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Immunology and Infection

맹장 결찰 및 마우스에서 autophagy에 공부를 모델로 패혈증 관통 유도

doi: 10.3791/51066 Published: February 9, 2014

Summary

실험 패혈증은 맹장 결찰과 천자 (CLP) 방법을 사용하여 마우스에서 유발 될 수있다. CLP - 유도 패혈증의 컨텍스트에서 생체에 autophagy를 평가하는 현재의 프로토콜이 여기에 제시된다 : (GFP) - LC3 마우스를 사용 autophagy에 측정을위한 프로토콜, 및 전자 현미경에 의해 autophagosome 형성을 측정하기위한 프로토콜.

Abstract

실험 패혈증은 맹장 결찰과 천자 polymicrobial 패혈증 발생 (CLP) 방법을 사용하여 마우스에서 유발 될 수있다. 여기서, 프로토콜 CLP 기술을 사용하여 마우스에 다양한 중증도의 패혈증을 유발하도록 제공된다. autophagy에 스트레스와 병원균 침입에 대한 근본적인 조직의 반응이다. 실험 패혈증의 맥락에서 생체 내에서 autophagy에를 평가하기 위해 현재의 두 프로토콜도 여기에 표시됩니다. (I), 녹색 형광 단백질 (GFP) - LC3 융합 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스는 CLP을 실시한다. GFP 신호 (puncta에)의 현지화 강화는 면역 또는 공 촛점 분석에 의해 하나 정량으로, 향상된 autophagosome 형성을 감지하고, autophagy에 경로의 따라서 변경 활성화하는 데 사용할 수 있습니다. (autophagy에 자극 마커 등) 단위 조직 면적당 (II) 향상된 autophagic 액포 (autophagosome) 형성은 전자 현미경을 사용하여 정량화 될 수있다. 패혈증 autophagic 반응의 연구는 중요한 샘플입니다조직이 감염에 반응하는 메커니즘을 이해 onent. 이 지역에있는 연구 결과는 궁극적 중요한 치료 의학의 주요 문제를 나타내는 패혈증의 발병 기전을 이해에 기여할 수있다.

Introduction

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패혈증, 감염에 대한 전신 염증 반응은 비판적으로 아픈 환자 1에서 사망의 주요 원인을 나타냅니다. 자주 polymicrobial 패혈증에 이르는 복강 내 감염, 최대 60 % 2의 상당한 사망률이있는, 패혈증 케이스의 20 %를 차지하고있다. 패혈증 관련 사망률은 주로 다음 장기 부전 3,4에 다 장기 부전의 결과. 이 질병의 발병 메커니즘에 추가적인 조사가 급하게 신규하고보다 효과적인 치료법의 개발을 촉진하기 위해 필요하다.

맹장 결찰술 및 천자 (CLP) 방법은 생체 내에서 모델링 패혈증 일반적으로 사용되는 절차입니다. 궁극적으로 맹장 박테리아 가득으로, polymicrobial 복막염에서의 천자 결과, 혈액 (균혈증)에 박테리아의 전위, 패 혈성 쇼크, 다 장기 부전 및 사망 5. 그것은 일반적으로 CLP 임상 반영 접수더 정확하게 설치류에 독소 또는 정제 된 박테리아의 주사와 같은 이전 기술보다 현실 따라서, CLP는 패혈증의 발병 기전의 조사, 따라서 실험 유도 6 (하지 제한없이이기는하지만) 황금 표준으로 간주된다. 이 논문에서, 우리는 패혈증의 발병 메커니즘은 autophagy에 포함 여부를 평가하기위한 프로토콜을 설명합니다.

