i videoen, for at bruge det til at identificere lugt debut og offset under analysen.
- Begynde at optage 20 sek før lugt debut og fortsætte med at indspille i mindst 20 sekunder, efter at lugt offset før forstyrre bi.
- Video Analyse
- Upload videoer i video redigeringssoftware, som iMovie og Final Cut Pro, med evnen til at måle tidsintervaller mellem specifikke rammer i videoen.
- Analyser biernes reaktion odor en diskret tid, der begynder ved starten af lugt stimulus (fx 10 eller 20 sekunder).
- Brug følgende generelle målinger til evaluering PER:
- Målvarighed snabel forlængelse, som er den samlede tid, at snabel strækker sig ud over underkæben-til-underkæbe linje (beskrevet ovenfor).
BEMÆRK: En bi kan udvide og trække sine snabel flere gange i løbet af 10-20 sek tid vindue. Mål hver snabel forlængelse individuelt, og beregne den samlede varighed. Analyse af antallet og varigheden af hver enkelt snabel forlængelse kan også give værdifulde oplysninger. - Måle latenstiden for snabel forlængelse, som er tiden mellem lugt debut, hvor LED-indikatoren tændes, og den første snabel forlængelse.
- Tæl og tid Glossal udvidelser i forhold til starten af lugtstof, den første udvidelse eller andre timing parametre.
- Spor Antennal bevægelser 23, der også viser karakteristiske lugt-orienterede ændringer.
BEMÆRK: I Movie 1, de antennal bevægelser er blevet sporet med video tracking software til at illustrere ændringen i antennal bevægelser in reaktion på en lugt stimulus.
- Målvarighed snabel forlængelse, som er den samlede tid, at snabel strækker sig ud over underkæben-til-underkæbe linje (beskrevet ovenfor).
- Indhente yderligere oplysninger fra adfærd test ved at analysere videoer af en bi svar til en lugt.
Representative Results
Vi præsenterer to eksempler på brug af PER protokoller beskrevet ovenfor. Det første eksempel gjort brug af metode 2 for at undersøge, hvordan honningbier opfatter forskellige lugte som en funktion af den molekylære lighed med lugt anvendes som CS 5,24,25. Det andet er et eksempel på brug af metode 1 og nogle af de forholdsregler, der skal træffes, når der begynder at bruge PER conditioning eksperimenter i forskningslaboratoriet.
Undersøgelser som denne er blevet brugt til at beskrive den olfaktoriske »perceptuelle rum" af honningbier og møl i forbindelse med bioimaging 13 eller elektrofysiologiske analyser 26. Honningbier (n = 20) blev konditioneret at associere lugtstoffet decanal med saccharose forstærkning over 12 fremadgående parring conditioning forsøg (figur 3A). Ca. 10% af honningbier svarede 'spontant' på den første retssag, hvilket er normalt. Efter at den procentdel, responded stige over de næste par forsøg indtil 100% af honningbiernes reagerede på femte forsøg og hver efterfølgende retssag. Adskillige undersøgelser har vist, at denne stigning i reaktion er specifik for fremad parring tilstand (figur 1) i forhold til flere vigtige kontrolprocedurer 3. Efter overtagelsen fase blev hver honningbi udsat for en række af uarmerede testforsøg (figur 3B), som omfattede udsættelse for lugt KS, og til flere andre lugtstoffer, der systematisk afveg fra CS i molekylære strukturer. Honningbier reagerede stærkest til CS. Deres svar på de andre lugtstoffer faldt som en funktion af de systematiske ændringer i struktur, med de laveste svar på de lugtstoffer mindst ligesom CS.
I figur 4 er resultaterne fra en nylig afholdt workshop, hvor de studerende har lært, for første gang, hvordan man kan betinge honningbier hjælp af metode 1 er illustreret. Studerende graner t aircondition honningbier gennem forward parring methycyclohexanone (MCH), eller octanol (OLT) med saccharose forstærkning (figur 4A). Procent svar var lavere på den første retssag og øget på de efterfølgende forsøg indikerer, at bierne lærte lugt-saccharose forening. Der var forskelle i den grad, at bierne lærte betingede forening på tværs af de forskellige grupper af studerende. Det er vores erfaring, kan disse typer af forskelle skyldes den lugt, der blev brugt som CS, at de upræcise elementer i den metode (metode 1), eller til uddannelse niveau eksperimentatorer. I det tredje tilfælde, ydeevne hurtigt bliver mere i overensstemmelse med de eksperimentatorer øgede oplevelse. Efter konditionering blev hver honningbi testes to gange med hver lugt. I grupper af honningbier, der var blevet konditioneret med fremad parring af OLT eller MCH blev svaret, som forventet, stærkeste på den konditionerede lugt (figur 4B).
