Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

תגובת פרוטוקול חוטם הרחבה לחקירת פלסטיות התנהגות בחרקים: בקשה ליסוד, ביו רפואית, ומחקר חקלאי

Published: September 8, 2014 doi: 10.3791/51057
Automatic Translation
1, 1
1School of Life Sciences, Arizona State University

Abstract

חרקים לשנות את תגובותיהם לגירויים דרך חוויה של שיוך גירויים אלו עם אירועים חשובים להישרדות (למשל, מזון, בני זוג, איומים). קיימים מספר מנגנונים התנהגותיים שדרכו חרק לומד האסוציאציות עיקריות ומתייחס לאירועים אלה. זה חשוב להבין פלסטיות התנהגות זו לתוכניות שנועדו לסיוע לחרקים שאינם מועילים לחקלאות. גם הבנה זו יכולה לשמש לגילוי פתרונות לבעיות ביו והחקלאיים שנוצרו על ידי חרקים המשמשים כוקטורי מחלות ומזיקים. פרוטוקול אוויר החוטם הרחבה תגובה (PER) פותח עבור דבורי דבש (Apis mellifera) לפני יותר מ -50 שנים ללמוד איך הם תופסים וללמוד על ריחות פרחוניים, אשר לאותת משאבי הצוף ואבקת צרכי מושבה להישרדות. הליך PER מספק מסגרת יציבה וקלה למעסיקים ללימוד כמה Mecha רלוונטי מבחינה אקולוגית שונהnisms של פלסטיות התנהגותית. זה להתאמה בקלות לשימוש עם כמה מינים של חרקים אחרים ורפלקסים התנהגות אחרים. פרוטוקולים אלה יכולים להיות מועסקים בקלות בשיתוף עם אמצעים שונים לניטור פעילות עצבית במערכת העצבים המרכזית באמצעות אלקטרופיזיולוגיה או bioimaging, או לטיפול במסלולי neuromodulatory ממוקד. זה assay חזק למהירות גילוי תופעות משנה קטלני על התנהגות נגרמת על ידי גורמי לחץ, רעלים או חומרי הדברה סביבתיים.

אנו מראים כיצד פרוטוקול PER הוא פשוט ליישום באמצעות שני הליכים. אחת מהן הוא מתאים כמעבדה תרגיל לסטודנטים או למבחנים מהירים של ההשפעה של טיפול ניסיוני. האחרים מספק שליטה מעמיקה יותר של משתנים, וזה חשוב ללימודים של אוויר התנהגותיות. אנו מראים כיצד במספר צעדים לתגובה התנהגותית הנעים בין כן בינארי / לא למשתנה רציפה יותר כמו חביון ומשך הארכת חוטם יכול לשמש כדי לבדוק hypotheseים. ו, אנו דנים בחלק ממלכודות שחוקרים בדרך כלל נתקלים כאשר הם משתמשים בהליך בפעם הראשונה.

Introduction

חרקים רבים ללמוד על גירויים רלוונטיים מבחינה אקולוגית, והם לאחר מכן לשנות תגובות התנהגותיות שלהם לגירויים אלה על מנת להתאים ליחסים חזוי חדשים בסביבה שלהם. מספר מנגנונים שונים יכולים בבסיס פלסטיות התנהגות זו (למשל, nonassociative, אסוציאטיבי / הפבלובית, ואופרנטית / אינסטרומנטלית 1). של פלסטיות סוגים אלה נבדלים באופן שבו הגירויים או ההתנהגויות קשורות לאירועים חשובים, כגון ההתרחשות של אוכל, בן זוג, או סכנה. הבנת צורות של פלסטיות אלה חשוב מאוד למחקר בסיסי לאופן שבו מערכת העצבים משנה לקידוד זכרונות חדשים 2. כמו כן, חשוב להבנת התנהגויות ההסתגלות של חרקים שהם וקטורים חשובים של מחלה (לדוגמא, tsetse ויתושים) וחרקים שחשובים חקלאי, בין אם בייצור יבול (דבורי דבש) או כמזיקים.

לומד פלסטיות התנהגותית בכל עניםאל דורש רמת שליטה ניסיונית על מספר המשתנים שאינו בר השגה בתחום 1. זה דורש הפיתוח של פרוטוקול אוויר חזק שיכול להיות מועסק בתנאים מבוקרים יותר, עדיין שהם עדיין רלוונטיים להתנהגות בתנאים טבעיים. דבורת הדבש (Apis mellifera) היא מודל מצוין לכיצד לפתח פרוטוקול לביצוע ניתוחים מבוקרים של 3,4 פלסטיות התנהגותית. החוטם הרחבה התגובה (PER) בדבורים דבש היא רפלקס התנהגות טבעי שבו דבורת הדבש מרחיבה חוטם שלה בתגובה לגירוי מחושים עם תמיסת סוכר. במהלך התנהגות שיחור מזון רגילה, PER מתרחש כאשר דבורת הדבש מוצאת צוף בפרח. למרבה המזל, דבורי דבש יהיו בקלות להפגין התנהגות פשוטה ובקלות לכימות זה במעבדה. זה מאפשר ללמוד, בסביבה מבוקרת, המנגנונים המשפיעים על התנהגות רלוונטית מבחינה אקולוגית זה 5. ca PERn לשמש גם בתוך פרוטוקול אוויר כדי לחקור תפיסת גירוי ולמידה וזיכרון בתנאי טיפול שונים, שנועדו לחשוף את המנגנונים התנהגותיים ועצביים העומדים בבסיס הפלסטיות 6.

מאז המחקרים הראשונים על ידי 7 Kuwabara, PER אוויר כבר בשימוש נרחב כדי לחשוף nonassociative, אסוציאטיבי ומנגנונים אופרנטית העומדים בבסיס פלסטיות התנהגות בדבורים דבש 8. מנגנונים אלה הם זהים לאלו שהתגלו במחקרים של דבורי דבש עפו בחופשיות 9. בניגוד למחקרים של דבורי דבש עפו בחופשיות, יכולים להיות בשילוב פרוטוקולי אוויר PER עם אלקטרופיזיולוגיה 10,11 או דימות פלואורסצנטי לחיות תאי 12-14 במוח. יתר על כן, פרוטוקולי PER מאפשרים מניפולציה ניסויית של מסלולים עצביים באמצעות טיפולים גנטיים תרופתיים או מולקולריים כדי לבחון השערות על התפקידים של רכיבים ספציפיים של הרשת, כגון neuromodulators 15,16. גם פרוטוקולי PER סיפקו דרך חשובה כדי להעריך את השפעות sublethal של תנאים סביבתיים כמו גם רעלים על בריאות ויעילות ליקוט של דבורי דבש 17.

הליך זה מתאר שתי שיטות משלוח ריח במקביל. שיטת 1 היא גרסה של הריח ומשלוח הגירוי הבלתי מותנה (סוכרוז) שמספק שיטה זולה ופשוטה מבחינה טכנית להצגת הריח וגמול סוכרוז. שיטה זו טובה לטירונות וכאשר האוטומציה אינה אפשרית. זוהי דרך מצוינת להציג את הטכניקה הזו למעבדה כיתה או הוראה. במהלך האוויר לניסויים הכוללים משימות קשות יותר והערכות פיסיולוגיות בשילוב של תפיסת ריח, למידה, או זיכרון, שזה מאוד חשוב ומדויק כדי להסדיר את תחילת, עיתוי מסירת משך הגירויים. למסירת הגירוי אמינה ביותר, להשתמש באמצעי מיכון מסירת הריחnd שיטה מדויקת של מסירת הפרס. שיטה 2 מעסיקה אוטומטי משלוח ריח ומשלוח סוכרוז מדויק יותר. זה מבחינה טכנית מתוחכם יותר ודורש יותר להגדרה הראשונית מ שיטת 1, אבל זה מגדיל באופן משמעותי את העקביות של העיתוי והכמות של גירויים המשמשים לאוויר ויש להשתמש בכל הזדמנות אפשרית.

Protocol

.1 ריח התקנת מחסנית (Stimulus אוויר)

