Summary

Blinddarm-Ligation und Punktion-induzierten Sepsis als Modell zur Autophagie in Mäusen untersucht

Published: February 09, 2014
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Summary

Experimentelle Sepsis in Mäusen mit der Blinddarm-Ligation und Punktion (CLP)-Methode ausgelöst werden. Aktuelle Protokolle Autophagozytose in vivo im Rahmen des CLP-induzierten Sepsis beurteilt werden hier vorgestellt: Ein Protokoll für die Messung unter Verwendung Autophagozytose (GFP)-LC3 Mäuse und ein Protokoll für die Messung Autophagosom Bildung durch Elektronenmikroskopie.

Abstract

Experimentelle Sepsis in Mäusen mit der Blinddarm-Ligation und Punktion (CLP)-Methode, die Sepsis verursacht polymikrobiellen induziert werden. Hier wird ein Protokoll vorgesehen, um Sepsis unterschiedlichen Schweregrades in Mäusen zu induzieren mit der CLP Technik. Autophagie ist ein Grundgewebereaktion auf Stress und Krankheitserreger Invasion. Zwei Stromprotokollen zu Autophagozytose in vivo im Rahmen des experimentellen Sepsis beurteilen sind auch hier vorgestellt. (I) Transgene Mäuse, grün fluoreszierendes Protein (GFP)-LC3-Fusionsprotein exprimieren, werden CLP unterworfen. Lokalisierten Erhöhung der GFP-Signal (puncta), entweder durch immunhistochemische Assays getestet oder konfokalen kann verwendet werden, um verbesserte Bildung Autophagosom erfassen und somit verändert Aktivierung der Autophagie werden. (II) Verbesserte autophagischen Vakuole (Autophagosom)-Bildung pro Einheit Gewebebereich (als Marker der Autophagie Stimulation) kann mit Hilfe der Elektronenmikroskopie quantifiziert werden. Das Studium der Autophagie Antworten auf Sepsis ist eine kritische Layoutonent Verständnis der Mechanismen, durch die Gewebe reagieren auf eine Infektion. Forschungsergebnisse in diesem Bereich kann letztendlich zum Verständnis der Pathogenese der Sepsis, die ein großes Problem in der Intensivmedizin stellt beitragen.

Introduction

Sepsis, eine systemische entzündliche Reaktion auf eine Infektion, eine der häufigsten Todesursachen bei kritisch-kranken Patienten ein. Intra-abdominale Infektionen, die oft polymikrobiellen Sepsis führen, entfallen 20% der Sepsisfälle, die erhebliche Sterblichkeit von bis zu 60% 2 haben. Sepsis-assoziierte Mortalität resultiert im Wesentlichen aus Multi-Organ-Dysfunktion mit anschließender Organversagen 3,4. Weitere Untersuchungen in den Pathomechanismus dieser Erkrankung ist dringend erforderlich, um die Entwicklung neuer und wirksamere Therapien zu fördern.

Die Blinddarm-Ligation und Punktion (CLP)-Methode ist ein häufig verwendetes Verfahren zur Modellierung von Sepsis in vivo. Wie der Blinddarm ist voll von Bakterien, seiner Punktion ergibt polymikrobiellen Peritonitis, Translokation von Bakterien in das Blut (Bakteriämie), septischer Schock, Multi-Organ-Dysfunktion und schließlich Tod 5. Es ist allgemein anerkannt, daß CLP reflektiert klinischenRealität genauer als frühere Verfahren, wie Injektion von Endotoxin oder gereinigten Bakterien in Nagetieren Somit CLP wird als Goldstandard (wenn auch nicht ohne Einschränkungen) 6 für die experimentelle Induktion und somit die Untersuchung der Pathogenese von Sepsis. In dieser Monographie, beschreiben wir Protokolle entwickelt, um zu beurteilen, ob pathogene Mechanismen der Sepsis sind Autophagie.