ent "> Den anden gruppe af honningbier, der har oplevet frem parring OLT var betinget parallelt med en anden gruppe, hvor lugt oktober blev baglæns parret med saccharose. Baglæns parring er en af flere typer af kontrolprocedurer for at demonstrere, at stigningen i reaktion er specifikt at sende parring og ikke på grund af en anden proces, såsom ikke-specifik ophidselse fra sensibilisering. Til baglæns parring, er det saccharose USA og lugt CS præsenteres i omvendt rækkefølge, hvad der er vist i figur 1. datafangst fra tilbagestående parring er ikke vist, fordi CR ikke kan scores gives præsentationen af lugt KS efter fremlæggelsen af saccharose. Som det vil være forudsagt for associative condition, svaret niveauer til oktober var højere i den forreste parrede gruppe i forhold til den tilbagestående gruppe (figur 4C).7fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1. Diagrammer over eksperimentelle design til konditionering ved hjælp fremad parring. Se Tabel 1 for definitioner af de udtryk, der anvendes i denne figur. (A) KS (lugt) forud og overlapninger med USA (saccharose / vand-opløsning). Forholdet mellem CS og USA vist er optimal til konditionering honningbier og møl. Men den optimale ISI kan stole på konditionering protokol og dyrearter. 1 (B) Fordeling og relative timing af CS, CR, USA, og UR. CR, der opstår enten før amerikanske præsentation eller under uarmerede forsøgsområder forsøg er den afhængige mål for forsøgsprotokoller.
Figur 2. Lugt udtømning med genbrug af patroner. For disse data var lugt patronerset-up med hexanol som beskrevet i teksten. Hexanol er almindeligt anvendt som en CS i Per undersøgelser; dog vil den faktiske hastighed af nedbrydningen afhænger af lugt og opløsningsmiddel. Patroner blev derefter brugt en gang i 4 sekunder hvert minut over 8 forsøg (under forudsætning af 5 honningbier / forsøg i en standard eksperiment, der ville svare til 40 anvendelser). Fortyndingerne i det angivne opløsningsmiddel, som var relativt standard for PER forsøg, var 2,0 M (A) og 0,2 M (B). (A, B) Lugten blev udtaget efter den første og ottende forsøg ved adsorption på en fast fase mikroekstraktion (SPME) fiber, der blev desorberes derefter på en gaskromatograf. De relative arealer under toppene var højere efter den første prøve i forhold til den ottende for begge opløsningsmidler, og for begge koncentrationer (Wilcoxon følerpar signed rank test p <0,05 [*] eller mere), hvilket viser, at mindre lugt blev leveret fra patronen , efter at patronen er blevet anvendt et antal gange. (C, D) De samme data, der viser blot den ottende st undervægter le med y-aksen udvides. Det viser, at udtynding var lidt større for hexan i forhold til mineralolie, men kun i den lavere koncentration.
Figur 3. Erhvervelse og test med decanal som CS og metode 2 til condition. (A) Trial-by-forsøg respons (CR) i løbet af 12 fremadgående parring forsøg (figur 1). Data er fra n = 20 honningbier aircondition i fire grupper af 5 honningbier hver. ISI var 3 sek og ITI var 6 min. (B) uarmeret tests med lugte, som afviger fra decanal af carbonkædelængde og / eller positionen af carbonylcarbonatomet. De lugte blev præsenteret i et randomiseret serie på tværs af de fire grupper og blev afbrudt med forstærkede forsøg med decanal (hver to til tre forsøg) for at undgå udryddelse af CR.
Figur 4. Data fra en workshop, hvorunder studerende blev trænet til konditionering honningbier hjælp PER metode 1. (A) datafangst fra tre grupper af honningbier aircondition til octanol (n = 23 og 15 til GPS 1 og 2, henholdsvis) og methylcyclohexanon (n = 10) (B) CR'er under uarmerede forsøg med både lugte.; fire forsøg præsenteres i tilfældig serie tværs grupper. (C) uarmerede forsøg med både lugte i to grupper af honningbier, en fremad parret (GP 1, n = 23) og en baglæns parret (n = 25).
