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Immunology and Infection

Cecal ligation और चूहे में भोजी अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में पूति पंचर प्रेरित

doi: 10.3791/51066 Published: February 9, 2014

Summary

प्रायोगिक पूति cecal बंधाव और पंचर (सीएलपी) विधि का उपयोग चूहों में प्रेरित किया जा सकता है. CLP प्रेरित पूति के संदर्भ में vivo में भोजी का आकलन करने के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत कर रहे हैं: (GFP) LC3 चूहों का उपयोग भोजी को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा autophagosome गठन को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल.

Abstract

प्रायोगिक पूति cecal बंधाव और पंचर polymicrobial पूति का कारण बनता है जो (सीएलपी) की विधि का उपयोग करते हुए चूहों में प्रेरित किया जा सकता है. इधर, एक प्रोटोकॉल CLP तकनीक का उपयोग चूहों में तीव्रता बदलती के पूति के लिए प्रेरित करने के लिए प्रदान की जाती है. भोजी तनाव और रोगज़नक़ आक्रमण करने के लिए एक मौलिक ऊतक प्रतिक्रिया है. प्रयोगात्मक पूति के संदर्भ में vivo में भोजी का आकलन करने के लिए दो मौजूदा प्रोटोकॉल भी यहां प्रस्तुत कर रहे हैं. (मैं) हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) LC3 संलयन प्रोटीन व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों CLP के अधीन हैं. GFP संकेत (puncta) के स्थानीयकृत वृद्धि, immunohistochemical या confocal assays के द्वारा या तो assayed के रूप में, बढ़ाया autophagosome गठन का पता लगाने और, भोजी मार्ग के प्रकार, बदल सक्रियण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. (भोजी उत्तेजना के एक मार्कर के रूप में) इकाई ऊतक क्षेत्र के प्रति (द्वितीय) बढ़ी autophagic रिक्तिका (autophagosome) के गठन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. पूति के लिए autophagic प्रतिक्रियाओं का अध्ययन एक महत्वपूर्ण COMP हैऊतकों संक्रमण का जवाब है जिसके द्वारा तंत्र को समझने की onent. इस क्षेत्र में अनुसंधान के निष्कर्षों अंततः क्रिटिकल केयर मेडिसिन में एक बड़ी समस्या का प्रतिनिधित्व करता है जो पूति के रोगजनन, समझने की दिशा में योगदान कर सकते हैं.

Introduction

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पूति, संक्रमण के लिए एक प्रणालीगत भड़काऊ प्रतिक्रिया, गंभीर रूप से बीमार रोगियों 1 में मौत का एक प्रमुख कारण का प्रतिनिधित्व करता है. अक्सर polymicrobial पूति के लिए अग्रणी अंतर पेट में संक्रमण,, 60% तक 2 की पर्याप्त मृत्यु दर है, जो पूति मामलों के 20% के लिए खाते. पूति से जुड़े मृत्यु दर मुख्य रूप से बाद के अंग विफलता 3,4 साथ कई अंगों में शिथिलता का परिणाम है. इस रोग के रोगजनक तंत्र में अतिरिक्त जांच की तत्काल उपन्यास और अधिक प्रभावी उपचार के विकास को बढ़ावा देने की जरूरत है.

cecal बंधाव और पंचर (सीएलपी) विधि vivo में मॉडलिंग पूति के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रक्रिया है. अंततः अंधान्त्र बैक्टीरिया से भरा है, polymicrobial पेरिटोनिटिस में अपनी पंचर परिणाम, रक्त (bacteremia) में बैक्टीरिया के स्थानान्तरण, सेप्टिक सदमे, बहु अंग शिथिलता और, मौत 5. यह आम तौर पर CLP नैदानिक ​​दर्शाता है कि स्वीकार कर लिया हैअधिक सही ऐसे कृन्तकों में endotoxin या यहां तक कि शुद्ध बैक्टीरिया के इंजेक्शन के रूप में पिछले तकनीकों, से वास्तविकता, इस प्रकार, चिली पूति के रोगजनन की जांच, इसलिए, प्रयोगात्मक शामिल होने के लिए 6 (सीमाओं के बिना नहीं यद्यपि) सोने के मानक माना जाता है और कर रहा है. इस मोनोग्राफ, हम पूति के रोगजनक तंत्र भोजी शामिल है कि क्या आकलन तैयार प्रोटोकॉल का वर्णन.