autophagy에, 진화 적으로 보존 된 휴대 과정은 손상된 단백질과 같은 미토콘드리아 같은 세포 내 소기관의 턴 오버를 촉진하고 세균 7,8 등의 세포 내 병원균의 정리에 중요한 역할을합니다. autophagy를하는 동안, 세포 내 단백질이나 세포 소기관은 이후 저하 9의 리소좀에 전달 autophagosomes라는 이중 막 결합 소포로 압수됩니다. 단백질의 수는 autophagy에 관련 유전자의 포유 동물 동족체 (ATG)으로 식별 된,원래는 autophagy의 과정을 조절하는 효모에서 발견. LC3B-I (자유 양식)에서 미세 소관 관련 단백질 1 경쇄 3B (LC3B) (Atg8의 상동)의 변환 (포스파티딜 에탄올 아민 - 복합 양식)-II를 LC3B하려면 autophagosome 형성 9에있는 중요한 단계를 나타냅니다. Autophagic 장애는 노화와 암, 신경 퇴행성 질환 (10)을 포함하여 인간의 질병과 연관되어 있습니다. 또한, autophagy에는 면역 세포 (8)에 의해 항원 프레 젠 테이션, 림프구 개발과 사이토 카인의 분비와 같은 타고난 및 적응 면역에 영향을 미칩니다. 따라서, autophagy에 또한 감염에 전신 염증 반응 (즉, 패혈증)에 역할을 할 수 있다는 합리적인 것 같다.

지금까지 여러 가지 방법이 생체 내에서 조직 손상에 autophagy에의 역할을 평가하기 위해 기술되었다. 이들은 녹색 형광 단백질 (GFP) LC3 표현 생쥐의 사용과 자동의 정량화를 포함전자 현미경으로 조직 된 phagosomes는 (이 두 가지 방법은이 논문에서 설명합니다). 추가 방법은 조직 균질 autophagic 단백질 발현의 정량화하고, (다른 곳에서 설명) autophagic 플럭스의 분석 11 ~ 13 있습니다. 이 검토의 목적은 실험 패혈증의 컨텍스트에서 생체 내 autophagy에 대한 평가를 위해 현재의 프로토콜을 제공하는 것이다.

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Protocol

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참고 : 브리검 여성 병원 / 하버드 의과 대학 지역의 기관 동물 관리 및 사용위원회는 다음과 같은 절차를 승인했다.

1. 맹장 내고와 빵꾸

같은 배경의 마우스를 사용합니다 (C57BL / 6), 8-10 주 된 남성. 암컷 생쥐는 패혈증에 의한 치사율에 대한 남성보다 더 강한입니다. 팔주 세 이상 마우스는 CLP 후 생존의 측면에서 젊은 쥐보다 변수 결과를 생산하고 있습니다. 약 N은 비교 그룹에 10 마우스는 생존 분석을 위해 사용되어야한다 =. N = 3-5 마우스는 autophagy에 분석 실험에 적합하다.

