يمكن أن يتسبب الإنتان التجريبية في الفئران باستخدام ربط الأعور وثقب (CLP) الأسلوب. يتم عرض البروتوكولات الحالية لتقييم الالتهام الذاتي في الجسم الحي في سياق الإنتان CLP التي يسببها هنا: بروتوكول لقياس الالتهام الذاتي باستخدام الفئران (GFP) LC3، وبروتوكول لقياس تشكيل جسيم بلعمي ذاتي بواسطة المجهر الإلكتروني.
يمكن أن يتسبب الإنتان التجريبية في الفئران باستخدام ربط الأعور وثقب (CLP) الأسلوب، الذي يسبب تعفن الدم متعدد المكروبات. هنا، يتم توفير بروتوكول للحث على الإنتان متفاوتة الخطورة في الفئران باستخدام تقنية CLP. الالتهام الذاتي هو استجابة الأنسجة للإجهاد الأساسية وغزو الممرض. وتعرض اثنين من البروتوكولات الحالية لتقييم الالتهام الذاتي في الجسم الحي في سياق الإنتان التجريبية أيضا هنا. (I) يتعرضون الفئران المعدلة وراثيا معربا عن البروتين البروتين مضان أخضر (GFP) LC3 الانصهار لCLP. تعزيز المترجمة من إشارة GFP (نقاط و)، ويعاير إما عن طريق المقايسات المناعية أو متحد البؤر، ويمكن استخدامها للكشف عن تشكيل جسيم بلعمي ذاتي معزز، وبالتالي، وتفعيل غيرت من مسار الالتهام الذاتي. (II) تعزيز فجوة ذاتية البلعمة (جسيم بلعمي ذاتي) تشكيل الأنسجة في منطقة حدة (كعلامة من التحفيز الالتهام الذاتي) يمكن قياسها كميا باستخدام المجهر الإلكتروني. دراسة الاستجابات ذاتية البلعمة لهو تسمم شركات حرجةonent من فهم الآليات التي الأنسجة الاستجابة للعدوى. نتائج البحوث في هذا المجال يمكن أن تسهم في نهاية المطاف نحو فهم الآلية المرضية للتسمم، وهو ما يمثل مشكلة كبيرة في مجال الطب والرعاية الحرجة.
الإنتان، والاستجابة الالتهابية الجهازية للإصابة، يمثل السبب الرئيسي للوفاة في مرضى حاسمة من سوء 1. التهابات داخل البطن، وغالبا ما يؤدي إلى تعفن الدم متعدد المكروبات، تمثل 20٪ من حالات الإنتان، والتي لها معدل وفيات كبيرة تصل إلى 60٪ 2. الوفيات المرتبطة الإنتان النتائج في المقام الأول من اختلال وظيفي متعدد الجهاز مع فشل الجهاز اللاحقة 3،4. وهناك حاجة للمزيد من التحقيق في آلية المسببة للأمراض من هذا المرض على وجه السرعة لتعزيز تطوير علاجات جديدة وأكثر فعالية.
أسلوب ربط الأعور وثقب (CLP) هو إجراء يستخدم بشكل شائع لنمذجة الإنتان في الجسم الحي. كما الأعور هو الكامل من البكتيريا، نتائج ثقب في التهاب الصفاق متعدد المكروبات، إزفاء من البكتيريا في الدم (تجرثم الدم)، الصدمة الإنتانية، اختلال وظيفي متعدد الجهاز، وفي نهاية المطاف، والموت 5. ومن المسلم به عموما أن CLP يعكس السريريةالواقع أكثر دقة من التقنيات السابقة، مثل حقن الذيفان الداخلي أو البكتيريا حتى المنقى في القوارض، وهكذا، تعتبر CLP معيار الذهب (وإن كان لا يخلو من قيود) 6 لتحريض التجريبية، وبالتالي، والتحقيق في التسبب في التسمم. في هذه الدراسة، ونحن تصف بروتوكولات مصممة لتقييم ما إذا كانت آليات المسببة للأمراض الإنتان تشمل الالتهام الذاتي.