भोजी, एक evolutionarily संरक्षित सेलुलर प्रक्रिया, क्षतिग्रस्त प्रोटीन और ऐसे mitochondria के रूप में organelles के कारोबार की सुविधा और बैक्टीरिया 7,8 सहित intracellular रोगज़नक़ों की निकासी में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. भोजी के दौरान, साइटोसोलिक प्रोटीन या organelles बाद में गिरावट 9 लाइसोसोम के लिए दिया जाता है, जो autophagosomes बुलाया डबल झिल्ली ही सीमित पुटिका, में तनहा कर रहे हैं. प्रोटीन की एक संख्या भोजी से संबंधित जीन की स्तनधारी homologues (ATG) के रूप में पहचान की गई है,मूल रूप से भोजी की प्रक्रिया को विनियमित जो खमीर में पहचान की. LC3B मैं (स्वतंत्र रूप) से microtubule जुड़े प्रोटीन -1 प्रकाश श्रृंखला 3 बी (LC3B) (Atg8 की सजात) के रूपांतरण (phosphatidylethanolamine संयुग्मित फार्म) द्वितीय LC3B को autophagosome गठन 9 में एक बड़ा कदम का प्रतिनिधित्व करता है. Autophagic शिथिलता उम्र बढ़ने और कैंसर और neurodegenerative विकारों 10 सहित मानव रोगों के साथ जुड़ा हुआ है. इसके अलावा, भोजी ऐसे प्रतिरक्षा कोशिकाओं 8 से प्रतिजन प्रस्तुति, लिम्फोसाइट विकास और cytokine स्राव के रूप में सहज और प्रतिरक्षा अनुकूली प्रभावित करता है. इस प्रकार, यह भोजी भी संक्रमण के लिए प्रणालीगत भड़काऊ प्रतिक्रिया (यानी पूति में) में एक भूमिका निभा सकता है कि उचित लगता है.

तिथि करने के लिए कई तरीके vivo में ऊतक चोट में भोजी की भूमिका का आकलन करने के लिए वर्णित किया गया है. ये हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) LC3 व्यक्त चूहों का इस्तेमाल करते हैं और ऑटो की मात्रा का ठहराव शामिलइलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा ऊतकों में phagosomes (इन दो तरीकों इस मोनोग्राफ में वर्णित किया गया है). अतिरिक्त तरीकों के ऊतक homogenates में autophagic प्रोटीन अभिव्यक्ति की मात्रा का ठहराव, और (कहीं वर्णित) autophagic प्रवाह का विश्लेषण 11-13 में शामिल हैं. इस समीक्षा का लक्ष्य प्रयोगात्मक पूति के संदर्भ में vivo में भोजी का आकलन करने के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल प्रदान करना है.

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Protocol

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नोट: ब्रिघम और महिला अस्पताल / हार्वर्ड मेडिकल स्कूल के स्थान पर संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति निम्नलिखित प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी.

1. Cecal ligation और पंचर

एक ही पृष्ठभूमि के चूहों का उपयोग (C57BL / 6), 8-10 सप्ताह पुराने पुरुष,. मादा चूहों पूति प्रेरित मारक खिलाफ पुरुषों की तुलना में अधिक प्रतिरोधी रहे हैं. 8 सप्ताह की तुलना में बड़े चूहों CLP बाद अस्तित्व के संदर्भ में युवा चूहों की तुलना में कम चर परिणाम. लगभग एन तुलना में समूह में 10 चूहों अस्तित्व विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए =. एन = 3-5 चूहों भोजी assays के लिए पर्याप्त है.