  1. 설치류 수술에 적합해야한다 멸균 작은 수술기구 (즉 메스, 가위 무딘 해부 집게를) 사용합니다.
  2. 마취 혼합물을 제조 : PBS의 7.95 mL에 자일 라진 (AnaSed 주사 100 ㎎ / ㎖)의 150 μL와 케타민 (Ketaset 700 μl를 추가   CIII, 100 ㎎ / mL).
  3. 절차를 수행하는 동안 무균 조건을 보장하기 위해, 장갑, 얼굴 마스크와 수술 가운을 착용한다.
  4. 동물의 무게를. intraperitonally 주입을 마취 (IP) μL (g에서 10 배의 체중)의 투여 량에서 3 단계에서 언급 한 혼합물. 예를 들어, 22g 무게 마우스의 마취 혼합물의 10x22 = 220 μl를 관리 할 수​​ 있습니다. 따라서, 자일 라진 및 케타민의 최종 투여 량은 17 ~ 80 ㎎ / kg 체중, 각각이다. 그 마취가 적절한 지 확인, 극한의 더 굴곡 발가락 핀치 이후에 생산 될 수 없습니다 참고 :. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 안과 연고를 사용합니다.
  5. 그들의 뒤에 깨끗한 작업 표면에 동물을 배치합니다. 꼬리와 뒷발은 수사관을 지향하고 있습니다. . 알코올 (70 %의 EtOH 용액)을 참고하여, 복부의 피부를 소독 : 외과 분야는 완전히 접촉을 통해 상처의 오염을 피하기 위하여, 면도해야모피. 또한, 최적, 순환 온수 패드는 수술 중 마취 된 쥐의 normothermia을 유지하는 데 사용되어야한다.
  6. 메스를 사용함으로써, 작은 피부 절개 길이 방향과 평행하게 약 1cm은 정중선하는 왼쪽. 복강에 아직 침투하지 마십시오. 초기 절개를 확장하는 작은 가위를 사용합니다.
  7. 복부 근육을 확인하고 복강에 액세스 할을 해부하다.
  8. 무딘 해부 집게를 사용하여, 맹장을 확인하고 복강 밖으로 이동합니다. (이것은 치명적인 출혈로 이어질 수) mesenterial 혈관이 손상되지 않도록주의하십시오.
  9. 중간 등급 패혈증을 달성하기 위해 맹장의 60 %를 결찰. 같거나 저급 패혈증 맹장 결과의 25 % 미만을 결찰 반면 동일하거나 맹장의 75 % 이상을 결찰하는 것은 일반적으로 고품위 패혈증 초래한다. 회맹 (이것은 장 연속성을 차단할 수) 결찰하지 않도록주의하십시오.
  10. 를 사용함으로써21 G 바늘, 결찰 근처에 한 관통 한 구멍 (2 개 구멍)에 의해 맹장 천공. 천공 방향은 장간막에서 맹장의 안티 장간막 측에 있어야한다. mesenterial 혈관에 구멍을하지 않도록주의.
  11. 바늘을 제거합니다. 가볍게 두 개의 구멍을 통해 개방성을 확인하기 위하여 맹장 결찰 짤; 배설물의 소량 만이 그들을 통해 압출한다.
  12. 복강에 결찰 및 천공 맹장 이동합니다.
    참고 : 가짜 마우스의 경우, 1.10 ~ 1.12 단계를 건너 뜁니다.
  13. 복부 근육을 닫 바늘을 절단 실크 봉합 수술에게 6-0를 사용합니다. 복부 피부를 닫 바늘을 절단 실크 봉합 수술에게 6-0를 사용합니다.
  14. 열 및 절차를 수행하는 동안 손실 된 수분을 대체 할 예비 가온 1 ML (37 ° C) 생리 식염수의 IP를 주입한다. 자신의 소생 할 때까지 가열 램프 아래에 마우스를 놓고 참고 :. 최적, 안전 온난화 장치 (SU순환 온수 패드) 등 CH 대신 가열 램프를 사용할 수있다.
  15. 수술 후 진통을 달성하기 위해 (. 0.05 ㎎ / ㎏ 체중 SC)의 buprenorphin 주입 참고 :.은 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 동물이 방치 할 수 없습니다. 수술 적 치료를 겪은 동물이 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 반환 할 수 없습니다.
  16. 음식과 물에 대한 무제한 액세스를 다시 자신의 새장에있는 동물을 놓습니다. 그들은 (예 : 터치시 이동 장애 또는 청색증 등의 임상 증상으로 표시) 빈사가되면 마우스는 안락사됩니다. 그 전에 안락사에 죽는 것을 피하기 위해 마우스마다 4 시간을 확인합니다.