  1. בתחילת הניסוי, מחסניות ריח מרובות התקנה לכל הריחות השונים הנדרשים לניסויי האוויר.
    1. השתמש במנדף לדילול ריח והכנת מחסנית ריח. אף פעם לא בקבוקים פתוחים של ריחות מחוץ לכי מנדף, מאז הריחות יתפשטו במהירות ברחבי המעבדה ואפשרות לחשוף את דבורי דבש לריח לפני האוויר. כמו כן, יש ללבוש כפפות בעת התקנת מחסניות הריח ולשטוף ביסודיות לאחר מכן כדי למנוע חשיפה של דבורי הדבש לריחות בעת הטיפול בהם.
    2. ודא שכל מחסנית ריח שכותרתו עם תווית בצבעים של הריח שנעשה בו שימוש ראשון בצורה ברורה. לעולם אל תשתמש במחסנית ריח (חבית מזרק או בוכנה) לריח יותר מפעם אחת, שכן ייתכן שיש ריח שיורית על המחסנית.
  2. ריחות הכנה ותערובות ריח
    1. לדלל ריחות באו הקסאן או שמן מינרלים לדריכוז esired.
      הערה: לשנות את הריכוז של הריח או הצגת תערובות של שניים או יותר ניחוחי יכול להרשות לחקירה על היבטים נוספים של איך דבורים לחוש ריחות וללמוד את העמותה המותנה. תערובות ריח יכולות להיות פשוט כמו תערובת ינארי 50:50 או מורכבות כמו כמה ריחות המחקים גירויי ריח טבעיים. להקטין את ריכוזיות הריח גם מגדיל את הקושי של המשימה.
      1. ריחות יהפכו מדולדלים עם שימוש חוזר של המחסנית (איור 2). כדי להימנע מבעיות מהדלדול לעשות מספיק מחסניות כדי להיות מסוגל לעבור למחסנית חדשה בכל 10-12 משתמש.
  3. הכנת מחסניות ריח
    1. שיטת 1
      1. לשיטה זו, משתמש ב20 מזרקים פלסטיק מ"ל עם עיגול בקוטר 15 מ"מ של נייר סינון שהוצמד לסוף הגומי של הבוכנה עבור מחסניות ריח.
      2. הסר את הבוכנה מהמזרק ולהשתמש נעץ לצרף חתיכת filteנייר r לסוף הבוכנה.
      3. השתמש micropipette למקום 10 μl של הריח על גבי נייר הסינון, והכנס את הבוכנה לתוך חבית המזרק. לדחוף את הבוכנה לסימן 15 מ"ל בחבית המזרק.
    2. שיטה 2
      1. לשיטה זו, משתמש בזכוכית 1 סמ"ק או מזרקים פלסטיק טוברקולין (או טפטפות שונה של נפח דומה וצורה) עם פס של נייר סינון בתוך וצמצם גומי או סיליקון בקצה הרחב של חבית מזרק למחסניות הריח.
      2. הסר את הבוכנה מחבית מזרק טוברקולין 1 סמ"ק. חבית המזרק תהיה הגוף של מחסנית הריח.
      3. הסר את קצה הגומי השחור מבוכנת המזרק ולחתוך את הקצה הסגור של קצה הגומי.
        הערה: טבעת גומי זה תפעל כצמצם כדי להפחית יניקה מזרימת האוויר בזירה, אשר בטרם עת למשוך ריח מהמחסנית ועל דבורת הדבש המאופקת. לחלופין, צינורות סיליקון (oute 4.8 מ"מקוטר r) חתוך ל5 חלקי מ"מ לעבוד כrestrictors.
    3. יש לשטוף את החלק הפנימי של חבית המזרק וצמצם הגומי / סיליקון עם 70% אתנול (כדי להסיר החלק גדול מהריח שיורית משימוש קודם) ולתת להם להתייבש באוויר.
    4. במקום רצועת 0.2 x 4 סנטימטר של נייר סינון לתוך הפתח הרחב של החבית כך הנייר מרחיב 1-2 סנטימטר מעבר לפתיחה.
    5. השתמש micropipette למקום 3-10 μl של הריח על גבי נייר הסינון מבלי לאפשר לריח לגעת קצה קנה המזרק. קצה פיפטה ניתן לעשות שימוש חוזר לאותו הריח, אך הקפד להשתמש בטיפ טרי להקים את הריח הבא.
    6. הפעל את הפתיחה רחבה של חבית המזרק כלפי מעלה כך נייר הסינון מחליק במהירות לתוך הצינור. הכנס את הצמצם לפתיחה רחבה של חבית המזרק.
      1. ודא שכל מחסנית ריח שכותרתו עם תווית בצבעים של הריח הוא משמש ראשון באופן ברור. לעולם אל תשתמש במחסנית ריח (חבית מזרק או restrictor) לריח יותר מפעם אחת, שכן ייתכן שיש ריח שיורית על זה.
    7. כדור סוף הרקמה נטול מוך, להשרות אותו עם 70% אתנול, ולהשתמש בו כדי לנגב ביסודיות את פני השטח החיצוניים של המחסנית כדי להסיר כל ריח שיורית בצד החיצוני של המחסנית.

.2 איסוף, הרחקה, והאכלת הדבורים

  1. הכנת תקורה הרחקת Bee
    1. הפוך רתמות הרחקה פשוטות לדבורי דבש מקשיות שתייה, צינורות פלסטיק קשיחים, או צינורות מתכת במכונה (כולם כ 0.9 סנטימטר קוטר פנימי ויש לי עובי דופן 1-2 מ"מ). השתמש ברתמות עמידות לנהלים הקשורים לניתוח.
    2. לחתוך 3 חלקי סנטימטר של הצינור. ואז, באופן חלקי לחתוך כמחצית 1 סנטימטר העליון של הרתמה כדי לעשות את זה קל יותר להחזיק את הדבורה במקום בזמן שמהדק את הרתמה.
    3. לחתוך רצועת 0.2 x 6 סנטימטר של סרט דביק וחברו קצה אחד לצד אחד של רתמה דבורה, לאהוינג הקצה השני חופשי.
  2. איסוף דבורים עובדים
    1. לאסוף עובדים מהכניסה למושבה כפי שהם להשהות לפני צאתו מהמושבה או כפי שהם חוזרים מליקוט.
      הערה: הצבת פיסת רשת תיל, עם חורים גדולים מספיק עבור דבורים פועל לזחול דרך, מעל הכניסה מאטה את הפועלים החוזרים למטה ועושה את זה קל יותר לתפוס אותם לפני שהם נכנסים למושבה.
    2. הנח בקבוקון נצנץ מעל הדבורה עד שעף לתוכו. החזק את הבקבוקון עם פתיחתו בצורה אופקית או כלפי מטה ואילו המכסה מהודק כל כך הדבורה לא לטוס עד מתוך הבקבוקון. מקום היחיד שאחד דבורים בכל בקבוקון. ודא שיש מכסה חור בזה כדי לאפשר חילוף גזים נאותים.
    3. לאסוף את הדבורים במהירות כדי לצמצם את הזמן שהם מבלים בבקבוקונים. שמור את צלוחיות עם דבורים בהם בקופסא קטנה בצל.
    4. העבר את התיבה עם הבקבוקונים ודבורים למעבדה, ולמקם את הבקבוקונים לsl קרח מים"'זדרז עד הדבורים מפסיק לנוע. ברגע שדבורה היא נייחת, להסיר את הבקבוקון מהקרח מייד כדי להימנע מחשיפת יתר לקור, ולמקם את הדבורה לרתמה.
      הערה: אנו לא ממליצים על הצבת הדבורים במקרר או במקפיא מכיוון שקשה לעקוב אחר כאשר הדבורים הפכו משותקים, וכתוצאה מכך החשיפה מוגזמת לקור. כאשר רתימה יותר מ -10 דבורים, להעביר רק כמה דבורים לסלארי קרח המים בכל פעם.
  3. ריסון הדבורים
    1. מניחים את הדבורה ברתמה עם הגב שלה בית החזה מול החלק לחתוך משם בצינור וראשה בדיוק מעל החלק העליון של הצינור. לחץ בעדינות על הדבורה הקרובה לצינורות כך איברי הפה שלה לחרוג מעבר לשפה של הצינור. חלק את הרצועה של סרט דבק בין הראש ואת בית החזה בצד הגב של הדבורה ותקיפות לצרף את הקצה החופשי לצד השני של הרתמה.
      1. ודא את הקלטת על רתמת חלקה ומתוח. לא צריך להיות שום NotIפערי ceable בין החלק הקדמי של רתמה דבורים ואת הקלטת, ואת הקלטת צריכים שכבו על החלק העליון של הרתמה. אם יש פערי הדבורה ייתכן שלא תוכל להאריך חוטם שלה כמו שצריך או שהוא עשוי לברוח. כמו כן, ודא הרגליים הקדמיות של הדבורה לא בולטות בין החלק הקדמי של רתמה והסרט הדביק.
  4. האכלת הדבורים וההאכלה לאוויר מרווח
    1. אודות 30 דקות הבאים רתימה - אחרי הדבורים התאוששו מההגדרה הראשונית - להאכיל הדבורים 3-4 μl 0.5 M סוכרוז (במים). סכום זה יספיק למרווח האכלה לאוויר של 3-4 שעות.
      1. באופן כללי, להאכיל 1 μl 0.5 M סוכרוז לכ כל שעה של זמן ההמתנה בין ההאכלה ואוויר, כדי להבטיח את הדבורים לשרוד את המרווח עדיין רעבים מספיק בתחילת האוויר להיות מוטיבציה ללמוד עמותה המותנה. במעבדה כל הזמן בטמפרטורה חמה או אם Uלשיר ריכוז של סוכרוז שונה, להתאים את כמות האכילה או מרווח הזמן בהתאם.
        הערה: עם האכלה למרווח אוויר של 24 שעות, לוודא שכל הדבורים מוזנים לשובע עם 0.5 או 1 M סוכרוז לפחות 24 שעות לפני האוויר יתחיל. בטמפרטורת חדר, דבורים דורשים כ 24 שעות לפני שהם מונעים מספיק כדי להגיב היטב בפרוטוקול אוויר.
        הערה: השתמש בריכוז נמוך יותר של תמיסת סוכרוז להאכלת הדבורים מאשר הריכוז המשמש כגמול במהלך האוויר כדי למנוע את הדבורים מהופכים פחות רגיש לריכוז של סוכרוז שימוש במהלך האוויר, אשר עשוי להפחית את ביצועי למידה 18.
      2. להאכיל את הדבורים באזור הרחק מאזור האימונים. חשיפה לגירוי הבלתי מותנה (סוכרוז) בהקשר האוויר לפני האוויר עשויה להשפיע אוויר לאחר הריח.
    2. במהלך פרק הזמן שבין ההאכלה וגonditioning למקם את הדבורים על השיש באזור שקט של המעבדה, כדי למנוע הפרעה מיותרת. אם המעבדה יש ​​לחות סביבה נמוכות, למקם את הדבורים במכל פלסטיק עם מגבות נייר רטובות במהלך מרווח הזמן. זה מונע התייבשות, שכן הדבורים עלולות למות אם הם נחשפים ללחות נמוכה לתקופות זמן ממושכות.
      הערה: אין לשנות את פרוטוקול הרתימה והאכלה בניסוי! השתמש במרווח זמן מסוים אחד בלבד בין ההקמה והאכלת הדבורים ומתחילים אוויר עבור כל ניסוי כל כך מתייחסים אל הדבורים בדיוק באותו אופן.