  1. कृंतक सर्जरी के लिए उपयुक्त होना चाहिए जो बाँझ छोटे सर्जिकल उपकरणों (अर्थात् स्केलपेल, कैंची और कुंद संरचनात्मक संदंश), का प्रयोग करें.
  2. संज्ञाहरण मिश्रण तैयार: पीबीएस के 7.95 मिलीलीटर xylazine (AnaSed इंजेक्शन 100 मिलीग्राम / एमएल) के 150 μl और ketamine (Ketaset के 700 μl जोड़ने   CIII, 100 मिलीग्राम / मीएल).
  3. प्रक्रिया के दौरान सड़न रोकनेवाला शर्तों को सुनिश्चित करने के लिए, दस्ताने, चेहरे नकाब और सर्जिकल गाउन पहनते हैं.
  4. जानवरों के वजन. Intraperitonally इंजेक्शन द्वारा उन्हें चतनाशून्य (आईपी) μl (G में 10x शरीर के वजन) की एक खुराक में चरण 3 में वर्णित मिश्रण. उदाहरण के लिए, 22 ग्राम वजन एक माउस के लिए, संवेदनाहारी मिश्रण की 10x22 = 220 μl प्रशासन. इस प्रकार, Xylazine और ketamine के अंतिम खुराक 17 और 80 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन, क्रमशः रहे हैं. कि संज्ञाहरण पर्याप्त है सुनिश्चित करना; छोर का कोई घुमाव पैर के अंगूठे चुटकी के बाद उत्पादन किया जाना चाहिए ध्यान दें:. संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर नेत्र मरहम का प्रयोग करें.
  5. उनकी पीठ पर एक स्वच्छ काम की सतह पर जानवरों रखें. पूंछ और हिंदुस्तान पंजे अन्वेषक ओर उन्मुख होते हैं. . शराब (70% EtOH समाधान) नोट का उपयोग कर पेट की त्वचा कीटाणुरहित: शल्य चिकित्सा के क्षेत्र में पूरी तरह से साथ संपर्क के माध्यम से घाव के संक्रमण से बचने के लिए, मुंडा किया जाना चाहिएफर. इसके अलावा, बेहतर, एक परिसंचारी गर्म पानी पैड सर्जरी के दौरान anesthetized चूहों की normothermia बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
  6. एक छुरी का उपयोग करके, एक छोटे से अनुदैर्ध्य त्वचा चीरा समानांतर बनाने और लगभग 1 सेमी midline के लिए छोड़ दिया. Peritoneal गुहा में अभी तक प्रवेश नहीं करते. प्रारंभिक चीरा विस्तार करने के लिए छोटे कैंची का प्रयोग करें.
  7. पेट की मांसपेशियों को पहचानें और peritoneal गुहा में पहुँच प्राप्त करने के लिए उन्हें काटना.
  8. कुंद संरचनात्मक संदंश का उपयोग करके, अंधान्त्र की पहचान और peritoneal गुहा के बाहर यह चाल है. (इस घातक नकसीर के लिए ले जा सकता है) mesenterial रक्त वाहिकाओं को नुकसान नहीं सावधान रहो.
  9. एक मध्य ग्रेड पूति प्राप्त करने के लिए अंधान्त्र के 60% ligate. के बराबर या कम ग्रेड पूति में अंधान्त्र परिणाम के कम से कम 25% ligating जबकि के बराबर या अंधान्त्र के 75% से अधिक ligating आम तौर पर, उच्च ग्रेड पूति में यह परिणाम है. शेषान्त्रउण्डुकीय वाल्व (यह आंतों निरंतरता ब्लॉक सकता है) ligate के प्रति सावधान रहें.
  10. एक का उपयोग करके21 जी सुई, बंधाव के पास एक के माध्यम से और के माध्यम से पंचर (दो छेद) द्वारा अंधान्त्र छेदना. वेध की दिशा mesenteric से अंधान्त्र के विरोधी mesenteric ओर करने के लिए होना चाहिए. Mesenterial रक्त वाहिकाओं पंचर नहीं सावधान रहो.
  11. सुई निकालें. धीरे दो छेद के माध्यम से प्रत्यक्षता पुष्टि करने के लिए ligated cecum निचोड़, मल का केवल एक छोटी राशि के माध्यम से उन्हें extruded किया जाना चाहिए.
  12. Peritoneal गुहा में ligated और पंचर अंधान्त्र ले जाएँ.
    नोट: नकली चूहों के लिए, कदम 1.10-1.12 छोड़.
  13. पेट की मांसलता को बंद करने के लिए सुई काटने के साथ रेशम सर्जिकल sutures 6-0 का प्रयोग करें. पेट की त्वचा को बंद करने के लिए सुई काटने के साथ रेशम सर्जिकल sutures 6-0 का प्रयोग करें.
  14. गर्मी और प्रक्रिया के दौरान खो हाइड्रेशन को बदलने के लिए prewarmed 1 मिलीलीटर (37 डिग्री सेल्सियस) सामान्य नमक आईपी इंजेक्षन. उनके पुनर्जीवन जब तक एक गर्मी दीपक के तहत चूहों रखें ध्यान दें:. बेहतर, एक सुरक्षित वार्मिंग डिवाइस (रएक परिसंचारी गर्म पानी पैड) के रूप में चर्चा के बजाय एक गर्मी दीपक का इस्तेमाल किया जा सकता है.
  15. Postoperatively पीड़ानाश प्राप्त करने के लिए (. 0.05 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन SC) buprenorphin इंजेक्षन नोट:. यह sternal अवलंबन बनाए रखने के लिए पर्याप्त होश आ गया है जब तक एक जानवर नायाब नहीं छोड़ा जाना चाहिए. एक शल्य चिकित्सा उपचार आया है जो एक जानवर पूरी तरह से ठीक है जब तक अन्य जानवरों की कंपनी को वापस नहीं किया जाना चाहिए.
  16. भोजन और पानी के लिए असीमित उपयोग के साथ वापस अपने पिंजरों में जानवरों रखें. वे (जैसे छुआ जब स्थानांतरित करने के लिए विफलता या नीलिमा के रूप में नैदानिक ​​लक्षण द्वारा इंगित) मरणासन्न बन जब चूहों euthanized किया जाएगा. उन्हें पिछले इच्छामृत्यु को मरने से बचने के लिए चूहों हर 4 घंटे की जाँच करें.