2. 조직 수확 및 고정

  1. 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 솔루션을 준비 889 ml의 PBS는 37 % PFA 111 ML을 추가합니다.
  2. CO 2에 의한 마취 또는 케타민 / 자일 라진의 하나를 사용하여 마우스를 희생높은 복용량에서 olution.
  3. 깨끗한 작업 표면에 마우스를 고정시킨다. 그것을 소독 70 %의 EtOH 용액으로 복부와 가슴 피부를 스프레이.
  4. 복부 및 흉부 피부뿐만 아니라 기관의 지역을 커버하는 피부를 제거하는 메스와 작은 가위를 사용합니다.
  5. 그 주변의 조직 (근육과 결합 조직)을 제거하여기도를 알 수있다.
  6. 기관의 주위에 (바늘을 절단하지 않고) 봉합사를 놓습니다. 아직 조이지 마십시오.
  7. '삽관'기관으로 작은 말초 정맥 카테터 (20 G)를 사용합니다. 기관의 눈물을 피하기 위해 카테터 삽입시주의해야합니다. 기관의 가장 큰 직경이 바로 윤상 연골 아래에 있습니다.
  8. 기관 / 카테터 주위에 봉합사를 조입니다. 기관에 카테터 만 플라스틱 캐 뉼러를 떠나 바늘을 제거합니다. 니들은 플라스틱 캐 뉼러를 삽입하기위한 가이드 선으로 만 제공.
  9. 기관에 플라스틱 캐 뉼러를 확보 한 후, 일을 절단전자, 복부의 근육, 배를 열고 다이어프램을 보여준다.
  10. 바늘을 사용하여, 기흉 (흉강으로 공기 즉, 삽입)을 생성하기 위해 격막을 천공. 폐는 축소되어야한다.
  11. 작은 가위를 사용하여, 가슴 뼈 (흉골)을 따라 절단 다이아 프램을 제거, 갈비뼈를 제거하고 심장과 폐를 알 수있다.
  12. 기관에 삽입 된 플라스틱 캐 뉼러를 통해, 30cm의 H 2 O의 압력 하에서 포름 알데히드 용액으로 폐를 고정합니다.
  13. 폐를 제거하고 24 시간 이후에 70 %의 EtOH로 솔루션에 대한 4 % PFA에 넣지 처리까지.
  14. 심장, 간, 신장을 식별하고 제거 할 수 있습니다. 동일한 방식으로, 처리 될 때까지 70 %의 EtOH에이어서 용액을 24 시간 동안 4 % PFA로 그들을 배치.

3. GFP 마우스 및 GFP의 슬라이드보기

  1. 1 단계, 수술 후 절차에 따라 GFP-LC3 마우스에 CLP 및 가짜 수술을발 프로토콜의 단계 2에서 설명한 바와 같이.
  2. 파라핀 조직 (즉, 폐, 심장, 간, 신장)을 포함하고 직렬 5 μm의 섹션에서 그들을 잘라.
  3. 파라핀이 녹아 조직이 반투명 나타날 때까지 30 ~ 60 분 동안 60 ° C에서 배양하면 GFP 염색에 대 한 준비.
  4. 자일 렌, 크실렌 대체,로 5 분 크실렌 1, 자일 렌 2, 자일 렌 (3)의 표준 등급 시리즈 Deparaffinize 다음 등급의 EtOH 시리즈의 3 분의 배양 : 후 100 %, 95 % 75 % 및 증류수에 헹군다.
    참고 : 탈 파라핀 샘플 배경을 증가 조직의 건조를 방지 한.
  5. 10-20 분 동안 레인지 작동하여, 구연산 완충액 (10 mM의 시트르산 나트륨 산, 0.05 % 트윈 20, pH를 6.0)를 사용하여 항원 검색을 수행. 조직의 건조를 방지하기 위해 주기적으로 버퍼를 대체 할주의하십시오.
  6. 솔루션은 항원 검색을 완료하는 벤치에 20 분 동안 식히십시오.
  7. PBS로 2 배를 씻으십시오. 여분의 버퍼와 육 차원 속의를 제거nsfer 슬라이드 상자 또는 건조를 방지하기 위해 다른 가습 실에서 수평 위치로 랙에서 슬라이드.
  8. 10 % 정상 당나귀 혈청 (도 5 % 소 혈청 알부민, 또는 차 항체가 생성되는 동물 바람직 혈청) PBS에 실온에서 45 ~ 60 분을 차단합니다.
  9. 가습 실에서 4 ° C에서 하룻밤 PBS에서 1:100 희석에서 기본 GFP 항체에 샘플을 품어. 부드럽게 조직과 균일 한 접촉을 촉진하고 증발을 방지하는 항체와 조직을 통해 파라 필름의 작은 조각을 적용합니다.
    참고 : 나머지 단계는 실온에서 수행된다.
  10. 초과 기본 항체를 제거하는 PBS로 5 배를 씻으십시오. 실온에서 1 ~ 2 시간 동안 PBS에있는 이차 항체 1:500-1:1,000에 품어.
  11. 과잉 차 항체를 제거하는 PBS로 5 배를 씻으십시오. 원하는 경우,이 단계에서의 슬라이드를 counterstain.
  12. 형광 차 항체를 사용하는 경우, 70 % EtOH로 F에서 0.1 % 수단 검정을 품어또는 15 ~ 20 분은 형광도를 줄일 수 있습니다. 조직 주위에서 초과 수단 검정을 닦아내고 20 분 동안 PBS로 5 배 씻는다.
  13. coverslip에 샘플을 장착 및 설치 솔루션으로 설정 될 때까지, 수평으로 저장합니다.