Autophagy eine evolutionär konservierte zelluläre Prozess erleichtert den Umsatz von beschädigten Proteinen und Organellen, wie Mitochondrien und spielt eine wichtige Rolle bei der Clearance von intrazellulären Pathogenen wie Bakterien 7,8. Während Autophagozytose sind cytosolische Proteine ​​oder Organellen in die Doppelmembran-Vesikel gebunden genannt autophagosomes, die anschließend zu den Lysosomen zum Abbau 9 geliefert werden abgetrennt. Eine Reihe von Proteinen, wie den Säugerhomologen Autophagozytose-Genen (ATG) identifiziert,ursprünglich in der Hefe, die den Prozess der Autophagie regulieren identifiziert. Die Umwandlung von Mikrotubuli-assoziierten Protein-1-Leichtketten-3B (LC3B) (Homolog Atg8) aus LC3B-I (freie Form) zu LC3B-II (Phosphatidylethanolamin-konjugierter Form) stellt einen wichtigen Schritt in Autophagosom Bildung 9. Autophagische Dysfunktion ist mit dem Altern und der menschlichen Krankheiten, darunter Krebs und neurodegenerativen Erkrankungen 10 zugeordnet. Darüber hinaus wirkt sich die Autophagie angeborenen und erworbenen Immunität, wie Antigen-Präsentation, Lymphozytenentwicklung und Zytokin-Sekretion von Immunzellen 8. So scheint es sinnvoll, dass die Autophagie könnte auch in der systemischen Entzündungsreaktion auf eine Infektion (zB bei Sepsis) eine Rolle spielen.

Bisher mehrere Verfahren beschrieben worden, um die Rolle der Autophagie in Gewebeverletzung in vivo zu beurteilen. Dazu gehören der Einsatz der grünen Fluoreszenz-Protein (GFP)-LC3 exprimierenden Mäusen und die Quantifizierung der AutoPhagosomen in Gewebe durch Elektronenmikroskopie (Diese beiden Verfahren werden in dieser Monographie beschrieben). Weitere Methoden sind die Quantifizierung von Autophagie-Protein-Expression in Gewebehomogenaten, und die Analyse der Autophagie Fluss (wie an anderer Stelle beschrieben), 11-13. Das Ziel dieser Überprüfung ist es, für die Beurteilung der aktuellen Protokolle Autophagie in vivo im Rahmen der experimentellen Sepsis.

Protocol

Hinweis: Die Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss am Brigham and Womens Hospital / der Harvard Medical School Raums zugelassenen die folgenden Verfahren. 1. Blinddarm-Ligation und Punktion Verwenden Mäusen des gleichen Hintergrund (C57Bl / 6), männlich, 8-10 Wochen alt. Weibliche Mäuse sind widerstandsfähiger als Männer gegen die Sepsis-induzierten Letalität. Mäuse älter als 8 Wochen produzieren weniger unterschiedliche Ergebni…

Representative Results

Bakteriämie bei Mäusen vorhanden ist, so früh wie 6 Stunden nach der CLP-induzierten Sepsis 14. Klinische Zeichen einer Sepsis (einschließlich Schüttelfrost, Tachypnoe und eingeschränkte motorische Aktivität) erscheinen etwa 12 Stunden nach dem Eingriff. Mäuse CLP unterworfen beginnen bei rund 18 Stunden nach Induktion der Peritonitis sterben. Je schwerer ist die Sepsis die mehr erhöht ist die Letalität 15. Im Detail führt hochwertige Sepsis 100% Mortalität innerhalb von 2-3 Tagen, wäh…

Discussion

Der große Vorteil des CLP ist, dass es erlaubt Forschern, Sepsis unterschiedlicher Schweregrade (dh von Low-bis Mid-und High-grade) zu untersuchen. Der Schweregrad der induzierten Sepsis wird durch die Länge der Blinddarm ligiert (was die wichtigste Determinante) betroffen, die Größe der Nadel für die Punktion verwendet, und die Anzahl der Löcher 15 durchgeführt. Darüber hinaus kann die Maus-Stamm und Geschlecht von der Schwere der Sepsis beeinflussen; mehrere Stämme sind anfälliger als and…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse HL108801 P01, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, AMK Choi unterstützt. S. Ryter erhielt Unterstützung von der Gehalts Lovelace Respiratory Research Institute.