.3 אוויר

  1. בדיקה לסוכרוז רגישות
    1. כמה לפני תחילת אוויר דקות, לבדוק את המוטיבציה של הדבורים כדי להאכיל על ידי נגיעה האנטנות שלהם עם טיפה קטנה של 0.5 M תמיסת סוכרוז (אותו הריכוז המשמש במהלך האכלה). אל תאפשר להם להאכיל במהלך בדיקה זו. אם הם מגיבים על ידי extending חוטמם, הם כנראה מספיק מוטיבציה ללמוד ויכולים לשמש לפרוטוקול.
  2. עיצוב ניסוי
    הערה: פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי להתאים מגוון רחב של פרוטוקולי למידה על מנת לחקור היבטים רבים של יכולות הלמידה וזיכרון של דבורים דבש. המרווח בין המשפט, מספר הדבורים המאומנים בכל זמן נתון, מרווח בין גירוי, סוג וריכוז ומספר הריחות, הסוג והריכוז של הגירוי הבלתי מותנה, את המספר ואת הרצף: בין פרמטרים רבים הניתנים לכיוון הם של ניסויים (איור 1; טבלת 1) 19-21. בעת תכנון הפרוטוקול המדויק לכל ניסוי אוויר, זה מאוד חשוב לשמור על המרווח בין המשפט עולה בקנה אחד על פני אנשים. מרווח משפט הבין שהוא קצר מדי, ארוך מדי או לא עקבי יפגע ביצועים של הדבורים. ראה דיון לטיפול מלא של נושא זה.
    הערה: דבורהים ילמד את המשימה במהירות רבה יותר אם הם נמצאים בסביבה חמה. לכן, לשמור על הטמפרטורה של סביבת האימון העקבי וחם (29-30 ° C, אם אפשר).
  3. מספק את ריח (אוויר Stimulus)
    1. שיטת 1
      1. הגדרת מערכת אספקת ריח
        1. הר מזרק 20 מ"ל הפלסטיק עמוס בנייר המסנן שטופל ריח ולכן הוא יציב וסופו של הדבר הקטן פונה ישירות באנטנות של הדבורה. הגדר את הבוכנה בסימן 15 מ"ל ומקם את המזרק כך הבוכנה היא נגישה בקלות.
      2. הצגת Stimulus ריח
        1. בתחילת כל ניסוי, למקם את הדבורה ברתמה על היתד בזירת האוויר עם האנטנות שלה הצביעו ישירות לעבר מחסנית הריח. בואו הדבורה להסתגל לזירה ל15-25 שניות לפני תחילת גירוי הריח להפחתת ההפרעה שנגרמה עקב השינוי הפתאומי בסביבה החזותית שלה במהלך גירוי הריח.
          1. אם הדבורה מתחילה להגיב למחסנית הריח מייד לאחר שהוצב בזירת האוויר, ייתכן שיש ריח בקצה של המחסנית. הסר את ריח זיהום על ידי שטיפה את המחסנית עם רקמה נטולת מוך הטבול ב70% אתנול. אם זה לא פותר את הבעיה, החלף את המחסנית.
        2. לחץ על הבוכנה של המזרק בקצב קבוע כך הבוכנה מדוכאת לחלוטין בתוך 4 שניות. לעקוב אחר התגובה של הדבורה לריח לפני הצגת הגירוי הבלתי מותנה.
        3. בעקבות כל ניסוי, יאפשר הדבורה לנוח בזירת האוויר לעוד שניות 15-25. הזזת הדבורה מוקדם מדי לאחר המשפט יהיה להפחית באופן משמעותי את האפקטיביות של כל ניסוי אוויר.
    2. שיטה 2
      1. הגדרת מערכת אספקת ריח
        1. זרימת אוויר מקור וקצב הזרימה
          1. כזרימת אוויר המקור למסירת ריחלהשתמש משאבת aerator אקווריום או אספקת אוויר דחוס מעבדה ספסל, אם המעבדה מצוידת בזה.
            הערה: משאבת aerator אקווריום טיפוסית תהיה שיעור זרימת אוויר ליד 400 מ"ל / דקה (7 מ"ל / שנייה); על גירוי ריח 4 שניות, 28 מ"ל של אוויר יזרום דרך מחסנית 1 מ"ל.
          2. השתמש במד זרימה בקנה אחד עם צינורות של מנגנון אספקת האוויר לווסת את קצב הזרימה לאספקת האוויר. התאם את מד הזרימה עד קצב הזרימה הוא 400 מ"ל / דקה. בדוק את קצב הזרימה בפתיחת מחסנית הריח עם מד זרימה נפרדת.
          3. חבר את זרימת האוויר למחסנית הריח באמצעות מערכת של צינורות פלסטיק שסתומים.
            הערה: מכשיר העיתוי נדון בהמשך פותח את השסתומים בזמן המתאים במשפט. מחברים פלסטיק לצרף מערכת זרימת האוויר למחסנית הריח באמצעות קובץ מצורף סוג Luer לחבית המזרק של המחסנית.
          4. ללא קשר למקור זרימת האוויר, מעת לעת לבדוק את קצב הזרימה לאמאke בטוח הקו הוא בשלמות ואת קצב הזרימה נשמרת בשיעור הרצוי.
      2. משלוח האוטומטי של ריח
        1. משתמש בבקר היגיון לתכנות (PLC) כדי להפוך את המשלוח של הריח.
          הערה: PLC מתוכנת כדי לפתוח את השסתומים לשניית זרימת אוויר 6 משלוח הריח לאחר שיזם את התכנית (ביוזמת לחיצת כפתור), לשמור את השסתומים פתוחים ל4 שניות, ונשמע אות האכלה נשמעת, באמצעות רמקול קטן, 3 שניות אחרי הופעת גירוי הריח לאותת הניסוי כדי לספק סוכרוז.
        2. השתמש LED קטן כדי לציין את העיתוי של גירוי הריח במהלך כל ניסוי. אם אפשר להשתמש בנורית אדומה, שכן קולטני האור 'הדבורים התרחק מאורכי גל ארוכים יותר [אדומים] וכיוון אורכי גל קצר יותר [UV] ולכן הם לא יכולים לראות את זה גם. מקם את LED מאחור ומתחת לדבורה, מחוץ לשדה הראייה שלהם, כך שהאור לא יהפוך לגירוי שלא במתכוון מותנה.
          הערה: ligגם ht מסייע לוודא שPLC פועל כהלכה והוא שימושי בניתוח הקלטות וידאו של התגובות של הדבורים במהלך ניסויי בדיקה.
      3. מערכת הפליטה
        1. הגדר את מערכת פליטה מאחורי הדבורה כדי לעזור למשוך את אוויר עבר הדבורה ולפנות את אוויר הריח עמוס מזירת האוויר כדי לשמור על מסגרת זמן בדידה עבור כל הצגה של הריח.
          הערה: אם יש מערכת ואקום במעבדה, לשנות את יציאת הוואקום ולצרף צינור של צינורות מייבש לספק זרימת האוויר הדרוש לפינוי זירת האוויר. אם אין מערכת ואקום, מאוורר חשמלי קטן שוכן בקו אחד עם צינורות מייבש הוביל למנדף או דרך חלון יספיק.
      4. בתחילתו של כל יום, לבדוק את חיבורי חשמל ומיזוג של מערכת פליטת מערכת מסירת ריח ו. ללחוץ על הכפתור התחל במערכת אספקת הריח ולעקוב אחר הזמן בין הלחיצה עלכפתור וכאשר השסתומים פתוחים (קליק שקט ואור LED מגיעים ב) וכאשר האות להציג את הגירוי מותנה (צליל נשמע) נשמע. בדוק את אספקת האוויר על ידי הנחת אצבע לחה מול המחבר שיצורף למחסנית הריח. לא צריך להיות זרם אוויר חזק רק כאשר השסתומים פתוחים. בדוק את מערכת הפליטה על ידי החזקת רקמה עד נטול מוך לפתיחת מערכת הפליטה לוודא זרימת האוויר חזקה מספיק כדי לפנות את האוויר כמו שצריך מזירת האוויר.
    3. הרכבה מחסנית ריח
      1. מקום קצת פלסטלינה או על השיש או על פרספקס קטן לעמוד למצב את מחסנית הדבורה וריח ישירות מול מערכת הפליטה. הנח את מזרק ריח זכוכית בחימר ולהתאים אותו כך הפתיחה בסופו של הדבר הרחב הוא הצביע בראשו של הדבורה. הסוף של המזרק צריך להיות 1-2 סנטימטר מהדבורה. בחר מרחק בטווח זה ולהיות קבוע.
      2. באופן מאובטח מקום הראוי המחבר את המחסנית למערכת שסתום בצינור האוויר ועל קצה זכוכית קרקע הצר של המזרק.
    4. הצגת Stimulus ריח
      1. בתחילת כל ניסוי, למקם את הדבורה רתמה על היתד בזירת האוויר עם האנטנות שלה הצביעו ישירות לעבר מחסנית הריח. תן את שאר דבורים בזירה ל15-25 שניות לפני תחילת גירוי הריח כדי לאפשר לו להתרגל לסביבתו החדשה.
        הערה: אם הדבורה מתחילה להגיב למחסנית הריח מייד לאחר שיוצב בזירת האוויר, ייתכן שיש ריח בקצה של המחסנית. הסר את ריח זיהום על ידי שטיפה את המחסנית עם רקמה נטולת מוך הטבול ב70% אתנול. אם זה לא פותר את הבעיה, החלף את המחסנית.
      2. לחץ על לחצן ההתחלה ליזום את מנגנון התזמון למסירת ריח. לעקוב אחר התגובה של הדבורה לריח לאחר גירויתחילתו ולפני הצגת הגירוי הבלתי מותנה.
      3. בעקבות כל ניסוי, יאפשר הדבורה לנוח בזירת האוויר לשניות 15-25 נוספת כדי לאפשר להיווצרות זיכרון ראשונית. הזזת הדבורה מוקדם מדי לאחר המשפט יהיה להפחית באופן משמעותי את האפקטיביות של כל ניסוי אוויר.
  4. אספקת סוכרוז (הבלתי מותנה Stimulus)
    1. שיטת 1
      1. לשיטה זו, להשתמש בקיסם כדי לספק סוכרוז.
        הערה: עדיף להשתמש בקיסם פלסטיק מאז קיסמי העץ יכולים להיות ריח שישפיע תגובות של הדבורים לגירוי המותנה.
      2. טובלים את הקצה של הקיסם לתוך תמיסת סוכרוז, ו, כאשר הגיעו זמן להציג את הגירוי הבלתי מותנה, להחזיק את הקיסם מול הדבורה ולאפשר הדבורה ללקק סוכרוז מהקיסם לכ 1 שניות.
      3. החלף את הקיסם באופן קבוע כדי למנוע הצטברות של sucrose.
    2. שיטה 2
      1. מערכת אספקת סוכרוז
        הערה: דרך מדויקת יותר, כדי לספק את הגירוי הבלתי מותנה היא באמצעות שימוש במזרקי מיקרומטר, אשר באופן מדויק יכולה לספק כמויות קטנות (עשיריות microliter) של גמול סוכרוז.
        1. בסופו של מיקרומטר של המזרק בחזרה ככל האפשר. טען את חבית מזרק מיקרומטר עם תמיסת סוכרוז. ודא שאין בועות בחלק הזכוכית ולהרכיב את המזרק. מלא את הרכזת של המחט עם תמיסת סוכרוז לפני הצבתו על הקצה הצר של חבית המזרק. כדי לוודא שהנוזל במחט הוא למעשה סוכרוז ולא מים משטיפת המחט, בסופו של מיקרומטר קדימה 1-2 μl לפני תחילת הניסוי.
    3. מצגת סוכרוז
      1. החזק את קצה המחט כ 2 סנטימטר מהדבורה ואילו הריח מוצג. השתמש בקצה של זירת אימונים כדי למנועלוחץ את המזרק כתנועה יכול להסיח את דעתו הדבורה. אל תבין את המחט קרובה מדי בציפייה לאות ההאכלה, מאז שגם בטרם עת להסיט את תשומת הלב של הדבורה מהריח לסוכרוז.
      2. ברגע שאות ההאכלה נשמעת, בקלילות לגעת באנטנות עד הדבורה משתרעת חוטם שלה, לאחר מכן להאכיל את הדבורים. זה צריך לדרוש רק אור מאוד מגע או שניים לאנטנות.
        1. השתמש בכמות גמול בין 0.2 ו0.8 μl. הדבורה צריכה בקלות לצרוך כל הטיפה בתוך תקופת הזמן המוקצב לגירוי הבלתי מותנה (~ 1-2 שניות). אין להשתמש "כרצונך מודעה" האכלה מאגל גדול, שהדבורה נזון במשך כמה שניות, אבל לא יכולה לצרוך לחלוטין.
        2. Watch עבור סוכרוז לבנות על האנטנה, אשר תקטין את התגובה של הדבורה למצגות הבאות של הגמול. לשנות את הליך ההאכלה אם זה קורה.
        3. כדי להבטיח התאמה מדויקת של הריחקיו וגמול סוכרוז, לוודא להציג הטיפה של תמיסת סוכרוז לדבורה בהקדם האפשרי לאחר את הטון.
          הערה: תזמון בין הופעת CS (ריח) וארה"ב (סוכרוז) הוא קריטי. באופן אידיאלי, מצגת הריח והצגת סוכרוז צריכה חפיפה קצרה. אם יותר מכמה שניות לחלוף בין סוף CS והאספקה ​​של ארה"ב, ביצועי אוויר יקטנו.