4. 대체 프로토콜 : GFP-LC3의 직접 검출

  1. (50 / 50) V / 10월 PBS V의 ~ 500 mL를 Cannulate 및 팽창 폐.
  2. cryomold의 바닥에의 OCT 소량을 넣어 OCT에서 포함 할 수 있습니다.
  3. 조심스럽게 금형 해부 폐 단지를 배치합니다.
  4. 메틸 부탄은 드라이 아이스를 사용하여 냉장을 통해 천천히 동결.
  5. 조직이 완전히 덮여 얼어 될 때까지 더 OCT를 추가합니다. -80 ° C에서 드라이 아이스와 저장소에 보관
  6. cryomicrotome를 사용하여, 빛의 섹션을 보호하는 5 ~ 10 μm의 두께 부분을 잘라. 저장소 섹션 및 -80 ° C에서 나머지 조직
  7. , 이미지에 대한 슬라이드를 준비 냉동고에서 섹션을 제거하고 즉시 건조를 방지하기 위해 PBS의 드롭을 적용하려면.
  8. 4 % PFA로 30 분 동안 수정. PBS로 세척.
  9. 10 분 동안 DAPI / Hoescht을 적용합니다. PBS로 3 회 세척한다.
  10. coverslip에 샘플을 장착 및 설치 솔루션으로 설정 될 때까지, 수평으로 저장합니다.
  11. 표면 형광 또는 공 초점 현미경을 사용하여 이미지. 최대 1 개월 4 ° C에서 보관 샘플.

5. 전자 현미경에 대한 조직의 준비

  1. 고정 약 1mm의 큐브로 조직을 잘라.
  2. 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼, pH를 7.4에서 2 %의 포름 알데히드, 2.5 % 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde)의 조직을 고정합니다.
  3. 1 ~ 2 시간 동안 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼로 세척.
    참고 : 고정 된 조직을 4 ℃에서 0.1 M 나트륨 cacodylate에 저장 될 수있다
  4. 1 시간 동안 0.2 M 나트륨 cacodylate 버퍼에 1 % 오스뮴에 수정 프로그램을 게시합니다.
  5. 10 분 배를위한 0.2 M 나트륨 cacodylate 버퍼에 씻어.
  6. 70 % EtOH로, 20 분 배에 탈수. 90 %의 EtOH, 10 분 2X에서 탈수. 100 %의 EtOH에 탈수,20 분의 2 배.
  7. 10 분 2X 용 프로필렌 옥사이드 (에폭시 프로판)와 함께 배양한다.
  8. 1 시간 프로필렌 옥사이드 / 에폭시 수지 혼합물 (50:50)으로 배양한다. 에폭시 수지의 혼합물이다 : 24g 한천 100 수지, 도데 세닐 숙신산 무수물 13g, 13g 및 무수 메틸 나 1ml의 N-벤질 디메틸 아민. 나무 주걱을 사용하여 일회용 비이커에 철저하게 섞는다.
  9. 세척제 유리 병에 에폭시 수지 하룻밤 (이 남아있는 프로필렌 옥사이드가 증발 할 수 있습니다)에 품어.
  10. 새로 제조 된 수지로 표시 캡슐에 포함. 48 시간 동안 60 ° C에서 중합.
  11. 전자 현미경 필름 상에 80 또는 60 kV의에서 투과형 전자 현미경을 사용하여 사진 조직 섹션. 사진 용지에 이미지를 인쇄하거나 디지털 미디어를 저장합니다.
  12. 핵을 포함하는 손상 세포에 autophagosome 형성을 분석합니다. 낮은 전력 필드 (E. g. 2,000-4,000 X)는 유핵 세포를 식별하기 위해 사용될 수있다. 일반적으로 6,800-10,000 X 이미지는 일에 사용됩니다autophagosome 정량화입니다. 적절한 통계적 표현을위한 15 ~ 30 필드에서 단위 면적당 autophagosomes를 계산합니다. Autophagosomes 늦게 단계 autophogosomes이 채워진 액포를 닮은 이중 막 구조를 가지고.

