Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Cecal ligatie en punctie-geïnduceerde Sepsis als een model om Autophagy studie bij muizen

doi: 10.3791/51066 Published: February 9, 2014

Summary

Experimentele sepsis kan worden geïnduceerd in muizen met de blindedarm ligatie en punctie (CLP) methode. Voor deze protocollen autofagie in vivo beoordelen in het kader van CLP-geïnduceerde sepsis worden hier gepresenteerd: Een protocol voor het gebruik autofagie (GFP)-LC3 muizen, en een protocol voor autophagosome vorming van elektronenmicroscopie.

Abstract

Experimentele sepsis kan worden geïnduceerd in muizen met de blindedarm ligatie en punctie (CLP) methode, die polymicrobiële sepsis veroorzaakt. Hier wordt een protocol voorzien van sepsis van verschillende ernst induceren in muizen met de CLP techniek. Autophagy is een fundamentele weefsel reactie op stress en pathogeen invasie. Twee huidige protocollen om autofagie in vivo te beoordelen in het kader van experimentele sepsis worden hier ook gepresenteerd. (I) Transgene muizen die groene fluorescentie eiwit (GFP)-LC3 fusieproteïne onderworpen CLP. Gelokaliseerde verbetering van GFP signaal (puncta), zoals bepaald hetzij door immunohistochemische of confocale assays kunnen worden gebruikt om verbeterde autophagosome vorming detecteren en dus veranderde activatie van autofagie route. (II) Enhanced autophagic vacuole (autophagosome) formatie per eenheid weefsel gebied (als een marker van autofagie stimulatie) kan worden gekwantificeerd met behulp van elektronenmicroscopie. De studie van autophagic reacties op sepsis is een kritische compponent van het begrijpen van de mechanismen die weefsels reageren op infectie. Onderzoeksresultaten op dit gebied kan uiteindelijk bijdragen aan het begrijpen van de pathogenese van sepsis, die een groot probleem in de intensive care geneeskunde vertegenwoordigt.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sepsis, systemische inflammatoire respons op infectie, is een belangrijke doodsoorzaak bij kritisch zieke patiënten 1. Intra-abdominale infecties, vaak leidt tot polymicrobiële sepsis, goed voor 20% van sepsis, die aanzienlijke mortaliteit tot 60% 2 hebben. Met sepsis geassocieerde sterfte voornamelijk het gevolg is van multi-orgaanfalen met daaropvolgend orgaanfalen 3,4. Aanvullend onderzoek naar de pathogenese van deze ziekte is dringend nodig om de ontwikkeling van nieuwe en effectievere behandelingen bevorderen.

De methode cecal ligatie en punctie (CLP) is een veel gebruikte procedure voor het modelleren sepsis in vivo. Zoals de blindedarm is vol bacteriën, de punctie resultaten in polymicrobiële peritonitis, translocatie van bacteriën in het bloed (bacteriëmie), septische shock, multi-orgaanfalen en uiteindelijk de dood 5. Het is algemeen aanvaard dat CLP weerspiegelt de klinischerealiteit nauwkeuriger dan eerdere technieken, zoals injectie van endotoxine of gezuiverde bacteriën in knaagdieren, dus CLP wordt beschouwd als de gouden standaard (maar niet Onbeperkt) 6 voor de experimentele inductie en dus het onderzoek van de pathogenese van sepsis. In deze monografie, beschrijven we protocollen ontworpen om te beoordelen of pathogene mechanismen van sepsis omvatten autofagie.

Autofagie, een evolutionair geconserveerd cellulair proces, vergemakkelijkt de omzet van beschadigde eiwitten en organellen zoals mitochondriën en speelt een belangrijke rol in de klaring van intracellulaire pathogenen zoals bacteriën 7,8. Tijdens autofagie, worden cytosolische eiwitten of organellen afgezonderd in dubbele membraan gebonden blaasjes genoemd autofagosomen, die vervolgens worden geleverd aan de lysosomen voor degradatie 9. Een aantal eiwitten geïdentificeerd als zoogdierhomologen van autofagie genen (Atg)oorspronkelijk geïdentificeerd in gist, die het proces van autofagie regelen. De omzetting van microtubuli geassocieerde proteïne-1 lichte keten 3B (LC3B) (homoloog van Atg8) uit LC3B-I (vrije vorm) te LC3B-II (fosfatidylethanolamine-geconjugeerde vorm) vormt een belangrijke stap in autophagosome vorming 9. Autophagic dysfunctie wordt geassocieerd met ouder worden en menselijke ziekten, waaronder kanker en neurodegeneratieve aandoeningen 10. Bovendien autofagie beïnvloedt aangeboren en adaptieve immuniteit, zoals antigeen presentatie, lymfocyten ontwikkeling en cytokine secretie door immuuncellen 8. Zo lijkt het redelijk dat autofagie ook een rol zou kunnen spelen in de systemische inflammatoire respons op infectie (ic in sepsis).

Tot op heden verschillende methoden zijn beschreven om de rol van autofagie in weefselbeschadiging in vivo te beoordelen. Deze omvatten het gebruik van groene fluorescentie eiwit (GFP)-LC3 expressie muizen en kwantificering van autophagosomes in weefsel door elektronenmicroscopie (beide werkwijzen zijn in deze monografie). Aanvullende methoden omvatten de kwantificering van autophagic eiwitexpressie in weefselhomogenaten, en de analyse van autophagic flux (zoals elders beschreven) 11-13. Het doel van dit onderzoek is om de huidige protocollen voor de beoordeling van autofagie in vivo in het kader van experimentele sepsis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Opmerking: de Institutional Animal Care en gebruik Comite op Brigham en Women's Hospital / Harvard Medical School Area ingestemd met de volgende procedures.

1. Cecal Ligatie en Puncture

Gebruik muizen van dezelfde achtergrond (C57Bl / 6), mannelijke, 8-10 weken oud. Vrouwelijke muizen zijn resistenter dan de mannetjes tegen sepsis geïnduceerde dodelijkheid. Muizen ouder dan 8 weken produceren minder variabele resultaten dan jongere muizen in termen van overleving na CLP. Ongeveer N = 10 muizen per groep worden vergeleken voor overlevingsanalyse. N = 3-5 muizen voldoende voor autophagy assays.

  1. Gebruik steriele kleine chirurgische instrumenten (namelijk scalpel, schaar en stompe anatomische pincet), die geschikt is voor knaagdieren operatie zou moeten zijn.
  2. Bereid anesthesie mengsel: Aan 7,95 ml PBS met 150 ul van xylazine (AnaSed injectie van 100 mg / ml) en 700 gl Ketamine (Ketaset   CIII, 100 mg / mliter).
  3. Om aseptische omstandigheden te garanderen tijdens de procedure, draag handschoenen, gezichtsmasker en chirurgische toga.
  4. Weeg dieren. Verdoven ze door het injecteren intraperitoneaal (ip) de in stap 3 genoemde in een dosering van gl (10x lichaamsgewicht in g) mengsel. Bijvoorbeeld, voor een muis gewicht 22 g toedienen 10x22 = 220 pi van het mengsel verdoving. Dus de uiteindelijke doses xylazine en ketamine zijn 17 en 80 mg / kg lichaamsgewicht, respectievelijk. Zorg ervoor dat anesthesie is voldoende, geen buiging van de ledematen moeten worden geproduceerd na teen knijpen. Opmerking: Gebruik oogzalf op de ogen tot droog te voorkomen, terwijl onder verdoving.
  5. Plaats de dieren op een schoon werkvlak op hun rug. Staarten en achterpoten zijn gericht op de onderzoeker. Ontsmet de buikhuid het gebruik van alcohol (70% EtOH oplossing). Opmerking: Chirurgische gebied moet volledig worden geschoren, om besmetting van de wond door contact met vermijdenbont. Ook, optimaal, een circulerend warm water kussen moet worden gebruikt om normothermia van verdoofde muizen tijdens de operatie te handhaven.
  6. Door het gebruik van een scalpel, een kleine longitudinale incisie in de huid parallel en ongeveer 1 cm van links naar middellijn. Nog niet doordringen in de peritoneale holte. Gebruik een klein schaartje om de eerste incisie te verlengen.
  7. Identificeer buikspieren en ontleden ze toegang krijgen in de peritoneale holte.
  8. Door het gebruik van stompe anatomische pincet, identificeren de blindedarm en verplaats ze uit de buikholte. Wees voorzichtig mesenteriale bloedvaten (dit kan leiden tot dodelijke bloedingen) niet te beschadigen.
  9. Ligeren 60% van de blindedarm van een mid-grade sepsis bereiken. Ligeren gelijk aan of meer dan 75% van de blindedarm doorgaans tot hoogwaardige sepsis, dat gelijk aan of minder dan 25% van de blindedarm resultaten bij laaggradig sepsis ligeren. Wees voorzichtig de Bauhin klep (dit kan de intestinale continuïteit te blokkeren) niet afbinden.
  10. Door een21 G naald, perforeren de blindedarm voor een door-en-door punctie (twee gaten) in de buurt van de ligatie. De richting van de perforatie moet worden van de mesenteriale de anti-mesenteriale zijde van de blindedarm. Wees voorzichtig mesenteriale bloedvaten niet te doorboren.
  11. Verwijder de naald. Knijp de blindedarm geligeerd om openheid te bevestigen door de twee gaten, slechts een kleine hoeveelheid uitwerpselen worden geëxtrudeerd door hen.
  12. Verplaats de geligeerde en doorboord blindedarm in de peritoneale holte.
    Opmerking: Voor sham muizen, sla dan stappen 1,10-1,12.
  13. Gebruik zijde chirurgische hechtingen 6-0 met cutting naald om buikspieren te sluiten. Gebruik zijde chirurgische hechtingen 6-0 met cutting naald om buikhuid sluiten.
  14. Injecteer 1 ml voorverwarmde (37 ° C) normale zoutoplossing ip warmte en vocht verloren tijdens de procedure te vervangen. Leg de muizen onder een warmtelamp totdat hun reanimatie. Opmerking: Optimaal, een veiliger warming-apparaat (such als een circulerende warm water pad) kan worden gebruikt in plaats van een warmtelamp.
  15. Postoperatief injecteren buprenorfine (0,05 mg / kg lichaamsgewicht sc.) Om pijnstilling te bereiken. Opmerking: Een dier mag niet onbeheerd worden achtergelaten, totdat het voldoende weer bij bewustzijn is om borstligging handhaven. Een dier dat een chirurgische behandeling heeft ondergaan mag niet worden teruggestuurd naar het gezelschap van andere dieren, totdat volledig hersteld.
  16. Plaats de dieren terug in hun kooien met onbeperkte toegang tot voedsel en water. Muizen zullen worden gedood wanneer ze stervende (aangegeven met klinische symptomen zoals mislukte overstap bij aanraking of cyanose). Controleer muizen elke 4 uur om te voorkomen dat ze sterven voorafgaand aan euthanasie.

2. Tissue Harvest en Fixation

  1. Bereid een 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing: Voor 889 ml PBS toe 111 ml van 37% PFA.
  2. Sacrifice muizen met behulp van CO 2-geïnduceerde narcose of Ketamine / Xylazine sPLOSSING in een hoge dosering.
  3. Immobiliseer de muizen op een schoon werkvlak. Spray de abdominale en thoracale huid met 70% EtOH oplossing te desinfecteren.
  4. Gebruik een scalpel en een klein schaartje om de buik-en thoracale huid en de huid die de tracheale gebied te verwijderen.
  5. Reveal luchtpijp door het verwijderen van de omliggende weefsels (spieren en bindweefsel).
  6. Plaats een hechting (zonder te snijden naald) rond de luchtpijp. Nog niet vastdraaien.
  7. Gebruik een kleine perifere veneuze katheter (20 G) naar 'intubate' luchtpijp. Wees voorzichtig tijdens het inbrengen van de katheter om tracheale scheuren te voorkomen. Merk op dat de grootste diameter van de trachea net onder de ringkraakbeen.
  8. Draai de hechtdraad rond de luchtpijp / katheter. Verwijder de naald waardoor de plastic canule van de katheter in de luchtpijp. Naald alleen diende als een gids-draad voor het plaatsen van de plastic canule.
  9. Nadat de plastic canule bevestigd in de trachea gesneden the buikspieren, opent de buik en onthullen het middenrif.
  10. Met een naald doorboord membraan pneumothorax (bijvoorbeeld inbrengen van lucht in de pleura-holte) produceren. Longen moeten dan worden ingestort.
  11. Met behulp van kleine schaar, verwijder het middenrif, snijd langs het borstbeen (sternotomie), verwijder de ribbenkast en onthullen het hart en de longen.
  12. Door de plastic canule ingebracht in de luchtpijp, bevestig de longen met de formaldehyde-oplossing onder de 30 cm H 2 O druk.
  13. Verwijder de longen en deze in de met 4% PFA gedurende 24 uur en vervolgens in 70% EtOH-oplossing tot verwerking.
  14. Identificeren en verwijderen van hart, lever en nieren. Op dezelfde wijze, plaats ze in de 4% PFA gedurende 24 uur en vervolgens in 70% EtOH-oplossing tot verwerking.

3. GFP Muizen en bekijken van GFP Slides

  1. Voer CLP en sham operatie aan GFP-LC3 muizen zoals beschreven in stap 1, en postoperatieve procedures zoals beschreven in stap 2 van het protocol.
  2. Het weefsel (namelijk de longen, hart, lever en nieren) inbedden in paraffine en snijd ze in serie 5 urn.
  3. Wanneer klaar voor GFP kleuring, incubeer bij 60 ° C gedurende 30-60 min tot paraffine smelt en weefsel weergegeven doorschijnend.
  4. Deparaffinize met standaard gesorteerde reeks xyleen of xyleensubstituanten, 5 min. xyleen 1, xyleen 2, en xyleen 3 dan 3 min incubatie in gesorteerde reeks EtOH: 100%, 95%, 75%, en dan afspoelen in gedestilleerd water.
    Opmerking: Na deparaffinisatie vermijden weefsel uitdroging, welk monster achtergrond neemt toe.
  5. Voer antigenen met citroenzuur buffer (10 mM natriumcitraat zuur, 0,05% Tween 20, pH 6,0), door de magnetron gedurende 10-20 minuten. Wees voorzichtig om buffer periodiek worden vervangen om weefsel uitdroging te voorkomen.
  6. Laat de oplossing afkoelen gedurende 20 minuten op de bank om antigen herstel te voltooien.
  7. Was 2-3x met PBS. Verwijder overtollig buffer en transfer glijdt van rek tot horizontale positie in een dia doos of andere vochtige kamer om uitdroging te voorkomen.
  8. Blokkeer 45-60 min bij kamertemperatuur met 10% normaal serum ezel (ook 5% runderserumalbumine of bij voorkeur serum van het dier waarbij het secundaire antilichaam werd opgewekt) in PBS.
  9. Incubeer monsters in primaire GFP antilichaam bij 1:100 verdunning in PBS overnacht bij 4 ° C in vochtige kamer. Voorzichtig toepassing stukjes Parafilm dan weefsel met antilichaam homogeen contact met het weefsel te bevorderen en verdamping te voorkomen.
    Opmerking: resterende stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.
  10. Was 5x met PBS om overtollig primaire antilichaam te verwijderen. Incubeer met secundaire antilichaam 1:500-1:1,000 in PBS gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur geroerd.
  11. Was 5x met PBS om overmaat secundair antilichaam te verwijderen. Desgewenst tegenkleuring de glijbanen in deze stap.
  12. Bij gebruik van fluorescerende secundair antilichaam, incubeer 0,1% Sudan Black in 70% EtOH fof 15-20 min autofluorescentie te verminderen. Veeg het overtollige Sudan Black van rond weefsel en wassen 5x met PBS gedurende 20 minuten.
  13. Monteer monster met dekglaasje en slaan horizontaal, totdat montage oplossing heeft ingesteld.

4. Alternatief protocol: directe detectie van GFP-LC3

  1. Canule en pomp longen met een ~ 500 ml 50/50 v / v oktober PBS.
  2. Embed in OCT door een kleine hoeveelheid OCT in de bodem van een cryomold.
  3. Plaats de ontleed long complex zorgvuldig in de matrijs.
  4. Langzaam vriezen methylbutaan gekoeld met behulp van droogijs.
  5. Voeg meer oktober totdat het weefsel volledig bedekt en bevroren solide. Blijf op droog ijs en bewaar bij -80 ° C.
  6. Met behulp van een cryomicrotoom, gesneden 5-10 micrometer dikke secties bescherming van de secties tegen licht. Store secties en restmateriaal bij -80 ° C.
  7. Om dia's te bereiden voor imaging, verwijderen gedeelte van diepvries en onmiddellijk een druppel PBS toepassing op uitdroging te voorkomen.
  8. Fix gedurende 30 minuten met 4% PFA. Wassen met PBS.
  9. Solliciteer DAPI / Hoescht gedurende 10 minuten. Was 3x met PBS.
  10. Monteer monster met dekglaasje en slaan horizontaal, totdat montage oplossing heeft ingesteld.
  11. Beeld met behulp van epifluorescentie of confocale microscoop. WINKEL monsters bij 4 ° C gedurende maximaal een maand.

5. Bereiding van weefsel voor Elektronenmicroscopie

  1. Snijd weefsels in ongeveer 1 mm blokjes voor de bevestiging.
  2. Bevestig het weefsel in 2% formaldehyde, 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M natrium cacodylaat buffer, pH 7,4.
  3. Wassen met 0,1 M natriumcacodylaatbuffer voor 1-2 uur.
    Opmerking: Vaste weefsel kan worden opgeslagen in 0,1 M natriumcacodylaat bij 4 ° C.
  4. Plaats fix in 1% osmiumtetroxide in 0,2 M natriumcacodylaatbuffer 1 uur.
  5. Spoel in 0,2 M natrium cacodylaat buffer gedurende 10 minuten 3x.
  6. Uitdrogen in 70% EtOH, 20 min. 2x. Uitdrogen in 90% EtOH, 10 min. 2x. Dehydrateer 100% EtOH,20 min 2x.
  7. Incubeer met propyleenoxide (epoxypropaan) gedurende 10 min 2x.
  8. Incubeer met propyleenoxide / epoxyharsmengsel (50:50) gedurende 1 uur. De epoxy hars mengsel: 24 g Agar 100 hars 13 g dodecenylsuccinic anhydride, 13 g methylnadic anhydride en 1 ml N-benzyldimethylamine. Meng in een wegwerp beker met behulp van een houten spatel.
  9. Incubeer met epoxyhars overnachting in afgetopte flesjes (dit kan elke resterende propyleenoxide verdampen).
  10. Insluiten in geëtiketteerde capsules met vers bereide hars. Polymeriseren bij 60 ° C gedurende 48 uur.
  11. Foto weefselsecties met een transmissie-elektronenmicroscoop bij 80 of 60 kV op elektronenmicroscoop film. De beelden afdrukken op fotopapier of op te slaan als digitale media.
  12. Analyseer autophagosome vorming in intacte cellen met kern. Laag krachtvelden (e. G. 2.000-4.000 X) kunnen worden gebruikt om kernhoudende cellen te identificeren. Typisch 6,800-10,000 X beelden worden gebruikt voor eis autophagosome kwantificering. Count autofagosomen per oppervlakte-eenheid 15-30 velden voor passende statistische vertegenwoordiging. Autofagosomen hebben dubbele membraan structuur, waar laat stadium autophogosomes leek gevulde vacuolen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bacteriëmie aanwezig muizen vanaf 6 uur na CLP-geïnduceerde sepsis 14. Klinische symptomen van sepsis (waaronder rillingen, tachypneu en verminderde motorische activiteit) verschijnen circa 12 uur na de procedure. Muizen onderworpen aan CLP beginnen te sterven op ongeveer 18 uur na inductie van peritonitis. Hoe ernstig is de sepsis de meer toegenomen is de dodelijkheid 15. In detail, hoogwaardige sepsis veroorzaakt 100% sterfte binnen 2-3 dagen, terwijl de mid-grade sepsis resultaten in ongeveer 60% sterfte op 7 dagen na CLP (buiten deze termijn, geen sterfgevallen verwacht) (Figuur 1). In tegenstelling, moet sterfte van sham muizen nul zijn

Figuur 1
Figuur 1. Overlevingscurves na CLP van verschillende prioriteitsniveaus in muizen. C57BL / 6 muizen werden onderworpen aan chirurgie of CLP-geïnduceerde sepsis verschillende ernst sham door aanpassing van de ligatie constant houden van het aantal perforaties aan de blindedarm (bijvoorbeeld 1 'door-en-door "punctie (twee gaten) met een 21 G naald ). Ligatie van 60% van de blinde darm resulteert in een mid-grade sepsis, wat leidt tot ongeveer 60% sterfte op 7 dagen na CLP. Ligatie van ≥ 75% van de blindedarm resultaten in hoogwaardige sepsis en vervolgens 100% mortaliteit binnen 2-3 dagen na CLP, terwijl ligatie van ≤ 25% van de blindedarm leidt bij laaggradig sepsis en dus in bijna nul sterfte. Typische survival resultaten worden getoond.

Voor de toepassing van de autofagie studies hebben we ervoor gekozen om de uitvoering van een CLP-model van mid-grade sepsis. Low-grade sepsis zou onvoldoende zijn om autofagie te induceren, terwijl de high-grade sepsis kan leiden tot vroegtijdige sterfte van muizen (voor inductie van autofagie).

ve_content "> Voor testen autofagie, we hebben gebruikt transgene muizen die GFP-LC3 fusieproteïne onderworpen aan bovengenoemde sepsis protocollen. Voor behandeling procedures die leiden tot stimulatie van de autophagy route wordt verwacht dat er gelokaliseerd verbetering van GFP signaal ( puncta), zoals bepaald hetzij door immunohistochemische of confocale testen duiden op betere autophagosome formatie 16.

Figuur 2
Figuur 2. GFP beeldvorming in vivo en in vitro. (A, B) Representatief voorbeeld van GFP beeldvorming muis organen (bijvoorbeeld nier) verkregen GFP-LC3B muizen. Afbeelding toont GFP-LC3 puncta in de glomeruli van nierweefsel verkregen van onbehandelde muizen. Schaal bar = 10 mm. ( C, D) Additionele gegevens worden verstrekt ter illustratie in vitro GFP-LC3 beeldvorming. Primaire mesangiale cellen werden geïsoleerd uit GFP-LC3 transgene muizen met een protocol voor cel isolatie van genetisch gemodificeerde muizen zoals eerder beschreven. 17 De cellen werden geïncubeerd in afwezigheid (C) of afwezigheid (D) van TGF-β1 (2 ng / ml) gedurende 24 uur zoals eerder beschreven 18. Behandeling met TGF-β1 verhoogde de overvloed aan autofagosomen (groen puncta). Klik hier voor grotere afbeelding.

Dit kan verder worden getest door klassieke ultrastructurele analyse met behulp van elektronenmicroscopie zoals beschreven in het protocol. Verwacht wordt dat coupes verkregen uit septische muizen of ander weefsel letsel modellen verbeterde autophagic vacuole (autophagosome) formatie per eenheid weefsel gebied zou laten zien.

e_content "fo: keep-together.within-page =" altijd "> Figuur 3
Figuur 3. Elektronenmicroscopie van autophagosome vorming. Een vertegenwoordiger microfoto van vroege en late-fase autophagosome formatie in longweefsel genomen van C57Bl / 6 muizen blootgesteld aan mid-grade CLP (60% van de eileiders, 21 G, 2 gaten). Εarly podium autofagosomen hebben een dubbele membraan structuur (pijl), terwijl de late fase autofagosomen lijken op een gevulde vacuole (pijlpunt). M geeft mitochondriën. Schaal bar = 1 micrometer. Een afbeelding vertegenwoordiger controle getoond van longweefsel uit C57Bl / 6 muizen blootgesteld aan sham operatie. Klik hier voor grotere afbeelding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het grote voordeel van de CLP is dat het mogelijk onderzoekers sepsis van verschillende ernst onderzoeken (dat wil zeggen van low-tot mid-en high-grade). Ernst van geïnduceerde sepsis wordt beïnvloed door de lengte van blindedarm geligeerd (waarvan de belangrijkste determinant), de grootte van de naald gebruikt doorboren en het aantal openingen 15 uitgevoerd. Daarnaast kan de muizenstam en geslacht van invloed zijn op de ernst van sepsis; verschillende stammen zijn gevoeliger dan anderen en mannetjes zijn over het algemeen gevoeliger dan vrouwen 19,20. Bovengenoemde factoren tezamen bepalen de CLP-geïnduceerde sterfte.