.4 בדיקה

  1. בעקבות ניסויי מבחן unreinforced שימוש אוויר כדי להעריך כמה טוב הדבורים למדו ו / או זוכר את העמותה המותנה.
    הערה: ראה את הדיון להסבר מפורט של החשיבות של ניתוח "תגובות לניסויים מבחן unreinforced בנוסף לדבורים 'דבורי ביצועים בניסויי האוויר והסבר על המטרה של מספר ניסויי מבחן וריחות מבחן.
  2. איחוד זמן
    1. הבאאוויר, או לנהל משפט מבחן מיידי או לאפשר הדבורים לנוח בתקופה איחוד.
      הערה: אורכה של תקופת האיחוד, את מרווח הזמן בין האוויר ובדיקה, תהיה תלויה במטרת הניסוי. אם המטרה היא לחקור הבדלי למידה או זיכרון לטווח קצר, ביצועים של הדבורים על ניסויי מבחן ניתן להעריך באופן מיידי הבאים או כמה שעות אחרי האוויר. אם הניסוי כרוך בחקירת זיכרון לטווח ארוך, יש לתת הניסויים לפחות בדיקת 24 שעות לאחר תום האוויר.
    2. אם ניסויי המבחן יותר מ 24 שעות הבאות אוויר, להאכיל את הדבורים לשובע עם 0.5 M סוכרוז הבא אוויר ולפחות פעם ביום לאחר מכן עד 12-24 שעה לפני ניסויי המבחן.
      1. כדי לוודא שהדבורים הגיעו שובע, להאכיל את כל אחד מהם מספר פעמים שונות עד שהם כבר לא להאריך חוטמם בתגובה לנגיעת האנטנה שלהםE עם סוכרוז. הם יכולים לצרוך ככל 40 μl להגיע שובע.
    3. שמור את הדבורים במכל humidified כדי למנוע desiccating והגוסס שלהם בתקופת האיחוד.
  3. ניסויים מבחן
    1. השתמש במחסניות ריח רק מוכנות עתה לבדיקה.
      הערה: המחסניות משמשות לרכישה יכולה להיות מדולדלת באופן דיפרנציאלי, כך גירוי המבחן לא יהיה עקבי בניסויים, ריחות, ודבורים בודדים, ולכן, באופן משמעותי עלולים להשפיע על העקביות והיציבות של התוצאות.
    2. במהלך בדיקה, לשמור על אותו המרווח בין המשפט ופרמטרים נוספים המשמש בשלב האוויר של הניסוי.
    3. אל תציג את הגירוי הבלתי מותנה במהלך ניסויי מבחן, שכן הנוכחות של גמול תשנה תגובה של הדבורים לגירוי המותנה, שעלול להיות מיסוך השפעות עדינות יותר של פרוטוקול האוויר או טיפול.
    4. רשומות קטעי וידאו של כל of ניסויי המבחן כדי להיות מסוגל לאחר מכן למדוד היבטים רבים תגובות של הדבורים לריח (ים).

.5 הקלטת התגובות של הדבורים

  1. בינארי (נוכחות / היעדרות) ניקוד של PER
    1. השתמש בשיטת ניקוד בינארי של PER במהלך ניסויי אוויר ובמהלך ניסויי בדיקה. ציון תגובות כחיוביים או שלילי; זה מניח את הדעת לסוגים רבים של ניתוחים עם גודל מדגם של 20-40 דבורים לקבוצת טיפול. הטופולוגיה המדויקת של תגובות יכולה להיות מורכבת 22. זה חשוב להקים קל לראות ולהבקיע קריטריון לתשובה חיובית.
      1. ציון התגובה של דבורה כחיובי (+) כאשר הדבורה משתרעת חוטם שלה מעבר לקו שנעשה על ידי חיבור קצות הלסתות נפתחו. להבקיע רק תשובה חיובית כאשר הדבורה משתרעת חוטם שלה לאחר הופעת ריח אבל לפני הריח לקזז.
      2. ציון התגובה של דבורה כשלילית (-) כאשר אין דוארxtension של חוטם במהלך המשפט או אם חוטם מוארך ולאחר קיזוז odorant.
      3. הימנע מנסה להבקיע תגובות חלקיות. לעשות הבחנות עדינות בהתנהגות של הדבורים, להשתמש בטכניקת ניתוח וידאו המפורטים להלן.
  2. ניתוח וידאו של מדידות לכל נוספות (סרט 1)
    1. לאסוף מידע נוסף מבדיקות התנהגות על ידי ניתוח קטעי וידאו של התגובות של דבורה לריח.
      הערה: מדידות אלה גם יכולות לספק פתרון זמני גבוה יותר לבדיקה של התגובות של הדבורים לריחות, במיוחד כאשר אין הבדל בניקוד נוכחות / היעדרות של PER בין קבוצות טיפול.
    2. הקלטת הווידאו
      1. השתמש תמיד בניסויי מבחן או הכחדת unreinforced להקלטות וידאו. הנוכחות של הגמול תשנה תגובה של הדבורים לריח, שינוי משך הארכת חוטם.
      2. הגדר את מצלמת וידאו על חצובה מעל לזירת האימונים ולמקד את המצלמה בחזית ראשו של הדבורה, כך האנטנות וחוטם הם בפוקוס חד.
      3. מקם את אור LED הקטן, דבר המצביע על מצגת גירוי ריח, באזור שמאחורי הדבורה שנראה בווידאו על מנת להשתמש בו כדי לזהות תחילת ריח וקזז במהלך ניתוח.
      4. להתחיל בהקלטת 20 שניות לפני תחילת ריח ולהמשיך להקליט לפחות 20 שניות אחרי הריח לקזז לפני להפריע הדבורה.
    3. ניתוח וידאו
      1. העלה את הסרטונים לתוכנת עריכת וידאו, כמו iMovie או Pro Final Cut, עם היכולת של מדידת מרווחי זמן בין מסגרות ספציפיות בווידאו.
      2. לנתח תגובה של הדבורים לריח לתקופה זמן בדיד מתחילה בתחילת גירוי הריח (למשל, 10 או 20 שניות).
      3. השתמש במדידות משותפות הבאות להערכת PER:
        1. מדוד אתמשך הארכת חוטם, שהוא הזמן הכולל שהחוטם משתרע מעבר לקו הלסת התחתונה ללסת תחתונה (שתואר לעיל).
          הערה: דבורה רשאית להאריך ולחזור בו חוטם שלה מספר רב של פעמים במהלך חלון זמן 10-20 שניות. למדוד כל הרחבה חוטם בנפרד, ולחשב את משך הזמן הכולל. מניתוח המספר ומשך הזמן של כל הארכת חוטם בודדת יכול גם לספק מידע רב ערך.
        2. מדוד את זמן האחזור של הארכת חוטם, שהוא הזמן בין תחילת ריח, כאשר אור LED מגיע ב, והארכת חוטם הראשונה.
        3. רוזן וסיומות הזמן Glossal ביחס לתחילתה של odorant, ההארכה הראשונה, או פרמטרים עיתוי אחרים.
        4. לעקוב אחר תנועות מחושים 23, שגם מראות שינויים בכיוון ריח אופייניים.
          הערה: בסרט 1, תנועות מחושים כבר מעקב עם תוכנת מעקב וידאו כדי להמחיש את השינוי בתנועות מחושים iתגובת n לגירוי ריח.