2. ऊतक फसल और फिक्सेशन

  1. एक 4% paraformaldehyde (पीएफए) समाधान तैयार: 889 मिलीलीटर पीबीएस 37% पीएफए ​​के 111 मिलीलीटर जोड़ें.
  2. सीओ 2 प्रेरित निद्रावहन या Ketamine / xylazine या तो उपयोग कर चूहों बलिदानएक उच्च खुराक में olution.
  3. एक स्वच्छ काम की सतह पर चूहों स्थिर. यह कीटाणुरहित 70% EtOH के समाधान के साथ पेट और वक्ष त्वचा स्प्रे.
  4. पेट और वक्ष त्वचा के साथ ही सांस की नली क्षेत्र को कवर त्वचा को हटाने के लिए एक छुरी और छोटे कैंची का प्रयोग करें.
  5. उसके आसपास के ऊतकों (मांसपेशियों और संयोजी ऊतक) को हटाने के द्वारा श्वासनली में पता चलता है.
  6. श्वासनली के आसपास (सुई काटने के बिना) एक सीवन रखें. अभी तक यह कस नहीं है.
  7. 'नली लगाना' श्वासनली के लिए एक छोटा सा परिधीय शिरापरक कैथेटर (20 जी) का प्रयोग करें. सांस की नली आंसू से बचने के लिए कैथेटर प्रविष्टि के दौरान सावधान रहें. श्वासनली के सबसे बड़े व्यास सिर्फ मुद्रिका उपास्थि नीचे है कि ध्यान दें.
  8. श्वासनली / कैथेटर के आसपास सीवन कसो. श्वासनली में कैथेटर का केवल प्लास्टिक प्रवेशनी छोड़ने सुई निकालें. सुई प्लास्टिक प्रवेशनी डालने के लिए एक गाइड तार के रूप में ही कार्य किया.
  9. श्वासनली में प्लास्टिक प्रवेशनी सुरक्षित होने के बाद, वें कटौतीई पेट की मांसलता, पेट खुला और डायाफ्राम प्रकट करते हैं.
  10. एक सुई का प्रयोग, वातिलवक्ष (फुफ्फुस गुहा में हवा की यानी प्रविष्टि) के उत्पादन के लिए डायाफ्राम पंचर. फेफड़ों तो ढह जाना चाहिए.
  11. छोटे कैंची का प्रयोग, उरोस्थि (sternotomy) के साथ काटा डायाफ्राम, हटाने, रिब पिंजरे को हटाने और दिल और फेफड़ों प्रकट करते हैं.
  12. श्वासनली में डाला प्लास्टिक प्रवेशनी के माध्यम से, 30 सेमी एच 2 हे दबाव में formaldehyde समाधान के साथ फेफड़ों को ठीक.
  13. फेफड़ों निकालें और 24 घंटे और बाद में 70% में EtOH के समाधान के लिए 4% पीएफए ​​में उन्हें जगह प्रसंस्करण तक.
  14. दिल, जिगर और गुर्दे को पहचानें और हटा दें. उसी तरह, प्रसंस्करण तक 70% में बाद में EtOH समाधान 24 घंटे के लिए 4% पीएफए ​​में उन्हें जगह और.

3. GFP चूहे और GFP स्लाइड्स के देखने

  1. चरण 1, और पश्चात की प्रक्रिया में वर्णित के रूप में GFP-LC3 चूहों पर CLP और दिखावा सर्जरी प्रदर्शनएस प्रोटोकॉल के चरण 2 में वर्णित है.
  2. आयल में ऊतकों (अर्थात् फेफड़े, दिल, यकृत और गुर्दे) शामिल करें और धारावाहिक 5 माइक्रोन वर्गों में उन्हें काटा.
  3. आयल पिघला देता है और ऊतक पारदर्शी दिखाई देता है जब तक 30-60 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं जब GFP धुंधला के लिए तैयार है,.
  4. Xylene या xylene विकल्प, 5 मिनट xylene 1, xylene 2, और xylene 3 के मानक वर्गीकृत श्रृंखला के साथ Deparaffinize तो श्रेणीबद्ध EtOH की श्रृंखला में 3 मिनट incubations: तो 100%, 95%, 75%, और आसुत पानी में कुल्ला.
    नोट: deparaffinization नमूना पृष्ठभूमि बढ़ जाती है जो ऊतकों सुखाना, से बचने के बाद.
  5. 10-20 मिनट के लिए microwaving द्वारा, साइट्रिक एसिड बफर (10 मिमी सोडियम साइट्रेट एसिड, 0.05% बीच 20, पीएच 6.0) का उपयोग प्रतिजन पुनर्प्राप्ति कार्य करें. ऊतक सुखाना से बचने के लिए समय - समय बफर बदलने के लिए सावधान रहें.
  6. समाधान प्रतिजन पुनर्प्राप्ति पूरा करने के लिए बेंच पर 20 मिनट के लिए शांत करने की अनुमति दें.
  7. पीबीएस के साथ 2-3X धो लें. अतिरिक्त बफर और टीआरए निकालेंnsfer एक स्लाइड बॉक्स या सुखाना को रोकने के लिए अन्य humidified कक्ष में क्षैतिज स्थिति को रैक से स्लाइड.
  8. 10% सामान्य गधा सीरम (भी 5% गोजातीय सीरम albumin, या माध्यमिक एंटीबॉडी उत्पन्न किया गया था, जिसमें पशु से अधिमानतः सीरम) पीबीएस में साथ कमरे के तापमान पर 45-60 मिनट ब्लॉक.
  9. Humidified चैम्बर में 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात पीबीएस में 1:100 कमजोर पड़ने पर प्राथमिक GFP एंटीबॉडी में नमूने सेते हैं. धीरे ऊतक के साथ समरूप संपर्क को बढ़ावा देने और वाष्पीकरण को रोकने के लिए एंटीबॉडी के साथ ऊतक पर Parafilm के छोटे टुकड़े लागू होते हैं.
    नोट: शेष चरणों कमरे के तापमान पर प्रदर्शन कर रहे हैं.
  10. अतिरिक्त प्राथमिक एंटीबॉडी को दूर करने के लिए पीबीएस के साथ 5x धो लें. कमरे के तापमान पर 1-2 घंटे के लिए पीबीएस में माध्यमिक एंटीबॉडी 1:500-1:1,000 साथ सेते हैं.
  11. अतिरिक्त माध्यमिक एंटीबॉडी को दूर करने के लिए पीबीएस के साथ 5x धो लें. अगर वांछित, इस कदम पर स्लाइड counterstain.
  12. फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करते हैं, तो 70% EtOH च में 0.1% सूडान काले सेतेया 15-20 मिनट autofluorescence कम करने के लिए. ऊतक चारों ओर से अतिरिक्त सूडान काले से साफ कर लें और 20 मिनट से अधिक पीबीएस के साथ 5x धोने.
  13. Coverslip के साथ नमूना माउंट और बढ़ते समाधान की स्थापना की है, जब तक क्षैतिज दुकान.