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Representative Results

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균혈증은 초기 CLP-유도 패혈증 14 후 6 시간으로 마우스에 존재한다. (오한, tachypnoea 및 손상 모터 활동 포함) 패혈증의 임상 증상은 수술 후 약 12​​ 시간으로 나타납니다. 마우스는 복막염의 유도 후 약 18 시간에서 죽기 시작 CLP를 실시. 더 심한 더 증가 패혈증은 ​​치사율 (15)이다. CLP 후 7 일에서 60 %의 사망률 중급 패혈증 결과 (이 시간 제한을 넘어, 사망자가 예상되지는) 동안 구체적으로, 고급 패혈증 (그림 1) 2 ~ 3 일 이내에 100 % 사망의 원인이됩니다. 대조적으로, 모의 생쥐의 사망률이 0이어야

그림 1
생쥐의 다른 심각도의 CLP 후 그림 1. 생존 곡선. C57BL / 6 마​​우스는 21 G 바늘로 (즉, '관통 한'한 천자 (이 구멍) 맹장에 천공의 수를 일정하게 유지 결찰을 조정함으로써, 수술 또는 다른 심각도 CLP - 유도 패혈증 가짜 행 하였다 ). CLP 후 7 일에서 60 % 사망에 이르게 중간 등급 패혈증에서 맹장 결과 60 %의 결찰. ≥ 75 고급 패혈증 맹장 결과의 %와, 결찰 이후, CLP 후 2 ~ 3 일 이내에 100 % 사망에; 동안은 맹장의 ≤ 25 %의 결찰, 따라서, 낮은 수준의 패혈증에 이르게 거의 제로 사망률. 일반적인 생존의 결과가 표시됩니다.

autophagy에 연구의 목적을 위해, 우리는 중간 수준의 패혈증의 CLP 모델을 구현하기로 결정했습니다. 낮은 수준의 패혈증 고급 패혈증 (autophagy를 유도하기 전에) 생쥐의 초기 사멸로 이어질 수 있지만, autophagy를 유도하기 위해 부적절 할 수 있습니다.

ve_content "> autophagy에 시금 위해, 우리는 상기 패혈증 프로토콜을 실시 GFP-LC3 융합 단백질을 발현하는 형질 전환 생쥐를 사용했습니다. autophagy에 통로의 자극을 초래할 처리 절차, 그것은 (GFP 신호의 향상이 지역화 될 것으로 예상된다 puncta에), 강화 autophagosome 형성 16 나타내는 면역 또는 공 촛점 분석에 의해 하나 정량으로.

그림 2
생체 내시험 관내에서 그림 2. GFP 영상. (A, B) GFP-LC3B 마우스에서 얻은 마우스 장기 GFP 영상 (예를 들어, 신장)의 대표적인 예. 이미지 처리되지 않은 쥐에서 얻은 신장 조직의 사구체에서 GFP-LC3의 puncta에 보여줍니다. 스케일 바는 10mm를 =. ( C, D)의 추가 데이터는 체외 GFP-LC3 영상을 보여주기 위해 제공됩니다. 차 사구체 간질 세포는 이전에 설명한 바와 같이 유전자 재조합 쥐에서 세포 분리를위한 프로토콜을 이용하여 GFP-LC3 트랜스 제닉 마우스로부터 단리 하였다. 17 세포 부재 (C) 또는 TGF-β1의 존재 (D) (2 NG 배양 하였다 / ml)을 24 시간 동안 앞서 18을 설명했다. TGF-β1과 치료 autophagosomes (녹색 puncta에)의 풍부 증가했다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜에 설명 된대로 이것은 또한, 전자 현미경을 사용하여 고전 미세 분석에 의해 시험 될 수있다. 그것은 패혈증 마우스 또는 기타 조직 손상 모델에서 얻은 조직 섹션 단위 조직 면적당 강화 autophagic 액포 (autophagosome) 형성을 보여줄 것으로 예상된다.