| Sigt (forkortelse) | Definition | Relevant eksempel |
| Betinget stimulus (CS) | Enstimulus, som fremkalder lidt eller ingen reaktion på første og signalerer USA | LUGT |
| Betinget reaktion (CR) en | Reaktionen på KS efter foreningen med USA | Proboscis FORLÆNGELSE |
| Ubetinget stimulus (US) | En biologisk betydelig påvirkning, der fremkalder en reaktion | Sakkarose / vandopløsning |
| Ukonditioneret respons (UR) en | Reaktionen på den amerikanske | Proboscis FORLÆNGELSE |
| Inter-Stimulus Interval (ISI) | Tiden mellem debut af CS og påbegyndelsen af den amerikanske | Lugt til saccharose interval |
| Inter-Trial interval (ITI) | Tiden mellem successive CS-amerikanske parringer for et enkelt dyr | Lugt (retssag n) lugt (retssag n + 1) interval |
Tabel 1. Imtigt terminologi. Se figur 1 for en illustration af disse vilkår. en for Per konditionering CR og UR er den samme, men for andre typer af foreninger og reflekser CR og UR kan variere.
Movie 1. En video af en honningbi udfører PER efter at det havde været en betingelse for at reagere på en lugt. Bemærk PER respons bi ca. 1,5 sek efter lugt debut. Tracking software kortlagt antennal bevægelser som reaktion på præsentationen af lugt. Linjerne plottet i øverste højre hjørne af videoen gengivelse af den faktiske antennal bevægelser. De to grafer i bunden af skærmen viser antennal bevægelser på X (til venstre) og Y (højre)-koordinater. De lodrette linier i grafen vist i videoen indikerer, venstre til højre, lys ON, PER, lyset slukkes og snabel tilbagetrækning.
Discussion
Denne protokol præsenterede to pålidelige metoder til konditionering ved hjælp af PR procedure. Det er to af flere metoder, der med succes er blevet anvendt 27 21. Vi beskæftiger Metode 2 for alle eksperimentelle undersøgelser med anvendelse af PER som det er konsekvent pålidelige, også på tværs af forskellige eksperimentatorer.
Den samme grundlæggende procedure er blevet tilpasset til mange forskellige slags undersøgelser med honningbier, herunder anvendelse af forskellige conditioning stimuli og forskellige adfærdsmæssige reflekser. Det har også været forbundet med undersøgelser af det genetiske grundlag for forskelle i læring 28,29, de fysiologiske korrelater til olfaktoriske perception og hukommelse i hjernen 13,14,30, og modulerende og molekylærgenetiske grundlag for adfærd 15,16,31 . På grund af den avancerede viden af den økologiske relevans af olfaktoriske læring til honningbier, der startede med de første undersøgelser af Karl von Frisch over 100 år siden
Den grundlæggende procedure er stærk, at den kan anvendes til at undersøge problemer i andre arter. To møl arter, Manduca sexta og Spodoptera littoralis, er blevet anvendt i Per studier for at undersøge neurale grundlag for identifikation lugt og hver arters olfaktoriske indlæringskapacitet 32,33. PER forsøg med bananfluer har givet mange indsigt i de molekylære signalleringskaskader involveret i chemosensation og læring 34. Og Per er for nylig blevet anvendt til at undersøge tilvænning i loppen (Rhodnius prolixus) 35, en vigtig sygdom vektor.
I almindelighed fremgangsmåden er robust over for ændringer i metode; anvendelse af different metoder vil sandsynligvis producere den samme relative forskel mellem behandlingsgrupper. På trods af den forholdsvis enkel procedure, kan flere problemer til tider forhindre honningbier fra at lære lugt-saccharose forening. Følgende emner er mulige ændringer af protokollen og nogle af de mere almindelige problemer, der kan opstå under PER condition.
Overvejelser om antallet og typen af forsøg i Conditioning protokollen
Enhver læring protokol vil kræve eksponering af bier til en række forsøg i købet fase. Dette antal afhænger i høj grad vanskelig opgave. Honningbier kan lære en enkel opgave efter en enkelt retssag, men de har brug for mindst en tre forsøg til at fremkalde langtidshukommelse dannelse. Som forventet, vil honningbier kræver betydeligt flere forsøg i tilstrækkelig grad lære en vanskelig opgave. Generelt er der et maksimalt antal forsøg ud som bierne ikke længere i betydelig grad forbedrerir ydeevne. Denne maksimale afhænger af den specifikke opgave, de lugt typer og koncentrationer og saccharosekoncentrationen.