Materials

GFP-LC3 Transgenic Mice Riken (Japan) RBRC00806 GFP-LC3#53
Xylazine Henry-Schein 568-0606 Xylazine HCl Injection Vet
Ketamine Henry-Schein 995-2949 Ketaset Inj 100 mg/ml
EtOH Fisher A405-20 Histology Grade
EtOH Fisher A407-1 For Sterilizatiion
silk surgical sutures 6-0 Owens & Minor 2300-0078OG, 017624
buprenorphine-HCl Henry-Schein 614-5157 Buprenex Ampules
paraformaldehyde (37%) solution JT Baker S898-09
xylenes Fisher X3P-1GAL
anti-GFP monoclonal antibody Life Technologies G10362
Hoescht Sigma 944403
DAPI Invitrogen D1306
OCT VWR scientific 25608-930
Sudan Black Santa Cruz sc-203760
EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate Electron microscopy Sciences 15960
propylene oxide Sigma 240397
Agar 100 resin Agar scientific R1045
dodecenylsuccinic anhydride Sigma 46346
methylnadic anhydride Sigma 45359
N-benzyldimethylamine Sigma 185582

References

  1. Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. The pathology and treatment of sepsis. N. Engl. J. Med. 348, 138-150 (2003).
  2. Anaya, D. A., Nathens, A. B. Risk factors for severe sepsis in secondary peritonitis. Surg. Infect. 4, 355-362 (2003).
  3. Bone, R. C., Grodzin, C. J., Balk, R. A. Sepsis: A new hypothesis for pathogenesis of the disease process. Chest. 112, 235-243 (1997).
  4. Rivers, E., Med, s. h. o. c. k. .. N. .. E. n. g. l. .. J. .., et al. Early goal-directed therapy in the treatment of severe sepsis and septic shock. N. Engl. J. Med.. 345, 1368-1377 (2001).
  5. Deitch, E. A. Rodent models of intra-abdominal infection. Shock. 24 (Suppl 1), 19-23 (2005).
  6. Raven, K. Rodent models of sepsis found shockingly lacking. Nat. Med. 18, 998 (2012).
  7. Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
  8. Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10, 461-470 (2009).
  9. Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
  10. Choi, A. M., Ryter, S. W., Levine, B. Autophagy in human health and disease. N. Engl. J. Med. 368, 651-662 (2013).
  11. Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7, 629-642 (2011).
  12. Chen, Z. H., et al. Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease. PLos One. 3, 3313 (2008).
  13. Kim, H. P., Chen, Z. H., Choi, A. M., Ryter, S. W. Analyzing autophagy in clinical tissues of lung and vascular diseases. Meth. Enzymol. 453, 197-216 (2009).
  14. Flierl, M. A., et al. Adverse functions of IL-17A in experimental sepsis. FASEB J. 22, 2198-2205 (2008).
  15. Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nat. Protoc. 4, 31-36 (2009).
  16. Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140, 313-326 (2010).
  17. Wang, L., Ma, R., Flavell, R. A., Choi, M. E. Requirement of mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MKK3) for activation of p38α and p38δ MAPK isoforms by TGF-β1 in murine mesangial cells. J. Biol. Chem. 277, 47257-47262 (2002).
  18. Ding, Y., Kim, J. K., Kim, S. I., Na, H. J., Jun, S. Y., Lee, S. J., Choi, M. E. TGF-{beta}1 protects against mesangial cell apoptosis via induction of autophagy. J Biol Chem. 285, 37909-37919 (2010).
  19. Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94, 331-335 (1983).
  20. Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis. J. Surg. Res. 102, 45-49 (2002).
  21. Carchman, E. H., Rao, J., Loughran, P. A., Rosengart, M. R., Zuckerbraun, B. S. Heme oxygenase-1-mediated autophagy protects against hepatocyte cell death and hepatic injury from infection/sepsis in mice. Hepatology. 53, 2053-2062 (2011).
  22. Lo, S., et al. Lc3 over-expression improves survival and attenuates lung injury through increasing autophagosomal clearance in septic mice. Ann. Surg. 257, 352-363 (2013).

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Siempos, I. I., Lam, H. C., Ding, Y., Choi, M. E., Choi, A. M. K., Ryter, S. W. Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice. J. Vis. Exp. (84), e51066, doi:10.3791/51066 (2014).

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