"FO : 유지 - together.within 페이지 ="e_content 항상 "> 그림 3
그림 3. 전자 autophagosome 형성의 현미경. 대표적인 초기의 현미경 및 중간 등급의 CLP (60 % 내고, 21 G, 2 홀)을 실시 C57BL / 6 마우스에서 가져온 폐 조직에있는 늦게 단계 autophagosome 형성. 말기 autophagosomes가 채워진 공포 (화살촉)를 닮아 Εarly 단계 autophagosomes는 이중 막 구조 (화살표)가있다. M은 미토콘드리아를 나타낸다. 스케일 바 = 1 μm의. 대표적인 제어 이미지는 가짜 작업을 실시, C57BL / 6 마우스에서 폐 조직으로 표시됩니다. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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CLP의 주요 장점은 연구원이 (저에 대한 중간 및 높은 수준에서 즉) 다른 심각도의 패혈증을 조사 할 수 있다는 것입니다. 유도 패혈증의 심각도는 맹장 결찰의 길이 (가장 중요한 결정 인자)에 의해 영향을받는, 천자 사용 바늘의 크기와 구멍의 수는 15을 수행 하였다. 또한, 마우스의 피로와 성별은 패혈증의 정도에 영향을 미칠 수 있으며, 몇 가지 계통이 다른 사람보다 더 민감하고 남성은 일반적으로 여성 (19, 20)보다 더 취약합니다. 함께 찍은 위의 요인은 CLP에 의한 사망률을 결정합니다.

우리의 경험에 근거하여 달성 CLP 인한 사망률과 관련 연구자 간의 차이가있다. . 예를 들어, Rittirsch는 60 %의 사망률 (15)를 달성하기 위해 '관통 한'천자 (두 개의 구멍) 50 % 내고, 21 G, 1을 사용, 우리의 연구 그룹을 필요로하는 조사에드는 같은 사망률을 얻기 위해 조금 더 심각 모델 (60 % 내고, 21 G, 1 '관통 한'천자)를 사용합니다; 반면, 우리의 연구 그룹의 다른 수사관은 100 % 내고 근처 (더 심한 모​​델을 사용 19 G 1 '관통 한'천자) 훨씬 낮은 사망률 (25 %)을 달성했다. 마음에 위의 고려 사항으로, 하나는 CLP (즉, 낮은, 중간 또는 높은 수준의 패혈증)의 심각도의 특성이 아니라 전향 적 (적용하여 즉,보다 (결과 사망률을 보면 즉,) 후 향적으로 수행되어야 함을 주장 할 수 특정 조건, 예를 들면 50 %의 결찰). 운영자가 약 60 %의 사망률을 달성 할 때,이 상관없이 (예 : 맹장 결찰 및 수행 구멍의 수의 길이와 같은) 조건이 구현되는 중간 수준의 패혈증입니다. 그러므로, 오퍼레이터가 마우스의 60 %가되는 다이 미만 식별하는 다른 조건을 시도하는 것이 합리적인 것으로 보인다. 그리고, 조작자두 그룹을 비교하고 정확히 동일한 조건을 구현해야합니다.