Når du bruger mere end én type af forsøg med forskellige lugte, præsentere de forskellige forsøg typer i en pseudotilfældig sekvens for at holde bier fra at huske en simpel sekvens af lugt præsentationer i stedet for at lære forskellene mellem lugte 36. I disse pseudotilfældige sekvenser, skal der være et lige antal forsøg for hver af de lugt typer. Også, idet sandsynligheden for et forsøg med en lugt typen forud og efterfulgt af samme lugt, eller nogen af de andre lugte, skal være ens for alle lugte. For to lugte - A og B - bruge følgende rækkefølge: ABBABAAB. Over otte forsøg hver lugt præsenteres fire gange. Sammenkæde identiske sekvenser for at nå det ønskede antal forsøg for hver lugt.
Uanset den eksperimentelle design, der er et par parametre, der skal forblivekonstant for at optimere læring. Overlappet mellem CS og USA er afgørende for en effektiv condition. Den inter-retssagen interval (figur 1, tabel 1) skal være konstant og optimeres fordi uregelmæssighed eller en for kort eller for lang inter-retssagen interval signifikant kan påvirke effektiviteten af konditionering protokol 1.
Overvejelser om betydningen og Design af Behavioral Testing Trials
Svarene er optaget under "erhvervelse fase« af et eksperiment, da CS og USA præsenteres samlet, kan være nyttige. Men pas på, at lugten præsentation forhold kan variere fra den ene type forsøg til en anden. Under forstærkede undersøgelser er lugt fulgt af saccharose fremlægges i forbindelse med en visuel stimulus (bevægelse af anordningen til at levere den saccharose dråbe), der kan påvirke biens svar. Og bierne har kun tre sekunders for at vise en respons (til fire sekunder af lugt stimulering minus én sek overlapning med saccharose præsentation, figur 1). Hvis forsøget medfører bierne lære at skelne to lugte (f.eks, forstærket og uarmeret), den uarmeret lugt præsenteres på alternative forsøg forekommer uden den visuelle stimulus af belønning præsentation og bierne har de fulde fire sekunder for at reagere. Derfor er svarene på de to lugte er ikke fuldt sammenlignelige i forbindelse med købet. Med konditionering protokol, ikke udelukkende stole på erhvervelse kurver 1. For bedre at fastslå, hvad bier har lært, indføre en række uarmerede testforsøg, hvor ingen lugt er forstærket, der sikrer, at testning af alle stimuli foregår under identiske betingelser.
Afhængigt af den specifikke formålet med forsøget, kan testning bestå af enkelte test forsøg med aircondition lugt eller en serie af forsøg med den betingede odeller eller en kombination af de betingede og nye lugte. En enkelt test forsøg med aircondition lugt giver en enkel analyse af, om biernes huske den betingede lugt. Svaret på den første test forsøg, kan dog afspejle biernes motivation niveau samt deres tilbagekaldelse af den betingede lugt. En serie af test forsøg, som en række af udryddelse forsøg med den betingede lugt eller en serie af enkelt test af konditioneret og en eller flere nye lugte, kan også bruges til at vurdere hukommelsen. Rækken af udryddelse forsøg kan vurdere, hvor stærkt biernes huske den betingede foreningen. Jo stærkere tilbagekaldelsen større antal forsøg er nødvendige for at slukke betinget reaktion. En række af enkelte tests af betingede og nye lugte kan også vurdere specificiteten biernes hukommelse af den betingede lugt.
Det er også nødvendigt at konditionere og teste både kontrol og behandlede grupper på samme tidspunkter. Sammenligneligheding udførelsen af bier snart efter konditionering til bier bestemt for længere perioder er problematisk på grund af eksponering for saccharose USA ved at fodre bierne til mæthed. For eksempel kunne et fald i ydeevne efter lange intervaller skyldes hukommelse forfald, eller det kan skyldes ændringer i motiverende tilstand og / eller læring induceret ved uarmerede eksponering mod USA, hvilket gør resultaterne tvetydig. Derfor bør udførelsen af en behandlingsgruppe altid bedømmes i forhold til en kontrolgruppe konditioneret og testet ved de samme tidspunkter.
Lugt Koncentration og Integritet
Der er flere måder, hvorpå koncentrationen og integritet lugt (CS) kan være kompromitteret. Den mest udbredte problem med lugt levering er udtømningen af lugt patroner fra overforbrug (figur 2). Udskiftning af patronerne 10-12 anvendelser (hver 2 eller 3 forsøg med grupper af 5 honningbier) for at undgå denne faldgrube. Det er også afgørende at anvendefriske patroner til testforsøg, da brugte patroner kan være forskelligt forarmet, og dermed til stede ulige lugt stimuli. Et andet fælles problem er lugt forurening patron ved at benytte patron til mere end en lugt uden helt at rense det. Et snavset eller forurenet luft flow kan også utilsigtet indføre ekstra olfaktoriske stimulus (aktivt kul filtre kan forhindre forurening baggrund). Dette er især problematisk, når kobling PER condition med målinger af fysiologiske reaktioner på lugt. Utætte lugt patroner fremlægge et problem, da honningbier er udsat for lugt før retssagen begynder, hvilket reducerer prominens af lugten stimulus. Løstsiddende på lufttilførslen for lugt levering kan resultere i lidt eller ingen lugt levering, når ventilen åbnes, kunstigt at reducere biernes reaktion på den påtænkte lugt.