4. वैकल्पिक प्रोटोकॉल: GFP-LC3 की सीधी जांच

  1. 50/50 वी / अक्टूबर पीबीएस वी के एक ~ 500 मिलीलीटर के साथ cannulate और फुलाना फेफड़ों.
  2. एक cryomold के तल में अक्टूबर की एक छोटी राशि डाल द्वारा अक्टूबर में शामिल करें.
  3. सावधानी मोल्ड में विच्छेदित फेफड़ों जटिल जगह है.
  4. Methylbutane सूखी बर्फ का उपयोग कर ठंडा धीरे धीरे स्थिर.
  5. ऊतक पूरी तरह से कवर किया और ठोस जमे हुए है, जब तक अधिक अक्टूबर जोड़ें. -80 डिग्री सेल्सियस पर सूखी बर्फ और दुकान पर रखें
  6. में एक cryomicrotome का प्रयोग, प्रकाश से वर्गों की रक्षा 5-10 माइक्रोन मोटी वर्गों में कटौती. स्टोर वर्गों और -80 डिग्री सेल्सियस पर शेष ऊतक
  7. , इमेजिंग के लिए स्लाइड तैयार फ्रीजर से अनुभाग निकालें और तुरंत सुखाना को रोकने के लिए पीबीएस की एक बूंद लागू करने के लिए.
  8. 4% पीएफए ​​के साथ 30 मिनट के लिए ठीक करें. पीबीएस के साथ धोएं.
  9. 10 मिनट के लिए DAPI / Hoescht लागू करें. पीबीएस के साथ 3x धो लें.
  10. Coverslip के साथ नमूना माउंट और बढ़ते समाधान की स्थापना की है, जब तक क्षैतिज दुकान.
  11. Epifluorescence या confocal खुर्दबीन का उपयोग कर छवि. अप करने के लिए एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर नमूनों.

5. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए ऊतक की तैयारी

  1. फिक्सिंग के लिए लगभग 1 मिमी क्यूब्स में ऊतकों काटें.
  2. 0.1 एम सोडियम cacodylate बफर, 7.4 पीएच में 2% formaldehyde, 2.5% glutaraldehyde में ऊतक को ठीक करें.
  3. 1-2 घंटे के लिए 0.1 एम सोडियम cacodylate बफर के साथ धोएं.
    नोट: तय ऊतक 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.1 एम सोडियम cacodylate में संग्रहित किया जा सकता है
  4. 1 घंटे के लिए 0.2 एम सोडियम cacodylate बफर में 1% आज़मियम tetroxide में तय पोस्ट कर.
  5. 10 मिनट 3x के लिए 0.2 एम सोडियम cacodylate बफर में कुल्ला.
  6. 70% EtOH, 20 मिनट 2x में निर्जलीकरण. 90% EtOH, 10 मिनट 2x में निर्जलीकरण. 100% EtOH में निर्जलीकरण,20 मिनट 2x.
  7. 10 मिनट 2x के लिए propylene ऑक्साइड (epoxy प्रोपेन) के साथ सेते हैं.
  8. 1 घंटे के लिए propylene ऑक्साइड / Epoxy राल मिश्रण (50:50) के साथ सेते हैं. epoxy राल मिश्रण है: 24 ग्राम अगर 100 राल, 13 ग्राम dodecenylsuccinic एनहाइड्राइड, 13 ग्राम methylnadic एनहाइड्राइड और 1 मिलीलीटर एन benzyldimethylamine. एक लकड़ी के रंग का उपयोग करते हुए एक डिस्पोजेबल बीकर में अच्छी तरह से मिलाएं.
  9. Uncapped शीशियों में Epoxy राल रातोंरात (यह किसी भी शेष propylene ऑक्साइड लुप्त हो जाना अनुमति देता है) के साथ सेते हैं.
  10. हौसले से तैयार राल के साथ में लेबल के कैप्सूल में शामिल करें. 48 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर भाजन.
  11. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप फिल्म पर 80 या 60 केवी पर एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग तस्वीर ऊतक वर्गों. फोटो कागज पर चित्र मुद्रित या के रूप में डिजिटल मीडिया की दुकान.
  12. नाभिक युक्त बरकरार कोशिकाओं में autophagosome के गठन का विश्लेषण करें. कम बिजली क्षेत्र (ई. जी. 2,000-4,000 एक्स) nucleated कोशिकाओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. आमतौर पर 6,800-10,000 एक्स छवियों वीं के लिए उपयोग किया जाता हैautophagosome मात्रा का ठहराव है. उपयुक्त सांख्यिकीय प्रतिनिधित्व के लिए 15-30 क्षेत्रों से प्रति इकाई क्षेत्र autophagosomes गणना. Autophagosomes देर चरण autophogosomes भरा रिक्तिकाएं मची जहां डबल झिल्ली संरचना, है.