الالتهام الذاتي، عملية الحفظ تطويريا الخلوية، ويسهل دوران من البروتينات والعضيات مثل الميتوكوندريا التالفة ويلعب دورا هاما في إزالة مسببات الأمراض بما في ذلك البكتيريا داخل الخلايا 7،8. خلال الالتهام الذاتي، التي تحتجز البروتينات عصاري خلوي أو العضيات في حويصلات غشاء محدد مزدوجة دعا autophagosomes، والتي يتم تسليمها لاحقا إلى الجسيمات الحالة لتدهور 9. وقد تم تحديد عدد من البروتينات مثل المتماثلات الثدييات من الجينات المرتبطة الالتهام الذاتي (ATG)،حددت أصلا في الخميرة، التي تنظم عملية الالتهام الذاتي. تحويل أنيبيب المرتبطة البروتين 1 سلسلة ضوء 3B (LC3B) (نديد من Atg8) من-I LC3B (شكل حر) لLC3B-II (شكل فسفاتيديل مترافق) يمثل خطوة رئيسية في تشكيل جسيم بلعمي ذاتي 9. ويرتبط ضعف ذاتية البلعمة مع الشيخوخة والأمراض التي تصيب الإنسان بما في ذلك السرطان والاضطرابات العصبية 10. علاوة على ذلك، الالتهام الذاتي يؤثر على المناعة الفطرية والتكيفية مثل العرض مستضد والتنمية اللمفاويات وإفراز السيتوكينات من الخلايا المناعية 8. وبالتالي، فإنه يبدو من المعقول أن الالتهام الذاتي قد تلعب أيضا دورا في الاستجابة الالتهابية الجهازية للإصابة (أي في الإنتان).
حتى هذا التاريخ وقد وصفت عدة طرق لتقييم دور الالتهام الذاتي إلى إصابة نسيج في الجسم الحي. وتشمل هذه استخدام البروتين مخضر (GFP) LC3 الفئران التعبير عن والقياس الكمي لصناعة السياراتphagosomes في الأنسجة بواسطة المجهر الإلكتروني (موصوفة هاتين الطريقتين في هذه الدراسة). وتشمل وسائل إضافية لتقدير حجم ذاتية البلعمة التعبير البروتين في الخليط الأنسجة، وتحليل تدفق ذاتية البلعمة (كما هو موضح في مكان آخر) 11-13. الهدف من هذا الاستعراض هو تقديم البروتوكولات الحالية لتقييم الالتهام الذاتي في الجسم الحي في سياق الإنتان التجريبية.
والميزة الرئيسية لCLP هو أنه يسمح للباحثين لتحقيق الإنتان من بالقسوة مختلفة (أي من منخفضة إلى متوسطة وعالية الجودة). يتأثر شدة الإنتان الناجم عن طول الأعور ligated (التي هي المحدد الأهم)، وحجم الإبرة المستخدمة للثقب وعدد من الثقوب يؤديها 15. بالإضافة إلى ذلك، يمك…
The authors have nothing to disclose.
GFP-LC3 Transgenic Mice | Riken (Japan) | RBRC00806 | GFP-LC3#53 |
Xylazine | Henry-Schein | 568-0606 | Xylazine HCl Injection Vet |
Ketamine | Henry-Schein | 995-2949 | Ketaset Inj 100 mg/ml |
EtOH | Fisher | A405-20 | Histology Grade |
EtOH | Fisher | A407-1 | For Sterilizatiion |
silk surgical sutures 6-0 | Owens & Minor | 2300-0078OG, 017624 | |
buprenorphine-HCl | Henry-Schein | 614-5157 | Buprenex Ampules |
paraformaldehyde (37%) solution | JT Baker | S898-09 | |
xylenes | Fisher | X3P-1GAL | |
anti-GFP monoclonal antibody | Life Technologies | G10362 | |
Hoescht | Sigma | 944403 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
OCT | VWR scientific | 25608-930 | |
Sudan Black | Santa Cruz | sc-203760 | |
EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate | Electron microscopy Sciences | 15960 | |
propylene oxide | Sigma | 240397 | |
Agar 100 resin | Agar scientific | R1045 | |
dodecenylsuccinic anhydride | Sigma | 46346 | |
methylnadic anhydride | Sigma | 45359 | |
N-benzyldimethylamine | Sigma | 185582 |