Representative Results

אנו מציגים שתי דוגמאות לשימוש בפרוטוקולי PER שתוארו לעיל. השימוש הראשון שנעשה דוגמא לשיטה 2 ללמוד איך דבש דבורים תופסים ריחות שונים כפונקציה של הדמיון המולקולרי לריח משמשים כCS 5,24,25. השני הוא דוגמא לשימוש בשיטת 1 וחלק מאמצעי הזהירות שיש לנקוט כאשר מתחילים להשתמש בPER ניסויי אוויר במעבדת המחקר.

מחקרים כגון זה היה בשימוש כדי לתאר את 'המרחב תפיסתי "חוש הריח של דבורי דבש ועשים בשיתוף עם bioimaging 13 או אלקטרו מנתח 26. דבורי דבש (n = 20) הותנו לשייך odorant decanal עם חיזוק סוכרוז מעל 12 ניסויים קדימה זיווג אוויר (איור 3 א). כ 10% מדבורי הדבש הגיבו באופן 'ספונטני' במשפט הראשון, וזה נורמלי. לאחר שהאחוז שresponded להגדיל לאורך כמה הניסויים הבאים עד של דבורי דבש 100% השיבו במשפט החמישי וכל משפט שלאחר מכן. מספר מחקרים הראו כי עלייה זו בתגובה ספציפית למצב קדימה זיווג (איור 1) ביחס למספר תהליכי בקרה החשוב 3. לאחר שלב הרכישה, כל דבורת דבש הייתה נתון לסדרה של ניסויי מבחן unreinforced (איור 3 ב), שהייתה כרוכות בחשיפה לריח CS וכמה הניחוח אחר כי באופן שיטתי שונים מCS במבנים מולקולריים. דבורי דבש הגיבו חזק ביותר לCS. התגובות שלהם לניחוחי האחר ירדו כפונקציה של השינויים שיטתיים במבנה, עם התגובות הנמוכים ביותר לניחוחי לפחות כמו CS.

באיור 4, תוצאות מסדנה האחרונה שבו למדו תלמידים, בפעם הראשונה, איך להתנות דבורי דבש באמצעות שיטת 1 מומחש. עצי אשוח סטודנטים t מותנה דבורי דבש על ידי methycyclohexanone קדימה זיווג (MCH) או octanol (אוקטובר) עם חיזוק סוכרוז (איור 4 א). תגובות אחוזים היו נמוכות יותר במשפט הראשון ועלו על ניסויים שלאחר מכן, מצביעים על כך שהדבורים למדו עמותת ריח סוכרוז. היו הבדלים במידה שהדבורים למדו העמותה המותנה על פני הקבוצות השונות של תלמידים. מניסיוננו, סוגים שונים של הבדלים אלה יכולים להיות בגלל הריח ששימש כCS, לאלמנטים לא מדויקים בשיטה (שיטת 1), או לרמת האימון של הנסיינים. במקרה השלישי, ביצועים יהיו עקביים יותר עם הניסיון המוגבר של הנסיינים במהירות. אחרי האוויר, כל דבורת דבש נבדקה פעמיים עם כל ריח. בקבוצות של דבורי דבש שהתנו עם זיווג קדימה של אוקטובר או MCH, התגובה הייתה, כצפוי, החזק ביותר לריח המותנה (איור 4).

אף אוזן גרון "> הקבוצה השנייה של דבורי דבש שחוו קדימה זיווג עד אוקטובר הותנתה במקביל לקבוצה אחרת שבה הריח אוקטובר הוצמד לאחור עם סוכרוז. זיווג לאחור הוא אחד מכמה סוגים של נהלי בקרה על מנת להוכיח כי העלייה בתגובה הוא ספציפי להעברת זיווג ולא בשל תהליך אחר, כגון עוררות שאינן ספציפיות מרגישות. לזיווג לאחור, ארה"ב סוכרוז והריח CS מוצגות בסדר הפוכים למה שמוצג באיור 1. נתוני רכישה מהזיווג לאחור הם לא מוצג משום CR לא יכול להיות בקיע נתן ההצגה של הריח CS לאחר המצגת של סוכרוז. כפי שניתן היה לחזות לאוויר אסוציאטיבי, רמות התגובה עד אוקטובר היו גבוהות יותר בקדימה לזווג קבוצה ביחס לקבוצה לאחור (איור 4C).

"Width =" 7fig1highres.jpg 500 "/>
איור 1 תרשימים של עיצוב ניסיוני לאוויר באמצעות קדימה זיווג. ראה לוח 1 להגדרות של המונחים המשמשים בנתון זה. CS (הריח) () מקדים וחפיפה עם ארה"ב (פתרון / מים סוכרוז). מערכת היחסים בין CS וארה"ב הראו הוא אופטימלית עבור דבורי דבש אוויר ועשים. אבל ISI האופטימלית יכולה לסמוך על מיני פרוטוקול האוויר ובעלי חי 1. התפלגות (B) ותזמון יחסי של CS, CR, ארה"ב, וUR. CR שמתרחש גם לפני המצגת בארה"ב או בניסויי 'מבחן' unreinforced הוא המדד התלוי לפרוטוקולי ניסוי.

איור 2
איור 2 דלדול ריח עם שימוש חוזר של מחסניות. לנתונים אלה, מחסניות ריח היוהגדרה עם hexanol כפי שמתואר בטקסט. Hexanol משמש בדרך כלל כCS במחקרי PER; עם זאת, השיעור בפועל של דלדול יהיה תלוי בריח והממס. מחסניות אז שמשו בעבר ל4 שניות בכל דקה מעל 8 ניסויים (בהנחת 5 דבורי דבש / משפט בניסוי סטנדרטי, שיהיה שווה 40 שימושים). דילולים בממס המצוין, שהיו סטנדרטיים עבור ניסויי PER יחסית, היו 2.0 M () ו0.2 M (B). (A, B) הריח ידגם לאחר הראשון והניסויים שמיני על ידי ספיחה על שלב מוצק סיבי Microextraction (SPME) שהיה אז desorbed על גז כרומטוגרף. האזורים יחסית תחת הפסגות היו גבוהים יותר לאחר המשפט יחסי הראשון השמיני לשני ממסים ועבור שני הריכוזים (Wilcoxon התאמת זוגות p מבחן דרגה חתם <0.05 [*] או יותר), מה שמראה שפחות ריח נמסר מהמחסנית לאחר שהמחסנית הייתה בשימוש מספר הפעמים. (C, D) אותו נתונים המראים רק את TR השמיני IAL עם ציר y המורחב. זה מראה שהדלדול היה מעט גדול יותר עבור הקסאן ביחס לשמן מינרלים, אבל רק בריכוז נמוך יותר.

איור 3
איור 3 רכישה ובדיקה באמצעות decanal כCS ושיטת 2 לאוויר. (א) ניסוי על ידי משפט תגובה (CR) על 12 ניסויים קדימה זיווג (איור 1). הנתונים הם מתוך דבורי n = 20 דבש מותנה בארבע קבוצות של 5 דבורי דבש בכל. ISI הייתה 3 שניות וITI היה 6 דקות. (ב ') בדיקות unreinforced באמצעות ריחות שונים מdecanal על ידי אורך שרשרת פחמן ו / או מיקום של פחמן קרבוניל. הריחות הוצגו בסדרה אקראית בין ארבע הקבוצות ותובלו עם ניסויים חיזקו עם (כל שעות עד שלושה ניסויים) decanal על מנת למנוע הכחדה של CR.

e_content "FO: לשמור-together.within-page =" תמיד "> איור 4
איור 4 נתונים מסדנה שבמהלכו תלמידים לתארים הוכשרו להתנות דבורי דבש באמצעות PER שיטת .1 הנתונים () רכישה משלוש קבוצות של דבורי דבש מותנים octanol (n = 23 ו15 ל1 Gps ו -2, בהתאמה) וmethylcyclohexanone (n = 10) (ב) CRS במהלך בדיקות unreinforced עם שני הריחות.; ארבעה ניסויים שהוצגו בסדרה אקראית על פני קבוצות. (C) בדיקות unreinforced עם שני הריחות בשתי קבוצות של דבורי דבש, אחד לזווג קדימה (1 Gp, n = 23) ואחד לזווג לאחור (n = 25).

טווח (קיצור) הגדרה דוגמא רלוונטית
Stimulus אוויר (CS) גירוי שמעורר תגובה קטנה או לא בהתחלה ומסמן לנו ריח
תגובה מותנית (CR) התגובה לCS לאחר שיתוף עם ארה"ב חוטם הארכה
הגירוי הבלתי מותנה (ארה"ב) גירוי ביולוגי משמעותי שמעורר תגובה סוכרוז / פתרון מים
תגובה הבלתי מותנית (UR) התגובה לארה"ב חוטם הארכה
Inter-Stimulus Interval (ISI) הזמן בין תחילתה של CS ותחילתה של ארה"ב ריח למרווח סוכרוז
מרווח בין המשפט (ITI) הזמן בין זוגות CS-US הרצופים לחיה אחת ריח (n משפט) לריח (n משפט + 1) מרווח

טבלת 1 Important טרמינולוגיה. עיין באיור 1 להמחשה של מושגים אלה. לPER אוויר CR וUR הם אותו הדבר, אם כי עבור סוגים אחרים של עמותות ורפלקסים CR וUR עשוי להיות שונה.