Sucroseopløsning og ubetinget stimulus (Reward)
Den enmount, koncentration og integritet rørsukkeropløsningen bruges som USA er afgørende for succesen af eksperimentet. Conditioning er en funktion af mængden og koncentrationen af saccharose-vand-opløsning, der anvendes som USA 37. Mikrometer sprøjter, der anvendes i Metode 2 giver mulighed for meget præcis (ned til 0,2 ul) kontrol med leveringen USA, og vi anbefaler at bruge dem for begge metoder er beskrevet. Anvendelse af tandstikkere (metode 1), er tilstrækkelig til omstændigheder, hvor de dyre sprøjter ikke kan bruges, såsom i uddannelse store grupper af studerende, arbejde i marken, eller med lavere budgetter. Omhyggelig implementering af metode 1 er fint, så længe timing vedligeholdes med regelmæssig udskiftning af tandstikkere for at undgå ophobning af saccharose (og koncentrationen leveret). Men ved hjælp af tandstikkere er det mere vanskeligt præcist at kontrollere og vurdere mængden og omfanget af USA leverede, hvilket er vigtigt for konditionering undersøgelser 1. Koncentrationen af saccharose er nødvendig for atgive en tilstrækkelig belønning for at holde bierne motiveret til at lære den betingede Foreningen kan afhænge af opgavens vanskelighed og biernes indre tilstand eller tid af året. De mere vanskelige opgaver kræver en højere sucroseopløsning for bier «med held lære opgaven. Mug kan oprustning i saccharoseopløsninger selv ved 5 ° C, hvilket vil kompromittere integriteten af løsningen, der påvirker biernes sundhed og opfattelse af belønning under eksperimentet. Det er bedst at erstatte opløsningen hver par dage.
Præcision, timing og Sammenhæng af CS og amerikanske Levering
Det mest kritiske spørgsmål om korrekt gennemførelse af en per procedure, eller for den sags skyld enhver konditionering procedure involverer præcision, timing og konsekvens i CS og levering USA (figur 1). Efterforskere, der er nye til proceduren ofte er upræcise om levering af en eller begge stimuli. ISIsder ikke mulighed for overlapning CS og US resultere i dårlig condition ydeevne. PLC'en automatiserer et signal for eksperimentatoren at levere saccharose 3 sek efter indtræden af lugt levering. Efterforskere bør holde sakkarose / vanddråbe tæt på bi for hurtig levering efter signalet. Disse procedurer hjælpe indblande en konsekvent ISI. Placering af et stopur ved konditionering arena giver mulighed for nem tid placering af forsøget samt overvågning biernes tid i arenaen både før og efter levering af stimuli. På den måde ITI er kan være relativt ensartet og hele proceduren kan køres i et kontrolleret tempo. ITI er der er for korte, for eksempel mindre end 1 min, eller for lange, kan føre til dårlig konditionering resultater 1.
Seasonal, miljømæssige og kontekstuel Virkninger på Honey Bee ydeevne
Honningbier præstationer kan være væsentligt påvirket af sine omgivelserbåde før og under condition. Ofte vil udsvingene i temperatur og mad tilgængelighed, der kommer med de skiftende årstider ændre biernes motivation til at lære. Når blomsterne er i flor, til bierne motivation lære den betingede forening i laboratoriet falder 38. Når kolonien er stresset - fra ekstreme temperaturer, fødevaremangel, eller hvis sygdommen stress - biernes vil vise en reduktion i deres læring ydeevne indeni. Honningbier holdes i en flyvning rum kan lære godt for et stykke tid, men der også stress af sygdom og aldring forringe deres læring resultater over tid. Den kontekst under konditioneringen kan også mindske biernes præstationer. Eventuelle fremmede lugte, bevægelse og andre stimuli kan distrahere bi fra de eksperimentelle stimuli. For at undgå dette problem, vedligeholde en rimeligt ensartet, forenklet visuel kontekst.