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Representative Results

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Bacteremia के रूप में जल्दी CLP प्रेरित पूति 14 के बाद 6 घंटे के रूप में चूहों में मौजूद है. (कँपकँपी, tachypnoea और बिगड़ा मोटर गतिविधि सहित) पूति क्लीनिकल संकेत कार्यविधि बाद लगभग 12 घंटा प्रकट. चूहे पेरिटोनिटिस के शामिल होने के बाद करीब 18 घंटे में मरने के लिए शुरू CLP के अधीन है. अधिक गंभीर और अधिक वृद्धि की पूति मारक 15 है. सीएलपी के बाद 7 दिनों में लगभग 60% मृत्यु दर में मध्य ग्रेड पूति परिणाम (इस समय सीमा से परे, कोई मृत्यु उम्मीद कर रहे हैं), जबकि विस्तार में, उच्च ग्रेड पूति (चित्रा 1), 2-3 दिनों के भीतर 100% मृत्यु का कारण बनता है. इसके विपरीत, नकली चूहों की मृत्यु दर शून्य होना चाहिए

चित्रा 1
चूहों में अलग गंभीरता का CLP बाद चित्रा 1. जीवन रक्षा घटता. C57BL 6 / चूहों एक 21 जी सुई के साथ (यानी 'के माध्यम से और के माध्यम से' एक पंचर (दो छेद) cecum करने के लिए छेद की संख्या निरंतर रखने बंधाव समायोजन करके सर्जरी या अलग गंभीरता का CLP प्रेरित पूति शाम अधीन थे ). सीएलपी के बाद 7 दिनों में लगभग 60% मृत्यु दर की ओर जाता है जो एक मध्य ग्रेड पूति, में अंधान्त्र परिणाम के 60% के ligation. ≥ 75 उच्च ग्रेड पूति में अंधान्त्र परिणाम की% और, के ligation बाद में, चिली के बाद 2-3 दिनों के भीतर 100% मृत्यु दर में, जबकि, अंधान्त्र के ≤ 25% की बंधाव, इस प्रकार, कम ग्रेड पूति में होता है और लगभग शून्य मृत्यु दर में. विशिष्ट अस्तित्व के परिणामों से पता चला रहे हैं.

भोजी अध्ययन के प्रयोजनों के लिए, हम मध्य ग्रेड पूति के एक CLP मॉडल को लागू करने के लिए चुना है. कम ग्रेड पूति उच्च ग्रेड पूति (भोजी के शामिल होने से पहले) चूहों के शुरुआती मारक को जन्म दे सकती है, जबकि भोजी प्रेरित करने के लिए अपर्याप्त हो सकता है.

ve_content "> भोजी परख करने की क्रिया के लिए, हम aforementioned पूति प्रोटोकॉल के अधीन GFP-LC3 संलयन प्रोटीन व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों का इस्तेमाल किया है. भोजी मार्ग की उत्तेजना में परिणाम है कि उपचार प्रक्रियाओं के लिए, यह (GFP संकेत की वृद्धि वहाँ स्थानीयकृत किया जाएगा अनुमान है कि puncta), बढ़ाया autophagosome गठन 16 का संकेत immunohistochemical या confocal assays, द्वारा या तो assayed के रूप में.

चित्रा 2
Vivo में इन विट्रो में चित्रा 2. GFP इमेजिंग. (ए, बी) GFP-LC3B चूहों से प्राप्त माउस अंगों में GFP इमेजिंग (जैसे गुर्दा) के प्रतिनिधि उदाहरण. छवि अनुपचारित चूहों से प्राप्त गुर्दे ऊतक के glomeruli में GFP-LC3 puncta से पता चलता है. स्केल सलाखों 10 मिमी =. ( सी, डी) में अतिरिक्त डेटा में इन विट्रो GFP-LC3 इमेजिंग वर्णन करने के लिए प्रदान की जाती हैं. प्राथमिक mesangial कोशिकाओं में पहले वर्णित के रूप में आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों से सेल अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल का उपयोग GFP-LC3 ट्रांसजेनिक चूहों से अलग थे. 17 कोशिकाओं अनुपस्थिति (सी) या TGF-β1 की उपस्थिति (डी) (2 एनजी में incubated रहे थे / एमएल) के 24 घंटे के लिए के रूप में पहले 18 में वर्णित है. TGF-β1 के साथ उपचार autophagosomes (हरा puncta) की बहुतायत में वृद्धि हुई. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

प्रोटोकॉल में उल्लिखित के रूप में यह आगे, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग शास्त्रीय ultrastructural विश्लेषण द्वारा परीक्षण किया जा सकता है. यह सेप्टिक चूहों या अन्य ऊतक चोट मॉडल से प्राप्त ऊतक वर्गों इकाई ऊतक क्षेत्र के प्रति बढ़ाया autophagic रिक्तिका (autophagosome) के गठन को दिखाना होगा कि अनुमान है.