정확히 동일한 조건 구현함으로써 (예를 들어 라이 게이션 맹장의 길이, 천자 사용 바늘의 크기를 수행 구멍의 수는 마우스 균주 및 성별)는, 그것이 일관성과 재현성있는 결과 (15)를 생성 할 것으로 예상된다. 그러나, (계정에 위의 결정을 복용) 표준화 된 방식으로 CLP의 성능 후, 변화가 발생할 수 있습니다. 6 '- -도 같은 쓰레기에서 변수 각각의 효과를 볼 수있다 동일한 모욕이 동일 동물의 그룹을 세 주어 경우에도'이 있다는 전문가들에 의해 인정 받고 있습니다. 따라서 변동성을 감소시키는 시도로, 그 운전자가 당일에 비해 두 개에 CLP을 수행하는 것이 합리적 보인다.

autophagy에의 분석은, 동적 셀룰러 공정은 복잡하다. 이 monogra에서 설명하는 프로토콜산도 autophagosome 형성의 생화학 적 또는 형태소 해석에 근거하여 생체 내에서 autophagy에 활성화를 추정하기위한 기초를 제공. 원칙적으로,이 장에서 제공된 프로토콜은 패혈증 CLP 모델 또는 대체 실시 생쥐 어떤 장기 조직에 autophagy에의 분석에 적용될 수있다. 간은 일반적으로 CLP의 주요 대상을 표현하기 위해 허용되는 동안,이 절차는 또한 폐 또는 추가 연구의 가치가 신장 조직에 부상을 입을 수 있습니다. 간세포의 autophagy에 대한 CLP의 효과는 상대적으로 잘 신장이나 폐에 autophagy에 미치는 영향에 비해 공부하고있다, 그리고 몇 가지 관련 증거가 최근에 (21, 22)를 발표하고있다.

그것은 증가 autophagosome 번호도 리소좀 함수 및 말기 가공의 막힘 통해 autophagy에 역기능을 반영로서 이들은, autophagy에의 정전기 대책 것을 주목해야한다. 이와 관련하여, 이러한 분석법은 생화학 보완되어야autophagic 기판 대금 (예 : 용의 iCal 분석   최근 설명과 생체 적응 as 플럭스) 11 분석한다. 최근 12, 13를 설명 이러한 분석은 조직의 핵심 autophagy에 단백질의 발현에 대한 표준 양식 면역 블롯 분석에 의해 보완 될 수있다. 따라서, 이러한 테스트의 조합을 다친 조직 16 autophagy에있는 상태의 정확한 추정을 획득하도록 구현되는 것이 좋다.

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Disclosures

저자는 선언 할 경쟁 금융의 이익이 없다

Acknowledgments

이 작품은 AMK 최에 NIH 부여 P01의 HL108801, R01 - HL60234, R01 - HL55330, R01-HL079904에 의해 지원되었다. S. Ryter는 난봉꾼 호흡기 연구소에서 급여 지원을 받았다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GFP-LC3 Transgenic Mice Riken (Japan) RBRC00806 GFP-LC3#53
Xylazine Henry-Schein 568-0606 Xylazine HCl Injection Vet
Ketamine Henry-Schein 995-2949 Ketaset Inj 100 mg/ml
EtOH Fisher A405-20 Histology Grade
EtOH Fisher A407-1 For Sterilizatiion
silk surgical sutures 6-0 Owens & Minor 2300-0078OG, 017624
buprenorphine-HCl Henry-Schein 614-5157 Buprenex Ampules
paraformaldehyde (37%) solution JT Baker S898-09
xylenes Fisher X3P-1GAL
anti-GFP monoclonal antibody Life Technologies G10362
Hoescht Sigma 944403
DAPI Invitrogen D1306
OCT VWR scientific 25608-930
Sudan Black Santa Cruz sc-203760
EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate Electron microscopy Sciences 15960
propylene oxide Sigma 240397
Agar 100 resin Agar scientific R1045
dodecenylsuccinic anhydride Sigma 46346
methylnadic anhydride Sigma 45359
N-benzyldimethylamine Sigma 185582

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References

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맹장 결찰 및 마우스에서 autophagy에 공부를 모델로 패혈증 관통 유도
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Siempos, I. I., Lam, H. C., Ding, Y., Choi, M. E., Choi, A. M. K., Ryter, S. W. Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice. J. Vis. Exp. (84), e51066, doi:10.3791/51066 (2014).More

Siempos, I. I., Lam, H. C., Ding, Y., Choi, M. E., Choi, A. M. K., Ryter, S. W. Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice. J. Vis. Exp. (84), e51066, doi:10.3791/51066 (2014).

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