Genotype og Erfaringen Påvirker PER ydeevne
<p class = "jove_content"> Honey Bee arbejdere kan variere betydeligt i ydeevne på konditionering procedure på grund af opgaven specialisering, genotype, eller andre miljømæssige faktorer 20. Derfor er det vigtigt at standardisere, så meget som muligt, de typer af dyr anvendt i et eksperiment for at reducere inter-individuel variation. I en koloni ledet af en open-parret dronning, hvilket betyder, at hun parret med mange forskellige droner, vil arbejderne forskellige i faderlig genotype. Genetisk baggrund kan føre til dramatiske forskelle i sensorisk lydhørhed 39 og læring ydeevne 29. Brug kolonier ledet af dronninger instrumentelt insemineres med sæd fra en enkelt droner 28 reducerer denne inter-individuel variation.De ovenfor beskrevne protokoller, omfatter en metode til indsamling af honningbi arbejdstagere fra reden indgangen. Men disse honningbier afviger fra hinanden med hensyn til alder eller adfærdsmæssige opgave. De kan være unge (inexperienCED) eller ældre (mere erfarne) finsnittere. De kan være unge honningbier med deres første orientering flyvninger. Eller de kan være guard bier. For at reducere variation markere bier med en hurtigtørrende emalje maling eller mærkning tags enten som de fremstå som voksne (for at kontrollere for alder), og / eller når de begynder fouragering (til at kontrollere for erfaring). Så et par dage senere, indsamle de markerede bier condition. Arbejdstagere, der er involveret i sygepleje adfærd kan indsamles fra de rammer, inden for bikuben. Sygeplejersker kan identificeres positivt, når de indsætter deres hoveder ind i et kuld celle til foder og pleje for larve indeni.
Brug af Virgin Queens eller Drones for Per Conditioning
Udover arbejdstager honningbier kan jomfruelige honningbi dronninger og droner let Klimaanlæg i en PER procedure for undersøgelser med henblik på at udvikle genetiske linjer af honningbier, der adskiller sig i at lære ydeevne 28. Virgin dronninger bør indsamles hurtigt efter they komme fra pupation og placeres direkte i fastholdende seler uden bedøvelse. Unge, umodne droner indsamlet fra yngel kam inde i kolonien er generelt ikke motiverede for at lære. Efter at de er begyndt parring flyvninger, droner let lære PER opgaver 28. De bør indsamles så de vender tilbage fra en parring flyvning og vedligeholdes natten over i et lille bur i en koloni anvendes til opdræt af dronninger. Forsøg ikke at udnytte dem dagen før konditionering; de ikke overleve godt i seler natten over. Et par timer før konditionering dronerne kan indsamles fra burene og anbringes i fastholdende seler uden bedøvelse.
Konklusioner
Denne PER procedure i vejen for metoder, udgør et udgangspunkt for at designe PER eksperimenter. De fleste PR protokoller vil kræve, at den procedure, der er skitseret ændres på en eller anden måde at gennemføre de specifikke mål for eksperimentet og indkvartere flere behandlingsgrupper. Det er let at gennemføre. Men korrekt gennemførelse kræver opmærksomhed på detaljer og praksis. Når mestrer det kan være en stærk procedure til at tilføje som et forsknings-værktøj til flere grundlæggende og anvendt forskning programmer med forskellige insektarter.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af midler fra NIH NCRR (R01 RR014166 til BHS), NIH NIDCD (R01 DC011422 BHS co-PI), det amerikanske Department of Agriculture (J Trumble PI; BH Smith co-PI) og Arizona State University. Midler til værkstedet for at træne de studerende (data i figur 4) blev leveret af Science Foundation i Chile.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-1KG | |
| Odorant Compounds (for example) | |||
| 1-hexanol | Sigma-Aldrich | 471402-100ML | For additional examples |
| 2-octanone | Sigma-Aldrich | W280208-800G-K | of odorants, see any of |
| heptanol | Sigma-Aldrich | 51778-5ML | the papers on olfactory |
| gerianol | Sigma-Aldrich | 163333-25G | processing from the |
| nonanal | Sigma-Aldrich | 131210-100ML | Smith lab. |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-1L | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760-1L | Make sure it’s odorless. |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