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चित्रा 3. इलेक्ट्रॉन autophagosome गठन के माइक्रोस्कोपी. एक प्रतिनिधि जल्दी से माइक्रोग्राफ और मध्य ग्रेड CLP (60% बंधाव, 21 जी, 2 छेद) के अधीन C57BL 6 / चूहों से ली गई फेफड़े के ऊतकों में देर चरण autophagosome गठन. देर से मंच autophagosomes एक भरा रिक्तिका (Arrowhead) जैसे लगते हैं, जबकि Εarly चरण autophagosomes, एक डबल झिल्ली संरचना (तीर) है. एम mitochondria अर्थ. स्केल बार = 1 माइक्रोन. एक प्रतिनिधि नियंत्रण छवि नकली आपरेशन के अधीन C57BL 6 / चूहों से फेफड़े के ऊतकों का दिखाया गया है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

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सीएलपी के प्रमुख लाभ यह शोधकर्ताओं (कम करने के लिए मध्य और उच्च ग्रेड से आईई) विभिन्न कठोर अनुशासन की पूति जांच करने के लिए अनुमति देता है. प्रेरित पूति की गंभीरता ligated अंधान्त्र की लम्बाई (जो सबसे महत्वपूर्ण निर्धारक) से प्रभावित है, पंचर के लिए प्रयोग की गई सुई का आकार और छेद की संख्या 15 का प्रदर्शन किया. इसके अलावा, माउस तनाव और लिंग पूति की गंभीरता पर प्रभाव डाल सकता है, कई उपभेदों दूसरों की तुलना में अधिक अतिसंवेदनशील होते हैं और पुरुषों आम तौर पर महिलाओं 19,20 से अधिक अतिसंवेदनशील होते हैं. एक साथ लिया उपरोक्त कारकों CLP प्रेरित मृत्यु दर का निर्धारण.

हमारे अनुभव के आधार पर हासिल CLP प्रेरित मृत्यु दर के संबंध में जांचकर्ताओं के बीच एक अंतर है. . उदाहरण के लिए, Rittirsch एट अल एक 60% मृत्यु दर 15 को प्राप्त करने के लिए 'के माध्यम से और के माध्यम से' पंचर (दो छेद) 50% बंधाव, 21 जी, 1 इस्तेमाल किया, हमारे शोध समूह की जरूरत में एक अन्वेषकएड ही मृत्यु को प्राप्त करने के लिए एक से थोड़ा अधिक गंभीर मॉडल (60% बंधाव, 21 जी, 1 'के माध्यम से और के माध्यम से' पंचर) का उपयोग करने के लिए, जबकि, हमारे शोध समूह में एक और अन्वेषक 100% बंधाव के पास (एक अधिक गंभीर मॉडल का इस्तेमाल किया , 19 जी, 1 'के माध्यम से और के माध्यम से' पंचर) एक बहुत कम मृत्यु दर (केवल 25%) प्राप्त करने के लिए. मन में उपरोक्त बातों के साथ, एक CLP (यानी निम्न, मध्य या उच्च ग्रेड पूति) की गंभीरता के लक्षण वर्णन बल्कि भावी (लगाने से IE से (जिसके परिणामस्वरूप मृत्यु दर को देखकर यानी) retrospectively किया जाना चाहिए कि तर्क दे सकते हैं कुछ शर्तों, उदाहरण के लिए 50% बंधाव). एक ऑपरेटर के लगभग 60% की मृत्यु को प्राप्त होता है, तो, यह कोई फर्क नहीं पड़ता (जैसे अंधान्त्र ligated और प्रदर्शन किया छेद की संख्या की लंबाई के रूप में) की स्थिति लागू कर रहे हैं, जो मध्य ग्रेड पूति है. इस प्रकार, यह ऑपरेटर चूहों के 60% मर जिसके तहत उन लोगों की पहचान करने के लिए विभिन्न स्थितियों की कोशिश है कि उचित लगता है. फिर, ऑपरेटरदोनों समूहों की तुलना में किया जा रहा है वास्तव में एक ही स्थितियों को लागू करने की है.