סרט 1. וידאו של דבורת דבש ביצוע PER לאחר שזה התנה להגיב לריח. שים לב לתגובת PER של הדבורה כ 1.5 שניות הבאות תחילת ריח. תוכנת מעקב ממופה תנועות מחושים בתגובה למצגת של הריח. הקווים זממו בפינה הימנית העליונה של הווידאו מתארים את תנועות מחושים בפועל. שני גרפים בחלק התחתון של תנועות מחושים מופע מסך על X (משמאל) וY (מימין) קואורדינטות. הקווים האנכיים בגרף ניתן לראות בסרטון מצביעים, משמאל לימין, על אור, PER, להדליק את וחוטם הכחשה.

Discussion

פרוטוקול זה הוצג שתי שיטות אמינות לאוויר באמצעות הליך PER. אלה הם שניים ממספר שיטות שכבר מועסקות 27, 21 בהצלחה. אנו מעסיקים שיטה 2 לכל מחקרים הניסיוניים באמצעות PER כפי שהוא אמין באופן עקבי, אפילו על פני הנסיינים שונים.

אותו ההליך בסיסי הותאם לסוגים רבים ושונים של לימודים עם דבורי דבש, ובכלל זה שימוש בגירויי אוויר שונים ורפלקסים התנהגותיים שונים. זה גם קשור לחקירות של הבסיס הגנטי של הבדלים בלמידת 28,29, הקושרת הפיזיולוגית של תפיסת חוש הריח וזיכרון במוח 13,14,30, והבסיסים הגנטיים modulatory והמולקולרי של התנהגות 15,16,31 . בגלל הידע המתקדם של רלוונטיות האקולוגיות של למידת חוש הריח לדבורי דבש, שהחל עם המחקרים הראשונים על ידי קרל פון פריש לפני למעלה 100 שנים 17.

ההליך הבסיסי הוא חזק בכך שהוא יכול להיות מיושם על לחקור בעיות במינים אחרים, כמו גם. שני מיני עש, סקסטה Manduca וlittoralis Spodoptera, היו בשימוש במחקרי PER לחקור את הבסיס העצבי של זיהוי ריח ויכולות למידת חוש הריח של כל מיני 32,33. ניסויי PER עם זבובי פירות סיפקו תובנות רבות למפלי איתות המולקולריים המעורבים בchemosensation ולמידת 34. וPER לאחרונה נעשה שימוש כדי ללמוד הרגלה בפשפשים (prolixus Rhodnius) 35, וקטור מחלה חשוב.

באופן כללי, ההליך הוא חזק לשינויים בשיטה; השימוש בדשיטות ifferent צפויות לייצר את אותו הבדל יחסי בין קבוצות טיפול. למרות ההליך פשוט יחסית, כמה בעיות יכולות לעתים למנוע דבורי דבש מלימוד עמותת ריח סוכרוז. הנושאים הבאים הם שינויים אפשריים בפרוטוקול וחלק מהבעיות הנפוצות יותר שעלולה להתעורר במהלך PER אוויר.

שיקולים במספר וסוג של ניסויים בפרוטוקול אוויר

כל פרוטוקול למידה ידרוש חשיפה של הדבורים למספר הניסויים בשלב הרכישה. מספר זה תלוי במידה רבה על הקושי של המשימה. דבורי דבש יכולים ללמוד משימה פשוטה לאחר משפט בודד, אבל הם צריכים לפחות שלושה ניסויים כדי לגרום להיווצרות זיכרון לטווח ארוך. כצפוי, דבורי הדבש ידרשו יותר באופן משמעותי ניסויים כדי ללמוד כראוי משימה קשה. באופן כללי, יש מספר מרבי של ניסויים שמעבר לו הדבורים כבר לא לשפר באופן משמעותי אתביצועי ir. מקסימום, זה תלוי במשימה הספציפית, סוגי הריח והריכוזים, וריכוז סוכרוז.

בעת שימוש בסוג אחד או יותר של משפט עם ריחות שונים, יציג את הסוגים השונים משפט ברצף פסוודו לשמור דבורים מלשנן רצף פשוט של מצגות ריח במקום ללמוד את ההבדלים בין הריחות 36. ברצפי פסוודו אלה, חייבים להיות מספר שווה של ניסויים עבור כל אחד מסוגי הריח. כמו כן, ההסתברות למשפטו של סוג ריח אחד שקדמה ואחריו אותו הריח, או כל אחד מהריחות האחרים, חייב להיות שווה לכל הריחות. לשני ריחות - וB - להשתמש ברצף הבא: ABBABAAB. למעלה משמונה ניסויים כל ריח מוצג ארבע פעמים. לשרשר רצפים זהים להגיע למספר הרצוי של ניסויים עבור כל ריח.

ללא קשר לעיצוב ניסיוני, יש כמה פרמטרים שחייבים להישארקבוע על מנת לייעל את הלמידה. החפיפה בין CS וארה"ב היא קריטית לאוויר יעיל. המרווח בין המשפט (איור 1, טבלת 1) צריך להיות קבוע ולהיות מותאם בגלל אי תקינותו או מרווח בין משפט קצר מדי או ארוך מדי באופן משמעותי יכולה להשפיע על היעילות של פרוטוקול האוויר 1.

שיקולים בחשיבותה ועיצוב של ניסויים בדיקות התנהגותיות

תגובות שנרשמו במהלך 'שלב הרכישה' של ניסוי, כאשר CS וארה"ב מוצגים יחד, יכולות להיות שימושיות. עם זאת, צריך להיזהר שתנאי מצגת ריח יכולים להיות שונים מסוג אחד של משפט למשנהו. במהלך ניסויים חיזקו, הריח ואחריו סוכרוז מוצג בשיתוף עם גירוי חזותי (תנועה של המכשיר להעברת אגל סוכרוז) שיכול להשפיע על התגובה של הדבורה. ויש לי הדבורים רק שלוש שניים כדי להראות תגובה (ארבע שניות של גירוי ריח מינוס החפיפה השנייה אחת עם מצגת סוכרוז; איור 1). אם הניסוי כרוך בדבורים לומדים להבחין בין שני ריחות (לדוגמא, חיזק וunreinforced), ריח unreinforced הציג בניסויים חלופיים מתרחש ללא הגירוי החזותי של מצגת השכר ויש לי הדבורים ארבע שניות מלאים להגיב. לכן, התגובות לשני ריחות לא ניתן להשוות באופן מלא במהלך רכישה. עם כל פרוטוקול אוויר, לא להסתמך אך ורק על עקומות רכישת 1. עדיף לברר מה דבורים למדו, להציג סדרה של ניסויי מבחן unreinforced, שבמהלכו לא ריח מתחזק, אשר מבטיחה כי בדיקה של כל הגירויים מתרחשת בתנאים זהים.

בהתאם לצורך הספציפי של הניסוי, בדיקה יכולה להיות מורכבת מניסויי בדיקה אחת של הריח המותנה או סדרה של ניסויים עם od המותנהאו או שילוב של הריחות הממוזגים ורומן. משפט בדיקה אחת של הריח המותנה מספק assay פשוט של האם הדבורים "זוכרים את ריח מזגן. עם זאת, התגובה לניסוי המבחן הראשון עשויה לשקף רמת המוטיבציה של הדבורים, כמו גם הזיכרון שלהם של הריח המותנה. סדרה של ניסויי מבחן, או סדרה של ניסויי הכחדה של הריח המותנה או סדרה של בדיקות יחידים של מותנה וריחות אחד או יותר רומן, יכולה לשמש גם כדי להעריך זיכרון. הסדרה של ניסויי הכחדה יכולה להעריך באיזו עצמה הדבורים "זוכרים את העמותה המותנה. זוכר חזק המספר הגדול יותר של ניסויים הדרושים כדי לכבות את התגובה המותנה. סדרה של בדיקות יחידים של ריחות מותנים ורומן יכולה גם להעריך את הספציפיות הזיכרון של הדבורים של הריח המותנה.

זה גם הכרחי להתנות ולבדוק את שניהם שליטה וקבוצות שטופלו באותה נקודות זמן. Comparing הביצועים של דבורים קצרים לאחר אוויר לדבורים שנערכו לתקופות זמן ארוכות יותר הוא בעייתי בגלל החשיפה לארה"ב סוכרוז על ידי האכלת הדבורים לשובע. לדוגמא, ירידה בביצועים לאחר מרווחי זמן ארוכים יכולה להיות בגלל ריקבון זיכרון או שזה יכול להיות כתוצאה משינויים במצב מוטיבציה ו / או למידה הנגרמים על ידי חשיפת unreinforced לארה"ב, מה שהופך את התוצאות מעורפלות. לכן, ביצועים של קבוצת טיפול תמיד צריכים להישפט ביחס לקבוצת ביקורת ממוזגת ונבדקה באותו נקודות הזמן.

ריכוז ריח ויושרה

ישנן מספר דרכים שבהן ניתנים לפריצה בריכוז וביושרה של הריח (CS). הבעיה הנפוצה ביותר עם ​​משלוח ריח היא הדלדול של מחסניות ריח משימוש יתר (איור 2). החלפת המחסניות 10-12 שימושים (כל 2 או 3 ניסויים עם קבוצות של 5 דבורי דבש), כדי למנוע מכשול זה. כמו כן, חשוב להשתמשמחסניות טריות לניסויי מבחן, מאז מחסניות משומשות עשויות להיות מדולדלים באופן דיפרנציאלי וגירויים ריח לא שוויוניים וכך הווה. בעיה נוספת נפוצה היא זיהום מחסנית ריח בשל שימוש במחסנית לריח יותר מפעם אחת בלי לנקות אותו לחלוטין. זרימת אוויר מלוכלכת או מזוהם יכולה גם שלא בכוונה להציג את גירוי חוש הריח נוסף (מסנני פחם פעילים יכולים למנוע זיהום ברקע). זה בעייתי במיוחד כאשר צימוד PER אוויר עם מדידות של התגובות הפיזיולוגיות לריח. מחסניות ריח דולפות להוות בעיה שכן דבורי הדבש חשופים ללהריח לפני תחילת המשפט, אשר מפחית את הבולטות של גירוי הריח. רפוי על אספקת האוויר למסירת ריח יכול לגרום למסירת ריח מעט או ללא כאשר השסתום נפתח, באופן מלאכותי צמצום התגובה של הדבורים לריח נועד.