| Scintillation vials | Sigma-Aldrich | Z190535-1PAK | Use a small drill bit to bore a small hole in the cap of the vials. |
| Bee harness | Custom-made from 0.9 cm diameter plastic soda straws or hard plastic/metal tubing. | ||
| Duct tape | |||
| Kimwipes | Sigma-Aldrich | Z188956-1PAK | |
| Wash bottles | Sigma-Aldrich | Z560847-3EA | For the 70% ethanol. |
| Dryer tubing | |||
| FOR METHOD 1 ONLY | |||
| 20 ml disposable plastic syringes | Cole-Parmer | WU-07945-18 | |
| 15 mm filter paper circles | Sigma-Aldrich | Z274844-1PAK | |
| Pushpins | |||
| Toothpicks | |||
| FOR METHOD 2 ONLY | |||
| Gilmont Micrometer syringe, 0.2 ml | Cole-Parmer | EW-07840-00 | |
| Gilmont micrometer syringe tip | Cole-Parmer | EW-07841-00 | |
| 26 G 3/8” Leur hub hypodermic needles | Fisher Scientific | 14-826-10 | |
| 1 cc tuberculin syringes (plastic/glass) | Sigma-Aldrich | Z181641-1EA OR Z192090-200EA | Glass tuberculin syringes are available, but plastic syringes are much less expensive and will work well for a limited number of uses. |
| Small rubber/silicone restrictors | Cole-Parmer | EW-95702-02 | Made from 4.8 mm outer diameter silicone tubing or the rubber tips of the 1 cc syringe plungers. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| 75 x 100 mm filter paper | Sigma-Aldrich | Z695106-500EA | |
| Direct Logic 05 Programmable Logic Controller |  Koyo Electronics Industries Co, Ltd |
||
| 1 mm, 4 mm, & 6 mm inner diameter PVC or silicone tubing | Cole-Parmer | Various | Cole-Parmer has a wide selection of suitable tubing. |
| Polypropylene connectors & leur fittings | Cole-Parmer | Various | Cole-Parmer has a wide selection of connectors and fittings for many tube sizes. |
| 65 mm Correlated Flowmeter | Cole-Parmer | EW-03216-08 | Aluminum with glass float; for liquids and gases, with valve. |
| OR | |||
| Tetra Whisper 300 (Tetratek DW96-2) Aquarium Air Pump | Aquacave |
AE-TETRA-300 | |
| LIF series Solenoid Valves for .042 " ID Tubing, Configuration "E" | The Lee Company |
LFAA1200118H | Neoprene, 430 SS, 302 SS, 280 mW |
| PC-Board 12VDC 70dB Piezo Buzzer | RadioShack |
273-074 | |
References
- Rescorla, R. A. Behavioral studies of Pavlovian conditioning. Annu Rev Neurosci. 11, 329-352 (1988).
- Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera). Journal of Comparative Psychology. 97, 107-119 (1983).
- Giurfa, M., Sandoz, J. C. Invertebrate learning and memory: Fifty years of olfactory conditioning of the proboscis extension response in honeybees. Learn Mem. 19, 54-66 (2012).
- Smith, B. H., Wright, G. A., Daly, K. S. The Biology of Floral Scents. Dudareva, N., Pichersky, E. , CRC Press. 263-295 (2006).
- Menzel, R., Giurfa, M. Dimensions of cognition in an insect, the honeybee. Behav Cogn Neurosci Rev. 5, 24-40 (2006).
- Kuwabara, M. Bildung des bedingten Reflexes von Pavlovs Typus bei der Honigbiene, Apis mellifera. Journal of the Faculty of Science, Hokkaido University, Zoology. 13, 458-464 (1957).
- Menzel, R. The honeybee as a model for understanding the basis of cognition. Nat Rev Neurosci. 13, 758-768 (2012).
- Menzel, R. Neurobiology of comparative cognition. Kesner, R. P., Olton, D. S. , Lawrence Erlbaum. 237-292 (1990).
- Hammer, M., Menzel, R. Learning and memory in the honeybee. Journal of Neuroscience. 15, 1617-1630 (1995).
- Strube-Bloss, M. F., Nawrot, M. P., Menzel, R. Mushroom body output neurons encode odor-reward associations. J Neurosci. 31, 3129-3140 (2011).
- Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in kenyon cells of the honeybee mushroom body. Front Syst Neurosci. 2, (2008).
- Fernandez, P. C., Locatelli, F. F., Person-Rennell, N., Deleo, G., Smith, B. H. Associative conditioning tunes transient dynamics of early olfactory processing. J Neurosci. 29, 10191-10202 (2009).
- Locatelli, F. F., et al. Nonassociative plasticity alters competitive interactions among mixture components in early olfactory processing. Eur J Neurosci. 37, 63-79 (2013).
- Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. Journal of Neuroscience. 23, 5370-5380 (2003).
- Mussig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. J Neurosci. 30, 7817-7825 (2010).
