Deneysel sepsis çekal ligasyon ve delme (CLP) yöntemini kullanarak farelerde neden olabilir. CLP kaynaklı sepsis bağlamında in vivo Otofaji değerlendirmek için mevcut protokoller burada sunulmuştur: (GFP)-LC3 fareler kullanılarak Otofaji ölçülmesi için bir protokol ve elektron mikroskobu ile autophagosome oluşumunu ölçmek için bir protokolü.
Deneysel sepsis çekal ligasyon ve delme polimikrobiyaldir sepsis neden olur (CLP) yöntemini kullanarak farelerde neden olabilir. Burada, bir protokol CLP tekniği kullanılarak farelerde değişen şiddetinin sepsis uyarılması için sağlanmaktadır. Autophagy stres ve patojen istilası için temel bir doku tepkisi olduğu. Deneysel sepsis bağlamında in vivo değerlendirmek için iki Otofaji mevcut protokoller de burada sunulmaktadır. (I), yeşil flüoresan protein (GFP)-LC3 füzyon proteini ifade eden transjenik farenin CLP tabi tutulur. GFP sinyali (puncta) lokalize geliştirme, imünohistokimyasal veya konfokal tahlilleri yoluyla analiz edilmiş olarak, gelişmiş autophagosome oluşumunu algılamak ve, otofaji yolu bu nedenle, değiştirilmiş aktivasyon için kullanılabilir. (Autophagy stimülasyon bir göstergesi olarak) birim doku alanı başına (II) Geliştirilmiş otofajik küçük boşluk (autophagosome) formasyonu elektron mikroskobu kullanılarak belirlenebilir. Sepsise otofajik yanıtların çalışma kritik bir compdokular enfeksiyona yanıt hangi mekanizmaları anlamada onent. Bu alandaki araştırma bulguları sonuçta kritik bakım tıpta önemli bir problem teşkil etmektedir sepsis patogenezi, anlamaya yönelik katkıda bulunabilir.
Sepsis, enfeksiyona sistemik inflamatuvar yanıt, eleştirmenlerce hastalarda 1 ölüm önde gelen nedeni temsil eder. Genellikle polimikrobiyaldir sepsise yol açan karın içi enfeksiyonlar,% 60 kadar 2 önemli mortaliteye sahip olan, sepsis vakalarının% 20 için hesap. Sepsis-ilişkili mortalite öncelikle sonraki organ yetmezliği 3,4 ile çoklu organ disfonksiyonu kaynaklanır. Bu hastalığın patojenik mekanizması içine ek araştırma acil, yeni ve daha etkili tedavilerin gelişmesini teşvik etmek gereklidir.
Çekal ligasyon ve delme (CLP) yöntemi in vivo modelleme sepsis için yaygın olarak kullanılan bir işlemdir. Sonuçta çekum bakteri dolu olarak, polimikrobial peritonit onun ponksiyon sonuçları, kan (bakteriyemi) içine bakteri translokasyonu, septik şok, çoklu organ yetmezliği ve ölüm 5. Genellikle CLP klinik yansıttığı kabul edilmektedirdaha doğru gibi kemirgenler içine endotoksin ya da saflaştırılmış bakterilerin enjeksiyonu gibi daha önceki tekniklere göre daha gerçeklik Böylece, CLP sepsis patogenezinde soruşturma dolayısıyla, deneysel indüksiyon için 6 (değil sınırlamalar olmadan da olsa) altın standart kabul edilir ve. Bu monografi, biz sepsis patojenik mekanizmaları Otofaji dahil olup olmadığını değerlendirmek için tasarlanmış protokolleri açıklar.