बिल्कुल वैसी ही स्थितियां लागू करने से (जैसे ligated अंधान्त्र की लंबाई, पंचर के लिए प्रयोग की गई सुई का आकार, प्रदर्शन किया छेद की संख्या, माउस तनाव, और लिंग), यह सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम 15 का उत्पादन किया जाएगा कि पूर्वानुमानित है. हालांकि, यहां तक ​​(खाते में ऊपर निर्धारकों ले) एक मानकीकृत तरीके से सीएलपी के प्रदर्शन के बाद, परिवर्तनशीलता हो सकती है. - 6 '- यहां तक कि एक ही कूड़े से एक चर व्यक्तिगत प्रभाव देखा जा सकता है समान अपमान हूबहू जानवरों के समूहों के आयु वर्ग के लिए दिया जाता है, तब भी जब' ऐसा लगता है कि विशेषज्ञों द्वारा मान्यता दी गई है. इस प्रकार, परिवर्तनशीलता को कम करने की कोशिश में, यह ऑपरेटर एक ही दिन दोनों की तुलना समूहों में CLP करते हैं कि उचित लगता है.

भोजी का विश्लेषण, एक गतिशील सेलुलर प्रक्रिया जटिल है. इस monogra में उल्लिखित प्रोटोकॉल्सपीएच autophagosome गठन के जैव रासायनिक या रूपात्मक विश्लेषण के आधार पर, विवो में भोजी सक्रियण के आकलन के लिए आधार प्रदान करते हैं. सिद्धांत रूप में, इस अध्याय में प्रदान प्रोटोकॉल पूति के CLP या वैकल्पिक मॉडल के अधीन चूहों में किसी भी अंग के ऊतकों में भोजी का विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है. जिगर आम तौर पर सीएलपी के एक प्राथमिक लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करने के लिए स्वीकार कर लिया है, जबकि इस प्रक्रिया भी फेफड़ों या आगे के अध्ययन के योग्य है जो गुर्दे ऊतक, को चोट के कारण हो सकता है. hepatocytes के भोजी पर सीएलपी का प्रभाव अपेक्षाकृत अच्छी तरह से गुर्दे या फेफड़ों की भोजी पर इसके प्रभाव की तुलना में अध्ययन किया गया है, और कुछ प्रासंगिक सबूत हाल ही में 21,22 प्रकाशित किया गया है.

यह वृद्धि हुई autophagosome संख्या भी lysosomal समारोह और अंत में मंच प्रसंस्करण की रुकावट के माध्यम से भोजी शिथिलता प्रतिबिंबित कर सकते हैं के रूप में इन, भोजी के स्थिर उपाय कर रहे हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिए. इस संबंध में इन assays बायोकेम साथ पूरित किया जाना चाहिएautophagic सब्सट्रेट कारोबार (उदाहरण के लिए राजनैतिक assays   हाल ही में वर्णित है और में विवो के लिए अनुकूलित के रूप में प्रवाह) 11 का विश्लेषण करती है. हाल ही में 12,13 के रूप में वर्णित ये assays भी ऊतक में महत्वपूर्ण भोजी प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए मानक पश्चिमी immunoblot विश्लेषण से पूरित किया जा सकता है. इस प्रकार, यह इन परीक्षणों का एक संयोजन घायल ऊतक 16 में भोजी की स्थिति का सही अनुमान हासिल करने के लिए लागू किया जा सिफारिश की है.

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Disclosures

लेखकों घोषित करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है

Acknowledgments

इस काम AMK चोई के लिए एनआईएच अनुदान P01 HL108801, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, द्वारा समर्थित किया गया. एस Ryter लोवेलास श्वसन अनुसंधान संस्थान से वेतन समर्थन प्राप्त किया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GFP-LC3 Transgenic Mice Riken (Japan) RBRC00806 GFP-LC3#53
Xylazine Henry-Schein 568-0606 Xylazine HCl Injection Vet
Ketamine Henry-Schein 995-2949 Ketaset Inj 100 mg/ml
EtOH Fisher A405-20 Histology Grade
EtOH Fisher A407-1 For Sterilizatiion
silk surgical sutures 6-0 Owens & Minor 2300-0078OG, 017624
buprenorphine-HCl Henry-Schein 614-5157 Buprenex Ampules
paraformaldehyde (37%) solution JT Baker S898-09
xylenes Fisher X3P-1GAL
anti-GFP monoclonal antibody Life Technologies G10362
Hoescht Sigma 944403
DAPI Invitrogen D1306
OCT VWR scientific 25608-930
Sudan Black Santa Cruz sc-203760
EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate Electron microscopy Sciences 15960
propylene oxide Sigma 240397
Agar 100 resin Agar scientific R1045
dodecenylsuccinic anhydride Sigma 46346
methylnadic anhydride Sigma 45359
N-benzyldimethylamine Sigma 185582

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References

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Cecal ligation और चूहे में भोजी अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में पूति पंचर प्रेरित
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Siempos, I. I., Lam, H. C., Ding, Y., Choi, M. E., Choi, A. M. K., Ryter, S. W. Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice. J. Vis. Exp. (84), e51066, doi:10.3791/51066 (2014).More

Siempos, I. I., Lam, H. C., Ding, Y., Choi, M. E., Choi, A. M. K., Ryter, S. W. Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice. J. Vis. Exp. (84), e51066, doi:10.3791/51066 (2014).

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