פתרון סוכרוז וStimulus הבלתי מותנה (זכתה)

הר, ריכוז, ויושרה של תמיסת סוכרוז משמש כארה"ב הם חיוניים להצלחה של הניסוי. אוויר הוא פונקציה של הכמות והריכוז של תמיסת סוכרוז מים משמש כארה"ב 37. המזרקים מיקרומטר בשימוש בשיטה 2 מאפשרים שליטה מדויקת מאוד (עד 0.2 μl) של משלוח בארה"ב, ואנו ממליצים להשתמש בהם לשתי השיטות שתוארו. שימוש בקיסמי השיניים (שיטת 1) הוא מספק לנסיבות שבהן לא ניתן להשתמש במזרקים היקרים, כגון, באימון קבוצות גדולות של תלמידים, עבודה בתחום, או עם תקציבים נמוכים יותר. יישום קפדני של שיטת 1 הוא בסדר כל עוד תזמון נשמרים עם החלפה סדירה של קיסמים כדי למנוע הצטברות של סוכרוז (והריכוז נמסר). עם זאת, שימוש בקיסמי שיניים קשה יותר לשלוט באופן מדויק ולהעריך את הכמות וסדר הגודל של ארה"ב נמסר, וזה חשוב ללימודי אוויר 1. הריכוז של סוכרוז צריךלספק תגמול מספיק כדי לשמור על דבורי מוטיבציה ללמוד העמותה המותנה יכול לסמוך על הקושי של המשימה והמצב הפנימי של הדבורים או הזמן של שנה. המשימות קשות יותר דורשות פתרון סוכרוז גבוה יותר עבור דבורים ללמוד את המשימה בהצלחה. הצטברות עובש יכול בפתרונות סוכרוז אפילו בשעה 5 ° C, אשר תפגע ביושרה של הפתרון, המשפיעה על הבריאות והתפיסה של הגמול של הדבורים במהלך הניסוי. עדיף להחליף את הפתרון בכל כמה ימים.

Precision, תזמון, ועקביות של משלוח CS וארה"ב

הנושא הקריטי ביותר על יישום נכון של הליך PER, או לצורך העניין כל הליך אוויר, כרוך דיוק, עיתוי ועקביות של CS ומשלוח בארה"ב (איור 1). חוקרים שאינם חדשים להליך לעתים קרובות אינם מדויקים על משלוח של גירויים אחד או שניהם. ISI שלשייכשל, כדי לאפשר חפיפה CS וארה"ב לגרום לביצועי אוויר גרועים. PLC ממכן אות קולית לניסוי כדי לספק סוכרוז שניות 3 לאחר תחילת אספקת ריח. חוקרים צריכים להחזיק סוכרוז / המים הטיפה קרובה לדבורה למסירה מהירה לאחר האות. נהלים אלה מסייעים לעלות לרכבת ISI עקבית. הצבת שעון עצר על ידי זירת האוויר מאפשרת מיקום זמן נוח של המשפט, כמו גם ניטור בזמן של הדבורים בזירה לפני ואחרי המסירה של גירויים. בדרך זו ITI של יכולה להיות עקבית יחסית וההליך כולו ניתן להריץ בקצב מבוקר. ITI של כי הם קצרים מדי, למשל דקות פחות מ 1, או יותר מדי זמן יכול להוביל לביצועי אוויר גרועים 1.

השפעות עונתיות, סביבתיות, וקשר בדבש דבורת ביצועים

הביצועים של דבורים דבש יכולים להיות מושפעים באופן משמעותי על ידי סביבתושניהם לפני ובמהלך האוויר. לעתים קרובות, התנודות בזמינות טמפרטורה ומזון שמגיעות עם העונות המתחלפות תשנה את המוטיבציה של הדבורים ללמוד. כאשר הפרחים פורחים, המוטיבציה של הדבורים ללמוד העמותה המותנה במעבדה מקטינה 38. כאשר המושבה הדגישה - מטמפרטורות קיצוניות, מחסור במזון, או מתח הקשורים למחלות - הדבורים "יציגו ירידה בביצועי הלמידה שלהם בפנים. דבורי דבש נשמרו בטיסת חדר עשוי ללמוד גם לזמן מה, אבל גם שם הלחץ של מחלה והזדקנות לפגוע בביצועי הלמידה שלהם לאורך זמן. ההקשר במהלך האוויר יכול גם לפגוע בביצועים של הדבורים. כל ריחות זרים, תנועה, וגירויים אחרים יכולים להסיח את דעת הדבורה מהגירויים הניסיוניים. כדי להימנע מבעיה זו, לשמור על עקבי סבירה הקשר חזותי פשוט,.

גנוטיפ והניסיון משפיע על פי ביצועים

<p class = "jove_content"> עובדי דבורת דבש יכולים להיות שונים במידה ניכרת בביצועים בכל הליך אוויר בשל התמחות משימה, גנוטיפ, או גורמים סביבתיים אחרים 20. לכן, חשוב לבצע סטנדרטיזציה, עד כמה שניתן, את הסוגים של בעלי חיים המשמשים בניסוי על מנת לצמצם וריאציה בין פרט. במושבה בראשות מלכה-הזדווגו פתוח, מה שאומר שהיא הזדווגו עם מזל"טים רבים ושונים, העובדים יהיו שונים בגנוטיפ האבהי. רקע גנטי יכול להוביל להבדלים דרמטיים בהיענות חושית 39 ולמידת ביצועים 29. שימוש במושבות בראשות המלכות מופרות אינסטרומנטאלית על ידי זרע ממזל"טים בודדים 28 מפחיתה וריאציה בין אדם זה.

הפרוטוקולים שתוארו לעיל, כוללים שיטה לאיסוף עובדי דבורת דבש מהכניסה הקן. עם זאת, דבורי דבש אלה שונים זה מזה בכל קשור לגיל או משימה התנהגותית. הם עשויים להיות צעירים (inexperienCED) או מלקטי מזון מבוגרים (יותר מנוסים). הם עשויים להיות דבורי דבש צעירים מה שהופך את טיסות הנטייה הראשונות שלהם. או שהם עשויים להיות דבורי משמר. כדי להקטין את השונות, סמנו את הדבורים עם צבע אמייל מהיר ייבוש או תגי סימון או כפי שהם עולים כמבוגרים (כדי לשלוט על גיל) ו / או כפי שהם מתחילים ליקוט (כדי לשלוט על ניסיון). ואז, כמה ימים מאוחר יותר, לאסוף את הדבורים הניכר לאוויר. עובדים שעוסקים בסיעוד התנהגות ניתן לאסוף מהמסגרות בתוך הכוורת. אחיות יכולות להיות מזוהות באופן חיובי כאשר הם מכניסים את ראשם לתוך תא קינון כדי להאכיל ולדאוג לזחל פנימה.

שימוש הבתולה קווינס או מזל"טים לPER אוויר

בנוסף לדבורי דבש עובד, מלכות דבורי דבש בתולה ומזל"טים יכולים להיות מותנים בקלות בהליך PER ללימודים במטרה לפתח קווים גנטיים של דבורי דבש שונים בלמידת ביצועים 28. מלכות הבתולה יש לאסוף מייד לאחר הey לצאת מהתגלמות וממוקם ישירות לתוך רתמות הרחקה ללא הרדמה. מזל"טים צעירים, לא בשלה שנאספו מהמסרק להרהר בתוך המושבה הם בדרך כלל לא מוטיבציה ללמוד. אחרי שהם החלו הזדווגות טיסות, מזל"טים בקלות ללמוד משימות PER 28. הם צריכים להיות שנאספו כפי שהם חוזרים מטיסת הזדווגות ומתוחזק לילה בכלוב קטן במושבה המשמשת לגידול מלכות. אל תנסה לרתום אותם ביום שלפני האוויר; הם אינם שורדים היטב בלילה רתמות. כמה שעות לפני האוויר יכולים להיות שנאספו מכלובי מזל"טים והניחו לתוך רתמות ההרחקה ללא הרדמה.