- Hladun, K. R., Smith, B. H., Mustard, J. A., Morton, R. R., Trumble, J. T. Selenium toxicity to honey bee (Apis mellifera L.) pollinators: effects on behaviors and survival. PLoS One. 7, e34137 (2012).
- Wiegmann, D. D., Smith, B. H. International Journal of Comparative Psychology. 22, 141-152 (2009).
- Drezner-Levy, T., Shafir, S. Parameters of variable reward distributions that affect risk sensitivity of honey bees. J Exp Biol. 210, 269-277 (2007).
- Drezner-Levy, T., Smith, B. H., Shafir, S. The effect of foraging specialization on various learning tasks in the honey bee (Apis mellifera). Behavioral Ecology & Sociobiology. 64, 135-148 (2009).
- Shafir, S., Menda, G., Smith, B. H. Caste-specific differences in risk sensitivity in honeybees, Apis mellifera. Animal Behaviour. 69, 859-868 (2005).
- Smith, B. H., Menzel, R. An analysis of variability in the feeding motor program of the honey bee; the role of learning in releasing a modal action pattern. Ethology. 82, 68-81 (1989).
- Erber, J., Pribbenow, B., Kisch, J., Faensen, D. Operant conditioning of antennal muscle activity in the honey bee (Apis mellifera L). Journal of Comparative Physiology A-Sensory Neural & Behavioral Physiology. 186, 557-565 (2000).
- Smith, B. H., Menzel, R. The use of electromyogram recordings to quantify odorant discrimination in the honey bee, Apis mellifera. Journal of Insect Physiology. 35, 369-375 (1989).
- Stopfer, M., Bhagavan, S., Smith, B. H., Laurent, G. Impaired odour discrimination on desynchronization of odour-encoding neural assemblies. Nature. 390, 70-74 (1997).
- Daly, K. C., Christensen, T. A., Lei, H., Smith, B. H., Hildebrand, J. G. Learning modulates the ensemble representations for odors in primary olfactory networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 10476-10481 (2004).
- Matsumoto, Y., Menzel, R., Sandoz, J. C., Giurfa, M. Revisiting olfactory classical conditioning of the proboscis extension response in honey bees: a step toward standardized procedures. J Neurosci Methods. 211, 159-167 (2012).
- Chandra, S. B., Hosler, J. S., Smith, B. H. Heritable variation for latent inhibition and its correlation with reversal learning in honeybees (Apis mellifera). Journal of Comparative Psychology. 114, 86-97 (2000).
- Chandra, S. B., Hunt, G. J., Cobey, S., Smith, B. H. Quantitative trait loci associated with reversal learning and latent inhibition in honeybees (Apis mellifera). Behavior Genetics. 31, 275-285 (2001).
- Hammer, M. The neural basis of associative reward learning in honeybees. Trends in Neurosciences. 20, 245-252 (1997).
- Frisch, K. The Dance Language and Orientation of Bees. , Harvard University Press. (1965).
- Daly, K. C., Smith, B. H. Associative olfactory learning in the moth Manduca sexta. J Exp Biol. 203, 2025-2038 (2000).
- Fan, R. J., Anderson, P., Hansson, B. Behavioural analysis of olfactory conditioning in the moth spodoptera littoralis (Boisd.) (Lepidoptera: noctuidae). J Exp Biol. 200. 23 (Pt 23), 2969-2976 (1997).
- Paranjpe, P., Rodrigues, V., VijayRaghavan, K., Ramaswami, M. Gustatory habituation in Drosophila relies on rutabaga (adenylate cyclase)-dependent plasticity of GABAergic inhibitory neurons. Learn Mem. 19, 627-635 (2012).
- Vinauger, C., Lallement, H., Lazzari, C. R. Learning and memory in Rhodnius prolixus: habituation and aversive operant conditioning of the proboscis extension response. J Exp Biol. 216, 892-900 (2013).
- Smith, B. H., Abramson, C. I., Tobin, T. R. Conditional withholding of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera) during discriminative punishment. Journal of Comparative Psychology. 105, 345-356 (1991).
- Smith, B. H. An analysis of blocking in odorant mixtures: an increase but not a decrease in intensity of reinforcement produces unblocking. Behav Neurosci. 111, 57-69 (1997).
- Gerber, B., et al. Honey bees transfer olfactory memories established during flower visits to a proboscis extension paradigm in the laboratory. Animal Behaviour. 52, 1079-1085 (1996).
- Rueppell, O., et al. The genetic architecture of sucrose responsiveness in the honeybee (Apis mellifera L). Genetics. 172, 243-251 (2006).