Op basis van onze ervaring, is er een verschil tussen de onderzoekers met betrekking tot de behaalde-CLP-geïnduceerde sterfte. . Bijvoorbeeld Rittirsch et al. gebruikt 50% van de eileiders, 21 G, 1 'door-en-door' punctie (twee gaten) op een 60% sterfte 15 te bereiken; een onderzoeker in onze onderzoeksgroep behoefteed een iets zwaardere model (60% van de eileiders, 21 G, 1 'door-en-door' punctie) gebruiken om dezelfde sterfte verkrijgt, en dat, een andere onderzoeker in de onderzoeksgroep gebruikte een zwaardere model (in de buurt van 100% van de eileiders , 19 G, 1 'door-en-door' punctie) een veel lagere sterfte (slechts 25%) te bereiken. Met de bovenstaande overwegingen in het achterhoofd, zou men kunnen stellen dat de karakterisering van de ernst van de CLP (bijv. een lage-, mid-of high-grade sepsis) achteraf moet worden gedaan (dat wil zeggen door te kijken naar de resulterende sterfte) in plaats van prospectief (dwz door het toepassen bepaalde omstandigheden, bijvoorbeeld 50% ligatie). Wanneer een operator bereikt een mortaliteit van ongeveer 60%, dan, dit is mid-grade sepsis, ongeacht welke voorwaarden (zoals lengte van de blindedarm afgebonden en het aantal gaten uitgevoerd) worden uitgevoerd. Zo lijkt het redelijk dat de exploitant proberen verschillende voorwaarden aan de voorwaarden die 60% van de muizen sterven identificeren. Vervolgens wordt de operatormoet precies dezelfde omstandigheden in beide groepen worden vergeleken voeren.

Door de implementatie precies dezelfde omstandigheden (bijv. de lengte van caecum geligeerd, grootte van naald gebruikt doorboren, aantal holes uitgevoerd, de muizenstam en geslacht), wordt verwacht dat consistente en reproduceerbare resultaten 15 worden geproduceerd. Echter, zelfs na het uitvoeren van CLP gestandaardiseerde wijze (rekening houdend met bovenstaande factoren), kan variabiliteit optreden. Het is erkend door deskundigen dat zelfs identieke beledigingen gegeven op identieke groepen dieren ouder - zelfs uit hetzelfde nest - een variabele individuele effect zichtbaar "6. Aldus, in een poging om variabiliteit te verminderen, lijkt het redelijk dat de bediener CLP in beide groepen vergeleken op dezelfde dag.

De analyse van autofagie, een dynamisch cellulair proces is complex. De in dit monogra protocollenph voorzien raming autofagie activering in vivo, gebaseerd op biochemische of morfologische analyse van autophagosome vorming. In principe kunnen de protocollen die in dit hoofdstuk worden toegepast op de analyse van autofagie in ieder orgaan weefsel in muizen blootgesteld aan CLP of alternatieve modellen van sepsis. Terwijl de lever is algemeen aanvaard om een ​​primaire doelstelling van CLP is, kan deze procedure ook leiden tot letsel aan longen of nieren weefsel, dat verdient nader onderzoek. Het effect van CLP op autofagie van hepatocyten is relatief goed bestudeerd in vergelijking met de effecten ervan op autofagie van nieren of longen, en een aantal relevante bewijzen is onlangs verschenen 21,22.

Opgemerkt zij dat deze statische maatregelen van autofagie, een toename autophagosome getallen ook autofagieprocessen dysfunctie kunnen weerspiegelen door blokkering van lysosomale functie en eind-bewerking. In dit verband dient deze tests worden aangevuld met biochemiesche analyses voor autophagic substraat omzet (bijv.   flux) zoals recent beschreven en aangepast voor in vivo analyses 11. Deze testen kunnen ook worden aangevuld met standaard Western immunoblot analyse voor de expressie van belangrijke autofagie eiwitten in weefsel zoals recent beschreven 12,13. Derhalve wordt aanbevolen dat een combinatie van deze tests worden uitgevoerd om een nauwkeurige schatting van de status van autofagie in beschadigd weefsel 16 te krijgen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen te verklaren