מסקנות

הליך PER זה, בדרך של שיטות, מסתכם לסך של נקודה מוצא לתכנון ניסויי PER. רוב פרוטוקולי PER ידרשו כי ההליך המתואר להיות שונה באופן כלשהו כדי ליישם את היעדים הספציפיים של הניסוי וaccommodatקבוצות טיפול מרובה דואר. זה קל ליישום. עם זאת, יישום נכון דורש תשומת לב לפרטים ותרגול. ברגע שמשתלט עליו זה יכול להיות הליך רב עוצמה כדי להוסיף ככלי מחקר לכמה תוכניות מחקר בסיסיות והיישומים עם מיני חרקים שונים.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מימון מNIH NCRR (R01 RR014166 לBHS), NIH NIDCD (R01 DC011422 BHS שיתוף PI), משרד החקלאות האמריקאי (J טרמבל PI; BH סמית שיתוף PI) והאוניברסיטה של ​​מדינת אריזונה. מימון לסדנה להכשרת תלמידים (נתונים באיור 4) הניתן על ידי הקרן הלאומית למדע של צ'ילה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose Sigma-Aldrich S9378-1KG
Odorant Compounds (for example)
    1-hexanol Sigma-Aldrich 471402-100ML For additional examples
    2-octanone Sigma-Aldrich W280208-800G-K of odorants, see any of
    heptanol Sigma-Aldrich 51778-5ML the papers on olfactory
    gerianol Sigma-Aldrich 163333-25G processing from the
    nonanal Sigma-Aldrich 131210-100ML Smith lab.
Hexane Sigma-Aldrich 296090-1L
Heavy mineral oil Sigma-Aldrich 330760-1L Make sure it’s odorless.
Ethanol Sigma-Aldrich 459836-1L
Scintillation vials Sigma-Aldrich Z190535-1PAK Use a small drill bit to bore a small hole in the cap of the vials.
Bee harness Custom-made from 0.9 cm diameter plastic soda straws or hard plastic/metal tubing.
Duct tape
Kimwipes Sigma-Aldrich Z188956-1PAK
Wash bottles Sigma-Aldrich Z560847-3EA For the 70% ethanol.
Dryer tubing
FOR METHOD 1 ONLY
20 ml disposable plastic syringes Cole-Parmer WU-07945-18
15 mm filter paper circles Sigma-Aldrich Z274844-1PAK
Pushpins
Toothpicks
FOR METHOD 2 ONLY
Gilmont Micrometer syringe, 0.2 ml Cole-Parmer EW-07840-00
Gilmont micrometer syringe tip Cole-Parmer EW-07841-00
26 G 3/8” Leur hub hypodermic needles Fisher Scientific 14-826-10
1 cc tuberculin syringes (plastic/glass) Sigma-Aldrich Z181641-1EA OR Z192090-200EA Glass tuberculin syringes are available, but plastic syringes are much less expensive and will work well for a limited number of uses.
Small rubber/silicone restrictors Cole-Parmer EW-95702-02 Made from 4.8 mm outer diameter silicone tubing or the rubber tips of the 1 cc syringe plungers.
Name Company Catalog Number Comments
Parafilm Sigma-Aldrich P7793-1EA
75 x 100 mm filter paper Sigma-Aldrich Z695106-500EA
Direct Logic 05 Programmable Logic Controller Koyo Electronics Industries Co, Ltd
1 mm, 4 mm, & 6 mm inner diameter PVC or silicone tubing Cole-Parmer Various Cole-Parmer has a wide selection of suitable tubing.
Polypropylene connectors & leur fittings Cole-Parmer Various Cole-Parmer has a wide selection of connectors and fittings for many tube sizes.
65 mm Correlated Flowmeter Cole-Parmer EW-03216-08 Aluminum with glass float; for liquids and gases, with valve.
OR
Tetra Whisper 300 (Tetratek DW96-2) Aquarium Air Pump Aquacave AE-TETRA-300
LIF series Solenoid Valves for .042 " ID Tubing, Configuration "E" The Lee Company LFAA1200118H Neoprene, 430 SS, 302 SS, 280 mW
PC-Board 12VDC 70dB Piezo Buzzer RadioShack 273-074

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rescorla, R. A. Behavioral studies of Pavlovian conditioning. Annu Rev Neurosci. 11, 329-352 (1988).
  2. Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).
  3. Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera). Journal of Comparative Psychology. 97, 107-119 (1983).
  4. Giurfa, M., Sandoz, J. C. Invertebrate learning and memory: Fifty years of olfactory conditioning of the proboscis extension response in honeybees. Learn Mem. 19, 54-66 (2012).
  5. Smith, B. H., Wright, G. A., Daly, K. S. The Biology of Floral Scents. Dudareva, N., Pichersky, E. , CRC Press. 263-295 (2006).
  6. Menzel, R., Giurfa, M. Dimensions of cognition in an insect, the honeybee. Behav Cogn Neurosci Rev. 5, 24-40 (2006).
  7. Kuwabara, M. Bildung des bedingten Reflexes von Pavlovs Typus bei der Honigbiene, Apis mellifera. Journal of the Faculty of Science, Hokkaido University, Zoology. 13, 458-464 (1957).
  8. Menzel, R. The honeybee as a model for understanding the basis of cognition. Nat Rev Neurosci. 13, 758-768 (2012).
  9. Menzel, R. Neurobiology of comparative cognition. Kesner, R. P., Olton, D. S. , Lawrence Erlbaum. 237-292 (1990).
  10. Hammer, M., Menzel, R. Learning and memory in the honeybee. Journal of Neuroscience. 15, 1617-1630 (1995).
  11. Strube-Bloss, M. F., Nawrot, M. P., Menzel, R. Mushroom body output neurons encode odor-reward associations. J Neurosci. 31, 3129-3140 (2011).
  12. Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in kenyon cells of the honeybee mushroom body. Front Syst Neurosci. 2, (2008).
  13. Fernandez, P. C., Locatelli, F. F., Person-Rennell, N., Deleo, G., Smith, B. H. Associative conditioning tunes transient dynamics of early olfactory processing. J Neurosci. 29, 10191-10202 (2009).
  14. Locatelli, F. F., et al. Nonassociative plasticity alters competitive interactions among mixture components in early olfactory processing. Eur J Neurosci. 37, 63-79 (2013).
  15. Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. Journal of Neuroscience. 23, 5370-5380 (2003).
  16. Mussig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. J Neurosci. 30, 7817-7825 (2010).
  17. Hladun, K. R., Smith, B. H., Mustard, J. A., Morton, R. R., Trumble, J. T. Selenium toxicity to honey bee (Apis mellifera L.) pollinators: effects on behaviors and survival. PLoS One. 7, e34137 (2012).
  18. Wiegmann, D. D., Smith, B. H. International Journal of Comparative Psychology. 22, 141-152 (2009).
  19. Drezner-Levy, T., Shafir, S. Parameters of variable reward distributions that affect risk sensitivity of honey bees. J Exp Biol. 210, 269-277 (2007).
  20. Drezner-Levy, T., Smith, B. H., Shafir, S. The effect of foraging specialization on various learning tasks in the honey bee (Apis mellifera). Behavioral Ecology & Sociobiology. 64, 135-148 (2009).
  21. Shafir, S., Menda, G., Smith, B. H. Caste-specific differences in risk sensitivity in honeybees, Apis mellifera. Animal Behaviour. 69, 859-868 (2005).
  22. Smith, B. H., Menzel, R. An analysis of variability in the feeding motor program of the honey bee; the role of learning in releasing a modal action pattern. Ethology. 82, 68-81 (1989).
  23. Erber, J., Pribbenow, B., Kisch, J., Faensen, D. Operant conditioning of antennal muscle activity in the honey bee (Apis mellifera L). Journal of Comparative Physiology A-Sensory Neural & Behavioral Physiology. 186, 557-565 (2000).
  24. Smith, B. H., Menzel, R. The use of electromyogram recordings to quantify odorant discrimination in the honey bee, Apis mellifera. Journal of Insect Physiology. 35, 369-375 (1989).
  25. Stopfer, M., Bhagavan, S., Smith, B. H., Laurent, G. Impaired odour discrimination on desynchronization of odour-encoding neural assemblies. Nature. 390, 70-74 (1997).
  26. Daly, K. C., Christensen, T. A., Lei, H., Smith, B. H., Hildebrand, J. G. Learning modulates the ensemble representations for odors in primary olfactory networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 10476-10481 (2004).
  27. Matsumoto, Y., Menzel, R., Sandoz, J. C., Giurfa, M. Revisiting olfactory classical conditioning of the proboscis extension response in honey bees: a step toward standardized procedures. J Neurosci Methods. 211, 159-167 (2012).
  28. Chandra, S. B., Hosler, J. S., Smith, B. H. Heritable variation for latent inhibition and its correlation with reversal learning in honeybees (Apis mellifera). Journal of Comparative Psychology. 114, 86-97 (2000).
  29. Chandra, S. B., Hunt, G. J., Cobey, S., Smith, B. H. Quantitative trait loci associated with reversal learning and latent inhibition in honeybees (Apis mellifera). Behavior Genetics. 31, 275-285 (2001).
  30. Hammer, M. The neural basis of associative reward learning in honeybees. Trends in Neurosciences. 20, 245-252 (1997).
  31. Frisch, K. The Dance Language and Orientation of Bees. , Harvard University Press. (1965).
  32. Daly, K. C., Smith, B. H. Associative olfactory learning in the moth Manduca sexta. J Exp Biol. 203, 2025-2038 (2000).
  33. Fan, R. J., Anderson, P., Hansson, B. Behavioural analysis of olfactory conditioning in the moth spodoptera littoralis (Boisd.) (Lepidoptera: noctuidae). J Exp Biol. 200. 23 (Pt 23), 2969-2976 (1997).
  34. Paranjpe, P., Rodrigues, V., VijayRaghavan, K., Ramaswami, M. Gustatory habituation in Drosophila relies on rutabaga (adenylate cyclase)-dependent plasticity of GABAergic inhibitory neurons. Learn Mem. 19, 627-635 (2012).
  35. Vinauger, C., Lallement, H., Lazzari, C. R. Learning and memory in Rhodnius prolixus: habituation and aversive operant conditioning of the proboscis extension response. J Exp Biol. 216, 892-900 (2013).
  36. Smith, B. H., Abramson, C. I., Tobin, T. R. Conditional withholding of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera) during discriminative punishment. Journal of Comparative Psychology. 105, 345-356 (1991).
  37. Smith, B. H. An analysis of blocking in odorant mixtures: an increase but not a decrease in intensity of reinforcement produces unblocking. Behav Neurosci. 111, 57-69 (1997).
  38. Gerber, B., et al. Honey bees transfer olfactory memories established during flower visits to a proboscis extension paradigm in the laboratory. Animal Behaviour. 52, 1079-1085 (1996).
  39. Rueppell, O., et al. The genetic architecture of sucrose responsiveness in the honeybee (Apis mellifera L). Genetics. 172, 243-251 (2006).

Tags

Neuroscience גיליון 91 PER אוויר דבורת דבש olfaction עיבוד חוש הריח למידה זיכרון assay רעלן
תגובת פרוטוקול חוטם הרחבה לחקירת פלסטיות התנהגות בחרקים: בקשה ליסוד, ביו רפואית, ומחקר חקלאי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smith, B. H., Burden, C. M. A… More

Smith, B. H., Burden, C. M. A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research. J. Vis. Exp. (91), e51057, doi:10.3791/51057 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter