Experimentell sepsis kan induceras i möss med användning av cecal ligation och punkteringsmetod (CLP). Nuvarande protokoll för att bedöma autophagy in vivo i samband med CLP-inducerad sepsis presenteras här: Ett protokoll för mätning av autophagy med användning av (GFP)-LC3 möss, och ett protokoll för att mäta autophagosome bildning genom elektronmikroskopi.
Experimentell sepsis kan induceras i möss med användning av cecal ligation och punkteringsmetod (CLP), som orsakar polymikrobiella sepsis. Här är ett protokoll som att framkalla sepsis av varierande svårighetsgrad hos möss med hjälp av kommandotolken tekniken. Autophagy är en grundläggande vävnadssvaret på stress och patogen invasion. Två strömprotokoll för att bedöma autophagy in vivo i samband med experimentell sepsis presenteras också här. (I) Transgena möss som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP)-LC3 fusionsprotein utsattes för CLP. Lokaliserad förstärkning av GFP-signal (puncta), som analyserades antingen genom immunohistokemiska eller konfokala analyser kan användas för att detektera ökad autophagosome bildning och sålunda ändras aktiveringen av autophagy reaktionsväg. (II) Förstärkt autophagic vakuolen (autophagosome) bildande per enhetsvävnadsområde (som en markör för autophagy stimulering) kan kvantifieras med hjälp av elektronmikroskopi. Studien av autophagic svar till sepsis är en kritisk komponent av att förstå de mekanismer genom vilka vävnader svarar på infektion. Forskningsresultat inom detta område kan i slutändan bidra till ökad förståelse för uppkomsten av blodförgiftning, vilket är ett stort problem inom intensivvård medicin.
Sepsis, en systemisk inflammatorisk reaktion på infektion, är en ledande dödsorsak i kritiskt sjuka patienter 1. Intraabdominella infektioner, ofta leder till polymikrobiella sepsis, står för 20% av sepsis, som har betydande dödlighet på upp till 60% 2. Sepsis-associerad dödlighet resulterar i första hand från multiorgandysfunktion med efterföljande organsvikt 3,4. Ytterligare utredning av patogena mekanismen av denna sjukdom krävs snarast för att främja utvecklingen av nya och mer effektiva behandlingar.
Den cecal ligation och punktering (CLP)-metoden är ett vanligt använt förfarande för modellering sepsis in vivo. Som blindtarmen är full av bakterier, dess punkterings leder polymikrobiella peritonit, translokation av bakterier i blodet (bakteriemi), septisk chock, flerorgandysfunktion och slutligen död 5. Det är allmänt accepterat att CLP avspeglar kliniskverkligheten mer exakt än tidigare tekniker, såsom injektion av endotoxin eller renade bakterier i gnagare, alltså CLP anses guldmyntfoten (om än inte utan begränsningar) 6 för experimentell induktion och därmed utredningen av patogenesen av sepsis. I denna monografi, beskriver vi protokoll som syftar till att bedöma om patogena mekanismer för sepsis inkluderar autophagy.
Autophagy, ett evolutionärt bevarat cellulär process, underlättar omsättningen av skadade proteiner och organeller såsom mitokondrier och spelar en viktig roll vid clearance av intracellulära patogener, inklusive bakterier 7,8. Under autophagy är cytosoliska proteiner eller organeller binds till dubbelmembranbundna vesiklar kallade autophagosomes, som sedan levereras till lysosomer för nedbrytning 9. Ett antal proteiner har identifierats som de däggdjurshomologer av autophagy relaterade gener (ATG),ursprungligen identifierats i jäst, som reglerar processen med autophagy. Omvandlingen av mikrotubuli-associerat protein-1 lätt kedja 3B (LC3B) (homolog av Atg8) från LC3B-I (fri form) att LC3B-II (fosfatidyletanolamin-konjugerad form) är ett stort steg i autophagosome formation 9. Autophagic dysfunktion är förknippad med åldrande och mänskliga sjukdomar, inklusive cancer och neurodegenerativa sjukdomar 10. Dessutom påverkar autophagy medfödd och adaptiv immunitet, såsom antigenpresentation, lymfocytutveckling och cytokinutsöndring av immunceller 8. Sålunda förefaller det rimligt att autophagy också kan spela en roll i det systemiska inflammatoriska svaret på infektion (dvs sepsis).
Hittills flera förfaranden har beskrivits för att utvärdera rollen av autophagy i vävnadsskada in vivo. Dessa inkluderar användning av grönt fluorescerande protein (GFP)-LC3 uttrycker möss och kvantifiering av autophagosomes i vävnad genom elektronmikroskopi (dessa två metoder beskrivs i denna monografi). Ytterligare metoder innefattar kvantifiering av autophagic proteinuttryck i vävnadshomogenat, och analysen av autophagic flussmedel (som beskrivits på annat ställe) 11-13. Målet med denna översyn är att ge nuvarande protokoll för bedömning autophagy in vivo i samband med experimentell sepsis.
Den stora fördelen med CLP är att det tillåter forskare att undersöka sepsis av olika svårighetsgrader (dvs. från låg-till mitten och hög kvalitet). Allvarlighetsgrad av inducerad sepsis påverkas av längden på blindtarmen ligeras (som den viktigaste faktorn), storleken på nålen som används för punktering och antalet hål utfört 15. Dessutom kan musen stam och kön påverka svårighetsgraden av sepsis, flera stammar är mer mottagliga än andra och män är generellt mer känsliga än …
The authors have nothing to disclose.
GFP-LC3 Transgenic Mice | Riken (Japan) | RBRC00806 | GFP-LC3#53 |
Xylazine | Henry-Schein | 568-0606 | Xylazine HCl Injection Vet |
Ketamine | Henry-Schein | 995-2949 | Ketaset Inj 100 mg/ml |
EtOH | Fisher | A405-20 | Histology Grade |
EtOH | Fisher | A407-1 | For Sterilizatiion |
silk surgical sutures 6-0 | Owens & Minor | 2300-0078OG, 017624 | |
buprenorphine-HCl | Henry-Schein | 614-5157 | Buprenex Ampules |
paraformaldehyde (37%) solution | JT Baker | S898-09 | |
xylenes | Fisher | X3P-1GAL | |
anti-GFP monoclonal antibody | Life Technologies | G10362 | |
Hoescht | Sigma | 944403 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
OCT | VWR scientific | 25608-930 | |
Sudan Black | Santa Cruz | sc-203760 | |
EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate | Electron microscopy Sciences | 15960 | |
propylene oxide | Sigma | 240397 | |
Agar 100 resin | Agar scientific | R1045 | |
dodecenylsuccinic anhydride | Sigma | 46346 | |
methylnadic anhydride | Sigma | 45359 | |
N-benzyldimethylamine | Sigma | 185582 |