Autophagy, evrimsel olarak muhafaza edilmiş hücre işlem olup, hasar görmüş proteinlerin ve mitokondri gibi organel ciro kolaylaştırır ve bakteriler de dahil olmak üzere hücre içi 7,8 patojenlerin temizlenmesinde önemli bir rol oynar. Otofaji sırasında sitosolik proteinler organeller ya da sonradan bozulması 9 lizozomlara teslim edilir autophagosomes olarak adlandırılan iki membran-sınırlayıcı kabarcıklar içine tecrit edilir. Bir dizi protein autophagy-ilişkili genlerin memeli homologları (ATG) olarak tespit edilmiştir,ilk Otofaji süreci düzenleyen maya içinde tespit edilmiştir. LC3B-I (serbest form) için mikrotübül-ilişkili protein 1 hafif zincir 3B (LC3B) (Atg8 of homologu) dönüşümü (fosfatidiletanolamin-konjuge form)-II LC3B için autophagosome oluşumu 9 önemli bir adımı temsil eder. Otofajik fonksiyon bozukluğu, yaşlanma ve kanser ve nörodejeneratif bozukluklar 10 de dahil olmak üzere, insan hastalıkları ile ilişkilidir. Ayrıca, otofaji bağışıklık hücreleri 8 antijen sunumu, lenfosit geliştirme ve sitokin sekresyonu gibi doğal ve adaptif bağışıklık etkiler. Böylece, otofaji da enfeksiyona sistemik inflamatuvar yanıt (yani sepsis) bir rol oynayabileceğini söyledi makul görünüyor.
Bugüne kadar çeşitli yöntemler in vivo doku hasarında Otofaji rolünü değerlendirmek için tarif edilmiştir. Bu yeşil floresan protein (GFP)-ifade LC3 farelerin kullanımı ve oto miktarının dahilelektron mikroskobu ile dokuda phagosomes (bu iki yöntem bu monografi açıklanmıştır). Ilave yöntemler doku homojenatlarında otofajik protein ifadesinin miktarının, ve (başka bir yerde tarif edildiği gibi) otofajik akı analizi 11-13 içerir. Bu incelemenin amacı, deneysel sepsis bağlamında in vivo değerlendirilmesi için mevcut Otofaji protokolleri sağlamaktır.
CLP büyük avantajı araştırmacıların (düşük-orta ve yüksek sınıftan itibaren yani) farklı ağırlıktaki sepsis araştırmak için izin vermesidir. Neden olduğu sepsis şiddeti bağlanmış çekum uzunluğu (en önemli belirleyicisi) etkilenir, delme için kullanılan iğne boyutu ve deliklerin sayısı 15, gerçekleştirilir. Buna ek olarak, fare suşu ve cinsiyet sepsis şiddetine etkileyebilir; çeşitli suşlarının diğerlerine göre daha hassastır ve genellikle erkek kadınlarda…
The authors have nothing to disclose.
GFP-LC3 Transgenic Mice | Riken (Japan) | RBRC00806 | GFP-LC3#53 |
Xylazine | Henry-Schein | 568-0606 | Xylazine HCl Injection Vet |
Ketamine | Henry-Schein | 995-2949 | Ketaset Inj 100 mg/ml |
EtOH | Fisher | A405-20 | Histology Grade |
EtOH | Fisher | A407-1 | For Sterilizatiion |
silk surgical sutures 6-0 | Owens & Minor | 2300-0078OG, 017624 | |
buprenorphine-HCl | Henry-Schein | 614-5157 | Buprenex Ampules |
paraformaldehyde (37%) solution | JT Baker | S898-09 | |
xylenes | Fisher | X3P-1GAL | |
anti-GFP monoclonal antibody | Life Technologies | G10362 | |
Hoescht | Sigma | 944403 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
OCT | VWR scientific | 25608-930 | |
Sudan Black | Santa Cruz | sc-203760 | |
EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate | Electron microscopy Sciences | 15960 | |
propylene oxide | Sigma | 240397 | |
Agar 100 resin | Agar scientific | R1045 | |
dodecenylsuccinic anhydride | Sigma | 46346 | |
methylnadic anhydride | Sigma | 45359 | |
N-benzyldimethylamine | Sigma | 185582 |