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie ​​P01 HL108801, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, naar AMK Choi. S. Ryter ontvangen salaris steun van de Lovelace Respiratory Research Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GFP-LC3 Transgenic Mice Riken (Japan) RBRC00806 GFP-LC3#53
Xylazine Henry-Schein 568-0606 Xylazine HCl Injection Vet
Ketamine Henry-Schein 995-2949 Ketaset Inj 100 mg/ml
EtOH Fisher A405-20 Histology Grade
EtOH Fisher A407-1 For Sterilizatiion
silk surgical sutures 6-0 Owens & Minor 2300-0078OG, 017624
buprenorphine-HCl Henry-Schein 614-5157 Buprenex Ampules
paraformaldehyde (37%) solution JT Baker S898-09
xylenes Fisher X3P-1GAL
anti-GFP monoclonal antibody Life Technologies G10362
Hoescht Sigma 944403
DAPI Invitrogen D1306
OCT VWR scientific 25608-930
Sudan Black Santa Cruz sc-203760
EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate Electron microscopy Sciences 15960
propylene oxide Sigma 240397
Agar 100 resin Agar scientific R1045
dodecenylsuccinic anhydride Sigma 46346
methylnadic anhydride Sigma 45359
N-benzyldimethylamine Sigma 185582

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. The pathology and treatment of sepsis. N. Engl. J. Med. 348, 138-150 (2003).
  2. Anaya, D. A., Nathens, A. B. Risk factors for severe sepsis in secondary peritonitis. Surg. Infect. 4, 355-362 (2003).
  3. Bone, R. C., Grodzin, C. J., Balk, R. A. Sepsis: A new hypothesis for pathogenesis of the disease process. Chest. 112, 235-243 (1997).
  4. Rivers, E., et al. Early goal-directed therapy in the treatment of severe sepsis and septic shock. N. Engl. J. Med.. Med, shock.N. .E. ngl.J. . 345, 1368-1377 (2001).
  5. Deitch, E. A. Rodent models of intra-abdominal infection. Shock. 24, (Suppl 1), 19-23 (2005).
  6. Raven, K. Rodent models of sepsis found shockingly lacking. Nat. Med. 18, 998 (2012).
  7. Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
  8. Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10, 461-470 (2009).
  9. Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
  10. Choi, A. M., Ryter, S. W., Levine, B. Autophagy in human health and disease. N. Engl. J. Med. 368, 651-662 (2013).
  11. Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7, 629-642 (2011).
  12. Chen, Z. H., et al. Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease. PLos One. 3, 3313 (2008).
  13. Kim, H. P., Chen, Z. H., Choi, A. M., Ryter, S. W. Analyzing autophagy in clinical tissues of lung and vascular diseases. Meth. Enzymol. 453, 197-216 (2009).
  14. Flierl, M. A., et al. Adverse functions of IL-17A in experimental sepsis. FASEB J. 22, 2198-2205 (2008).
  15. Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nat. Protoc. 4, 31-36 (2009).
  16. Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140, 313-326 (2010).
  17. Wang, L., Ma, R., Flavell, R. A., Choi, M. E. Requirement of mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MKK3) for activation of p38α and p38δ MAPK isoforms by TGF-β1 in murine mesangial cells. J. Biol. Chem. 277, 47257-47262 (2002).
  18. Ding, Y., Kim, J. K., Kim, S. I., Na, H. J., Jun, S. Y., Lee, S. J., Choi, M. E. TGF-{beta}1 protects against mesangial cell apoptosis via induction of autophagy. J Biol Chem. 285, 37909-37919 (2010).
  19. Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94, 331-335 (1983).
  20. Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis. J. Surg. Res. 102, 45-49 (2002).
  21. Carchman, E. H., Rao, J., Loughran, P. A., Rosengart, M. R., Zuckerbraun, B. S. Heme oxygenase-1-mediated autophagy protects against hepatocyte cell death and hepatic injury from infection/sepsis in mice. Hepatology. 53, 2053-2062 (2011).
  22. Lo, S., et al. Lc3 over-expression improves survival and attenuates lung injury through increasing autophagosomal clearance in septic mice. Ann. Surg. 257, 352-363 (2013).
Cecal ligatie en punctie-geïnduceerde Sepsis als een model om Autophagy studie bij muizen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Siempos, I. I., Lam, H. C., Ding, Y., Choi, M. E., Choi, A. M. K., Ryter, S. W. Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice. J. Vis. Exp. (84), e51066, doi:10.3791/51066 (2014).More

Siempos, I. I., Lam, H. C., Ding, Y., Choi, M. E., Choi, A. M. K., Ryter, S. W. Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice. J. Vis. Exp. (84), e51066, doi:10.3791/51066 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter