Experimentele sepsis kan worden geïnduceerd in muizen met de blindedarm ligatie en punctie (CLP) methode. Voor deze protocollen autofagie in vivo beoordelen in het kader van CLP-geïnduceerde sepsis worden hier gepresenteerd: Een protocol voor het gebruik autofagie (GFP)-LC3 muizen, en een protocol voor autophagosome vorming van elektronenmicroscopie.
Experimentele sepsis kan worden geïnduceerd in muizen met de blindedarm ligatie en punctie (CLP) methode, die polymicrobiële sepsis veroorzaakt. Hier wordt een protocol voorzien van sepsis van verschillende ernst induceren in muizen met de CLP techniek. Autophagy is een fundamentele weefsel reactie op stress en pathogeen invasie. Twee huidige protocollen om autofagie in vivo te beoordelen in het kader van experimentele sepsis worden hier ook gepresenteerd. (I) Transgene muizen die groene fluorescentie eiwit (GFP)-LC3 fusieproteïne onderworpen CLP. Gelokaliseerde verbetering van GFP signaal (puncta), zoals bepaald hetzij door immunohistochemische of confocale assays kunnen worden gebruikt om verbeterde autophagosome vorming detecteren en dus veranderde activatie van autofagie route. (II) Enhanced autophagic vacuole (autophagosome) formatie per eenheid weefsel gebied (als een marker van autofagie stimulatie) kan worden gekwantificeerd met behulp van elektronenmicroscopie. De studie van autophagic reacties op sepsis is een kritische compponent van het begrijpen van de mechanismen die weefsels reageren op infectie. Onderzoeksresultaten op dit gebied kan uiteindelijk bijdragen aan het begrijpen van de pathogenese van sepsis, die een groot probleem in de intensive care geneeskunde vertegenwoordigt.
Sepsis, systemische inflammatoire respons op infectie, is een belangrijke doodsoorzaak bij kritisch zieke patiënten 1. Intra-abdominale infecties, vaak leidt tot polymicrobiële sepsis, goed voor 20% van sepsis, die aanzienlijke mortaliteit tot 60% 2 hebben. Met sepsis geassocieerde sterfte voornamelijk het gevolg is van multi-orgaanfalen met daaropvolgend orgaanfalen 3,4. Aanvullend onderzoek naar de pathogenese van deze ziekte is dringend nodig om de ontwikkeling van nieuwe en effectievere behandelingen bevorderen.
De methode cecal ligatie en punctie (CLP) is een veel gebruikte procedure voor het modelleren sepsis in vivo. Zoals de blindedarm is vol bacteriën, de punctie resultaten in polymicrobiële peritonitis, translocatie van bacteriën in het bloed (bacteriëmie), septische shock, multi-orgaanfalen en uiteindelijk de dood 5. Het is algemeen aanvaard dat CLP weerspiegelt de klinischerealiteit nauwkeuriger dan eerdere technieken, zoals injectie van endotoxine of gezuiverde bacteriën in knaagdieren, dus CLP wordt beschouwd als de gouden standaard (maar niet Onbeperkt) 6 voor de experimentele inductie en dus het onderzoek van de pathogenese van sepsis. In deze monografie, beschrijven we protocollen ontworpen om te beoordelen of pathogene mechanismen van sepsis omvatten autofagie.
Autofagie, een evolutionair geconserveerd cellulair proces, vergemakkelijkt de omzet van beschadigde eiwitten en organellen zoals mitochondriën en speelt een belangrijke rol in de klaring van intracellulaire pathogenen zoals bacteriën 7,8. Tijdens autofagie, worden cytosolische eiwitten of organellen afgezonderd in dubbele membraan gebonden blaasjes genoemd autofagosomen, die vervolgens worden geleverd aan de lysosomen voor degradatie 9. Een aantal eiwitten geïdentificeerd als zoogdierhomologen van autofagie genen (Atg)oorspronkelijk geïdentificeerd in gist, die het proces van autofagie regelen. De omzetting van microtubuli geassocieerde proteïne-1 lichte keten 3B (LC3B) (homoloog van Atg8) uit LC3B-I (vrije vorm) te LC3B-II (fosfatidylethanolamine-geconjugeerde vorm) vormt een belangrijke stap in autophagosome vorming 9. Autophagic dysfunctie wordt geassocieerd met ouder worden en menselijke ziekten, waaronder kanker en neurodegeneratieve aandoeningen 10. Bovendien autofagie beïnvloedt aangeboren en adaptieve immuniteit, zoals antigeen presentatie, lymfocyten ontwikkeling en cytokine secretie door immuuncellen 8. Zo lijkt het redelijk dat autofagie ook een rol zou kunnen spelen in de systemische inflammatoire respons op infectie (ic in sepsis).
Tot op heden verschillende methoden zijn beschreven om de rol van autofagie in weefselbeschadiging in vivo te beoordelen. Deze omvatten het gebruik van groene fluorescentie eiwit (GFP)-LC3 expressie muizen en kwantificering van autophagosomes in weefsel door elektronenmicroscopie (beide werkwijzen zijn in deze monografie). Aanvullende methoden omvatten de kwantificering van autophagic eiwitexpressie in weefselhomogenaten, en de analyse van autophagic flux (zoals elders beschreven) 11-13. Het doel van dit onderzoek is om de huidige protocollen voor de beoordeling van autofagie in vivo in het kader van experimentele sepsis.
Het grote voordeel van de CLP is dat het mogelijk onderzoekers sepsis van verschillende ernst onderzoeken (dat wil zeggen van low-tot mid-en high-grade). Ernst van geïnduceerde sepsis wordt beïnvloed door de lengte van blindedarm geligeerd (waarvan de belangrijkste determinant), de grootte van de naald gebruikt doorboren en het aantal openingen 15 uitgevoerd. Daarnaast kan de muizenstam en geslacht van invloed zijn op de ernst van sepsis; verschillende stammen zijn gevoeliger dan anderen en mannetj…
The authors have nothing to disclose.
GFP-LC3 Transgenic Mice | Riken (Japan) | RBRC00806 | GFP-LC3#53 |
Xylazine | Henry-Schein | 568-0606 | Xylazine HCl Injection Vet |
Ketamine | Henry-Schein | 995-2949 | Ketaset Inj 100 mg/ml |
EtOH | Fisher | A405-20 | Histology Grade |
EtOH | Fisher | A407-1 | For Sterilizatiion |
silk surgical sutures 6-0 | Owens & Minor | 2300-0078OG, 017624 | |
buprenorphine-HCl | Henry-Schein | 614-5157 | Buprenex Ampules |
paraformaldehyde (37%) solution | JT Baker | S898-09 | |
xylenes | Fisher | X3P-1GAL | |
anti-GFP monoclonal antibody | Life Technologies | G10362 | |
Hoescht | Sigma | 944403 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
OCT | VWR scientific | 25608-930 | |
Sudan Black | Santa Cruz | sc-203760 | |
EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate | Electron microscopy Sciences | 15960 | |
propylene oxide | Sigma | 240397 | |
Agar 100 resin | Agar scientific | R1045 | |
dodecenylsuccinic anhydride | Sigma | 46346 | |
methylnadic anhydride | Sigma | 45359 | |
N-benzyldimethylamine | Sigma | 185582 |