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Neuroscience

अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन्स की आनुवंशिक हेरफेर Published: March 17, 2014 doi: 10.3791/51070
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Cellular and Molelcular Neurobiology, Max Planck Institute of Experimental Medicine, 2Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (CNMPB)

Summary

Neuronal morphogenesis और माइग्रेशन उचित मस्तिष्क विकास अंतर्निहित महत्वपूर्ण घटनाओं रहे हैं. यहाँ, हम आनुवंशिक रूप से संवर्धित अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन्स और आकृति विज्ञान और न्यूरॉन्स के प्रवासी विशेषताओं के मूल्यांकन के लिए विकासशील सेरिबैलम में हेरफेर करने की विधियों का वर्णन.

Abstract

Neuronal morphogenesis और माइग्रेशन सहित मस्तिष्क में विकासात्मक घटनाओं अत्यधिक इन विट्रो. प्रक्रियाओं करवाया और vivo में इन घटनाओं में शामिल रास्ते की पहचान करने के लिए एक में गहराई लक्षण वर्णन के लिए अनुमति विश्लेषण कर रहे हैं. विकासशील सेरिबैलम से निकाली गई है कि अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन्स (CGNs) रूपात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है कि एक आदर्श मॉडल प्रणाली रहे हैं. यहाँ, हम एक अनुवांशिक CGNs हेरफेर करने के लिए की विधि और कैसे व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की axono और dendritogenesis अध्ययन करने का वर्णन है. इस विधि के साथ शाही सेना हस्तक्षेप, overexpression या छोटे अणुओं के प्रभाव न्यूरॉन्स को नियंत्रित करने के लिए तुलना की जा सकती. इसके अलावा, कृंतक अनुमस्तिष्क प्रांतस्था ने अपने प्रमुख प्रसव के बाद विकास के कारण इन विवो प्रणाली में एक आसानी से सुलभ है. हम भी आनुवंशिक रूप से विकासशील cerebella हेरफेर और बाद अनुमस्तिष्क वर्णन करने के लिए एक में vivo electroporation तकनीक पेश neuronal आकारिकी एक आकलन करने के लिए विश्लेषण करती हैएन डी प्रवास.

Introduction

सेरिबैलम अक्षतंतु विकास और प्रवास के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट सिस्टम है. सेरिबैलम तंत्रिका विज्ञान 1 की सुबह से ही शरीर रचना का अध्ययन का विषय रहा है. आधुनिक माइक्रोस्कोपी और immunohistochemical तकनीक काफी विस्तार और सैंटियागो, रेमन, और Cajal 2-4 से प्रारंभिक खोजों परिष्कृत किया है. माउस आनुवंशिकी और आणविक पढ़ाई अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन्स (CGNs) 5-7 सहित न्यूरॉन्स के विभिन्न प्रकार के उचित तारों के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण घटनाओं की अधिक से अधिक समझने के लिए नेतृत्व किया है, जो अनुमस्तिष्क विकास के नियंत्रण में आवश्यक विकास और प्रतिलेखन कारक खुला.

सेरिबैलम विकासशील पश्चमस्तिष्क 8 rhombomere 1 के व्युत्पन्न है. 4 वें वेंट्रिकल की छत का हिस्सा है जो विषमकोण होंठ, में सबसे अनेक neuronal आबादी का गठन होगा जो अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन progenitors, को जन्म देता हैवयस्क सेरिबैलम 9. विजय - स्तम्भ प्रवास के बाद, वे अनुमस्तिष्क मूलरूप में बसा. इधर, छोटा दाना न्यूरॉन व्यापारियों के पिंजरे का बँटवारा कृन्तकों में postnatally जगह लेता है, जो बाहरी बारीक परत (EGL), के नाटकीय विस्तार की ओर जाता है. EGL से, न्यूरॉन्स Purkinje सेल परत अंततः आंतरिक बारीक परत (आईजीएल 2) में निवास को लेने के लिए अतीत, आणविक परत (माले) के माध्यम से आवक पलायन शुरू करते हैं. इस प्रवासी प्रक्रिया के दौरान, वे दो axons एमएल में देने के साथ एक द्विध्रुवी आकार हासिल. आगे प्रवास पर, सेल शरीर दूर axons से migrates और दो ​​प्रक्रियाओं एक बंटवारा, टी के आकार अक्षतंतु 10 के लिए फार्म का फ्यूज. बाद में, इन axons स्तबकमय और के रूप में समानांतर फाइबर में भेजा जाता है. आईजीएल में बसे, CGNs कोईदार फाइबर के साथ synapses स्थापित करने के लिए वृक्ष के समान पंजे जो फार्म डेन्ड्राइट, बढ़ता है. , विकासशील सेरिबैलम में मौलिक प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए एक इन विट्रो और इन विवो approac में संयुक्तज विश्वसनीय परिणाम और निष्कर्ष के लिए अनुमति देता है.

CGNs न केवल सेरिबैलम की बल्कि पूरे मस्तिष्क का सबसे अनेक न्यूरॉन्स होते हैं और उच्च शुद्धता 11-13 को संवर्धित किया जा सकता. संस्कृति में, यह अत्यधिक सजातीय neuronal आबादी तेजी से postmitotic हो जाता है और आसानी से पहचाना axons और dendrites के साथ एक ध्रुवीय आकारिकी प्राप्त. संवर्धित CGNs पूर्वज प्रसार, भेदभाव, axonal और dendrite विकास, neuronal प्रवास, apoptosis और electrophysiological गुण (14-19 और कई अन्य) सहित neuronal विकास के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए अत्यंत उपयोगी साबित किया है. आनुवंशिक हेरफेर का उपयोग सुसंस्कृत CGNs की बहुमुखी प्रतिभा का विस्तार किया और aforementioned घटनाओं में आगे यंत्रवत अंतर्दृष्टि के लिए अनुमति दी गई है. कम दक्षता कैल्शियम फॉस्फेट या ध्रुवता मार्कर या सॉफ्टवेयर का समर्थन विश्लेषण सुविधाओं के साथ immunocytochemistry द्वारा पीछा lipophilic तरीकों का उपयोग कर सभ्य न्यूरॉन्स के अभिकर्मकएक घने neuronal संस्कृति में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के जैसे आकृति विज्ञान का मूल्यांकन tates. इस दृष्टिकोण के साथ, अक्षतंतु या dendrite विकास में ब्याज की प्रोटीन की भूमिका 20-25,26-28 का अध्ययन किया जा सकता है. इस संस्कृति प्रणाली हालांकि प्रवास बहुत उच्च घनत्व संस्कृतियों में सीमित है के रूप में neuronal प्रवास का विश्लेषण करने के लिए कम उपयोगी है और cocultures की आवश्यकता होगी. अक्षतंतु और dendrite विकास की इन विट्रो विश्लेषण भी शाही सेना हस्तक्षेप (मैं) के संयोजन का उपयोग कर एक संकेतन मार्ग की परस्पर प्रोटीन की परीक्षा के लिए अनुमति देता है, अधिक अभिव्यक्ति या छोटे अणुओं.

अक्षतंतु और dendrite विकास विनियमन या neuronal प्रवास में ब्याज की प्रोटीन की प्रासंगिकता को स्थापित करने के लिए, vivo electroporation (Ive) तकनीक विकसित अनुमस्तिष्क प्रांतस्था में विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. कृन्तकों में अनुमस्तिष्क विकास पहले दो प्रसव के बाद सप्ताह में जिस तरह फैली हुई है कि इस तथ्य के कारण, सेरिबैलम एक accessib का प्रतिनिधित्व करता हैaxons और dendrites, neuronal प्रवास, synaptogenesis और apoptosis 20-24,29,30,26,27,31-34 के विकास की जांच करने के लिए आनुवंशिक जोड़तोड़ के लिए ले मस्तिष्क संरचना. इसके अलावा, इस मॉडल प्रणाली को भी इस तरह के अक्षतंतु pathfinding, तारों और साथ में ले ली न्यूरॉन्स और न्यूरॉन glia बातचीत की कनेक्टिविटी के रूप में बरकरार अनुमस्तिष्क प्रांतस्था की आवश्यकता है कि neuronal विकास के अन्य पहलुओं के लिए उपयोगी है, इस प्रोटोकॉल में इन विट्रो और इन विवो तकनीक से निपटने के लिए में प्रदान करता है neuronal morphogenesis और प्रवास के बारे में एक पूरक दृष्टिकोण.

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Protocol

CGNs या तो प्रसव के बाद दिन (पी) 5 माउस पिल्ले या P6 चूहे पिल्ले से तैयार किया जा सकता है. हम postmitotic CGNs 13 के लिए चयन करने के लिए एक mitotic अवरोध करनेवाला का उपयोग करता है जो बिलिमोरिया और उनके सहयोगियों द्वारा वर्णित एक प्रोटोकॉल, का पालन करें.

आचार बयान:
जीवित पशुओं को शामिल सभी प्रयोगों Lower Saxony, जर्मनी के "Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit" द्वारा अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल के अनुसार आयोजित किया गया है.

इन विट्रो परख में:

1. कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक विधि के लिए डीएनए प्लाज्मिड, मीडिया, और बफ़र की तैयारी

  1. बाँझ, endotoxin मुक्त पानी में प्लास्मिड डीएनए भंग; DMEM (उच्च ग्लूकोज), 2.5 एम 2 CaCl बनाने, 2x HBSS (4 जी NaCl, 0.1775 छ KCl, 0.095 ग्राम 2 4 HPO • 7 2 हे, 0.675 ग्राम ग्लूकोज ना भंग करना और 2.5 ग्राम 250 मिलीग्राम ultrapure पानी में HEPES और 7.05, 7.08, और 7.11) पीएच को समायोजित करें. नोट: तैयारी2x HBSS समाधान, पीएच plasmids के दिए संयोजन के अभिकर्मक दक्षता के बारे में सबसे अच्छा परिणाम देता है जो परीक्षण.

2. सभ्य न्यूरॉन्स के अभिकर्मक

चित्रा 1
चित्रा 1. इन विट्रो अक्षतंतु और dendrite विकास परख की फ्लोचार्ट. संवर्धित CGNs P6 चूहे पिल्ले से पृथक (कांच coverslips के साथ 24 अच्छी तरह से थाली), एक फ्लोरोसेंट अभिकर्मक मार्कर (जैसे GFP) युक्त डीएनए वेग के साथ DIV 0 या 1 में ट्रांसफ़ेक्ट हैं. निर्धारण और immunocytochemistry के बाद, न्यूरॉन्स एक अंधा ढंग से imaged हैं. छवियाँ ImageJ में आयात कर रहे हैं और प्रक्रियाओं को मापा जाता है. माप तो एक सांख्यिकीय प्रोग्राम का उपयोग कर कार्रवाई की जाती है.

  1. बीज CGNs (20 x 10 6 24 अच्छी तरह से थाली प्रति; बीएमई, 10% बछड़ा सीरम, 2 मिमी पेनिसिलीन एसtreptomycin-Glutamine (पीएसजी), 25 मिमी KCl) मीडिया के 500 μl के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली में नाइट्रिक एसिड धोया, polyornithine में लिपटे 12 मिमी कांच coverslips पर अच्छी तरह से प्रति.
  2. इन विट्रो में दिन पर (DIV) 0 (कम से कम 8 घंटे चढ़ाना के बाद) या div 1, विकास मीडिया को इकट्ठा करने और 37 डिग्री सेल्सियस पर रखना Prewarmed DMEM के 500 μl के साथ दो बार न्यूरॉन्स धोएं और DMEM के 500 μl जोड़ें.
  3. इनक्यूबेटर में जगह न्यूरॉन्स (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) 45 मिनट के लिए.
  4. मिश्रण से प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से 40 μl डीएनए वेग तैयार: डीएनए (2-2.5 ग्राम / खैर, कुल डीएनए के 10% ट्रांसफ़ेक्ट न्यूरॉन्स कल्पना करने के लिए एक अभिकर्मक मार्कर जैसे GFP होना चाहिए), पानी (अप करने के लिए 18 μl), 2 μl का जोड़ 2.5 एम 2 CaCl, अच्छा मिश्रण है और 2x HBSS के 20 μl जोड़ें.
    1. आरटी पर 5 मिनट के लिए डीएनए वेग सेते हैं.
  5. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए डीएनए वेग जोड़ें और इनक्यूबेटर में 18 मिनट के लिए न्यूरॉन्स सेते हैं.
  6. DMEM / डीएनए मिश्रण निकालें और prewarmed डीएम के 500 μl के साथ दो बार न्यूरॉन्स धोनेईएम.
  7. न्यूरॉन्स के लिए वापस कदम 2.2 से एकत्र मीडिया जोड़ें. न्यूरॉन्स 3 दिन से अधिक, कार्बन स्रोत की भरपाई करने के लिए DIV 3 में 25 मिमी ग्लूकोज के साथ पूरक मीडिया के लिए संस्कृति में हो जाएगा.
  8. 1-5 दिनों के बाद, GFP एंटीबॉडी immunocytochemistry के अधीन न्यूरॉन्स का उपयोग कर.
  9. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एक अंधा ढंग से हालत प्रति छवि कम से कम 30 व्यक्ति न्यूरॉन्स.

3. NeuronJ, एक एनआईएच ImageJ प्लगइन के साथ उपाय axons और dendrites

महत्वपूर्ण: माइक्रोन अनुपात बढ़ाई और छवि के संकल्प के आधार पर: छवियाँ उचित पिक्सेल का उपयोग करके correctluy पहुंचा रहे हैं सुनिश्चित करें.

  1. ImageJ के साथ 8 बिट करने के लिए छवियों कन्वर्ट: ओपन छवि, 'छवि' चुन -> 'प्रकार' -> '8 बिट '->' सेव 'छवि.
  2. NeuronJ प्लगइन चलाने के लिए और 8 बिट छवि खुला.
    स्क्रीनशॉट
  3. सीएल: अक्षतंतु ट्रैक करने के लिए 'जोड़ें ट्रेसिंग' विकल्प का उपयोग करेंअक्षतंतु की शुरुआत में एक बार बाईं माउस बटन ick और प्रक्रिया के साथ माउस ले जाएँ. अक्षतंतु की नोक पर डबल क्लिक करें पता लगाने axonal आकार से मेल खाता है.
    स्क्रीनशॉट
    नोट: सुझाव ट्रेस axonal आकार भिन्न हो,, अक्षतंतु की नोक पर फिर डबल क्लिक करें पता लगाने के लंगर के लिए axonal प्रक्रिया पर एक बार क्लिक करें.
  4. विकल्प और प्रेस 'भागो' 'माप अनुरेखण प्रदर्शन' चुनते हैं, 'उपाय ट्रेसिंग' पर क्लिक करें. एक्जॉन माप सब एक नई विंडो में प्रदर्शित कर रहे हैं. डेन्ड्राइट के लिए, 'प्रदर्शन समूह माप विकल्प' और प्रेस 'भागो' का चयन करें.
    स्क्रीनशॉट
    कुल डेन्ड्राइट माप सब एक नई विंडो में प्रदर्शित कर रहे हैं. किसी भी स्प्रेडशीट प्रोग्राम में खोला जा सकता है कि एक अलग फ़ाइल के रूप में उन्हें बचाने के लिए.
  5. वैकल्पिक रूप से मार्गदर्शन पता लगाने के लिए, फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करें: राइट वें पर क्लिक करेंई 'स्ट्रेट लाइन' विकल्प 'मुक्तहस्त लाइन' चुनते हैं,
    स्क्रीनशॉट
    दबाया बाईं माउस बटन रखने और मैन्युअल प्रक्रिया का पता लगा, 'प्रेस Ctrl + एम' को मापने के लिए.
  6. हालत प्रति औसत axonal / वृक्ष के समान लंबाई की गणना और उपयुक्त सांख्यिकीय परीक्षण का उपयोग करें.

    Vivo electroporation में:

1. उपकरण और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. आप 30 ग्राम सुई, स्पेसर (1-2 मिमी), सिरिंज, मृत मात्रा reducer (डीवीआर), electroporator, और tweezertrodes, हीटिंग पैड या अवरक्त गर्मी दीपक, gooseneck दीपक और isoflurane की जरूरत है.
  2. सुई में डीवीआर रखो, तो सिरिंज से सुई देते हैं, और अंत में (चित्रा 2) सुई पर स्पेसर डाल दिया.
    चित्रा 2
    आंकड़ा2. सुई. DVR की तैयारी एक 200 μl विंदुक टिप काटा और मृत मात्रा को कम करने के लिए सुई में रखा गया है. स्पेसर एक 200 μl लोड हो रहा है टिप से ली गई है और लगभग 2 मिमी सेरिबैलम में प्रवेश की गहराई को विनियमित करने के लिए सुई की समाप्ति पर रखा गया है. शासक इकाइयों: CM
  3. PBS/0.03% फास्ट ग्रीन में डीएनए भंग. नोट: एक अभिकर्मक मार्कर के रूप में, यह केवल न्यूरॉन्स कल्पना करने के लिए एक न्यूरॉन विशिष्ट प्रमोटर (जैसे Synapsin) के तहत है कि एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग करने के लिए लाभप्रद है. कुल प्लाज्मिड राशि का 25% अभिकर्मक मार्कर एन्कोडिंग प्लाज्मिड होना चाहिए.
  4. 70% इथेनॉल बनाने.
  5. बराबर अक्टूबर की मात्रा और पीबीएस में भंग 30% sucrose मिलाएं.
  6. डीएनए (PBS/0.03% फास्ट ग्रीन में प्लास्मिड डीएनए के 4 ग्राम / μl) के 4 μl के साथ सिरिंज भरें.

2. चूहे पिल्ले की IVE

IVE की फ्लोचार्ट: चित्रा 3 देखें


चित्रा 3. में vivo electroporation. पी 4 चूहे पिल्ले की फ्लोचार्ट सेरिबैलम में इंजेक्ट किया जाता है 5 विद्युत दालों के लिए जोखिम है, जिसके बाद isoflurane और एक फ्लोरोसेंट अभिकर्मक मार्कर (जैसे GFP) एन्कोडिंग प्लास्मिड डीएनए के साथ anaesthetized रहे हैं. पांच दिन बाद, अलग GFP पॉजिटिव cerebella sectioned और immunohistochemistry के अधीन हैं. छवियाँ एक confocal खुर्दबीन का उपयोग कर लिया और Imaris सॉफ्टवेयर का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं. डेटा एक सांख्यिकीय कार्यक्रम के साथ कार्रवाई कर रहे हैं.

  1. सूरजमुखी मनुष्य तनाव (Wistar या लांग इवांस) से पी 4 चूहे पिल्ले का प्रयोग करें.
  2. पिल्ला आगे बढ़ नहीं रह गया है जब तक 1-2 मिनट के लिए isoflurane (ऊतक में भिगो) के 200 μl के साथ छोटे से बॉक्स (जैसे P1000 विंदुक टिप बॉक्स) में isoflurane के साथ पिल्ले (एक के बाद एक) anesthetize. पिल्ले डब्ल्यू संपर्क में नहीं मिलता है कि ध्यान रखनाith isoflurane Iiquid. व्यक्ति पिल्ले संज्ञाहरण के लिए अलग प्रतिक्रिया के रूप में बारीकी से समय की निगरानी.
  3. 70% इथेनॉल के साथ वापस पिल्ला के सिर के जीवाणुरहित.
  4. अंगूठे और तर्जनी के बीच पिल्ला के सिर फिक्स और सूरजमुखी मनुष्य पिल्ला के सेरिबैलम लगाने के लिए gooseneck दीपक का उपयोग करें. अनुप्रस्थ साइनस तेजी से cortical गोलार्द्धों से मध्यमस्तिष्क (बेहतर और अवर colliculus) (चित्रा 3) सीमांकित करता है. सेरिबैलम मध्यमस्तिष्क के निकट स्थित है और एक गहरा शेड में दिखाई देता है. एक बिंदु के साथ सेरिबैलम इंगित करने के लिए एक स्थायी मार्कर का उपयोग करें. महत्वपूर्ण: स्थिर स्थिति में पिल्ला रखें! नोट: संज्ञाहरण इस प्रक्रिया के दौरान बंद पहनना चाहिए, पूर्व डीएनए इंजेक्शन के लिए isoflurane को पिल्ला बेनकाब.
  5. सुई (चित्रा 3) डालें और धीरे धीरे सेरिबैलम में डीएनए के 3 μl इंजेक्षन.
  6. डीएनए समाधान 30-60 सेकंड के लिए फैलाना करते हैं.
    1. ऋण ध्रुव सिर के पीछे (cerebella के साथ संपर्क में आता है कि इतनी tweezertrodes के बीच पिल्ला के सिर जगहआर क्षेत्र) और प्लस ध्रुव संपर्क सिर के विपरीत दिशा (चित्रा 3) कि.
    2. 5 विद्युत दालों के अधीन पिल्ला. अपने अस्तित्व (1 टेबल) से समझौता किए बिना अच्छा electroporation दक्षता सुनिश्चित करने के पिल्ले का वजन करने के लिए वोल्टेज समायोजित करें.
      वज़न वोल्टेज नाड़ी अंतराल
      8-9 ग्राम 160 वी 50 मिसे 950 मिसे
      9-10 जी 165 वी 50 मिसे 950 मिसे
      > 10 ग्राम 170 वी 50 मिसे 950 मिसे
      तालिका 1. पी 4 चूहे पिल्ले के electroporation.
    3. पिल्ले गर्म पैड पर या एक अवरक्त दीपक के नीचे की वसूली करते हैं. बांध पिल्ले लौटें. महत्वपूर्ण: ताप स्रोत किसी भी जलता थोपना नहीं है कि सुनिश्चित करें.
  7. सीओ कत्ल द्वारा 2 पीछा में उन्हें रखने के द्वारा 5 दिनों electroporation के बाद पिल्ले बलिदान.
    1. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग cerebella GFP पॉजिटिव लोगों के लिए cerebella और स्क्रीन अलग.
  8. फिर cerebella सिंक तक ट्यूब के नीचे करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30% sucrose में सेते हैं, 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए ​​हे / एन में cerebella को ठीक करें.
  9. OCT/30% sucrose में cerebella शामिल करें और एक cryostat का उपयोग 40 माइक्रोन राज्याभिषेक वर्गों में कटौती. नोट: एक अंधा ढंग से धारा प्रत्येक सेरिबैलम.
  10. विषय वर्गों GFP एंटीबॉडी का उपयोग कर immunohistochemistry के लिए. परमाणु डाई (DAPI या Hoechst 33258) के साथ counterstain और जानवर के अनुसार कम से कम 200 ट्रांसफ़ेक्ट न्यूरॉन्स का स्थानीयकरण निर्धारित करते हैं.
  11. एक में गहराई से विश्लेषण के लिए, एमएल और सफेद पदार्थ का सामना करना पड़ कम आईजीएल का सामना करना पड़ एक ऊपरी आईजीएल, जिसके परिणामस्वरूप हिस्सों में आईजीएल प्रतिभाग और प्रत्येक छमाही में रहने वाले GFP पॉजिटिव न्यूरॉन्स गिनती. नोट: एक अंधा तरीके में प्रत्येक अनुभाग के GFP पॉजिटिव न्यूरॉन्स गणना.

    3. है dendrite लंबाई मापने, एक confocal खुर्दबीन का उपयोग एक्स, वाई, जेड विमान में धारा प्राप्त चित्रों

    नोट: उदाहरण के लिए, 1 माइक्रोन की एक Z-stwp साथ एक 40 माइक्रोन खंड के लिए 40 छवियों का उपयोग करें.

    1. डेन्ड्राइट का एक 3 डी छवि उत्पन्न करने के लिए सॉफ्टवेयर, Imaris में खुले छवि श्रृंखला,.
    2. 3 डी में न्यूरॉन देखने के लिए 'पार' मोड पर क्लिक करें.
      स्क्रीनशॉट
    3. 'नई रेशा जोड़ें' चुनें और semiautomatic अनुरेखण शुरू करने के लिए 'स्वत: सृजन करें' पर क्लिक करें.
      स्क्रीनशॉट
      नोट: एक अंधा तरीके से एक 3 डी छवि विश्लेषण
    4. 'ड्रा' टैब और 'AutoPath' चुनें.
      स्क्रीनशॉट
    5. सी पर माउस कर्सर ले जाएँपक्ष शरीर और Shift + माउस सही सेल शरीर को चुनने के लिए क्लिक करें. नोट: सॉफ्टवेयर द्वारा Autocalculation कुछ मिनट की आवश्यकता हो सकती है.
      स्क्रीनशॉट
    6. Shift + माउस छोड़ दिया क्लिक करें का उपयोग रेशा (डेन्ड्राइट) करने के लिए पथ जोड़ें. नोट: पथ वास्तविक समय में देखे जा सकते हैं.
      स्क्रीनशॉट
    7. रेशा सांख्यिकी विंडो पर जाएं और 'विस्तृत', 'विशिष्ट मूल्यों' और कुल डेन्ड्राइट लंबाई की राशि के लिए 'रेशा डेन्ड्राइट लम्बाई (राशि)' पर क्लिक करें.
      स्क्रीनशॉट
    8. डेटा का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त सांख्यिकीय परीक्षण का प्रयोग करें.

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Representative Results

जैसा कि ऊपर वर्णित विभिन्न संवर्धन शर्तों के जवाब में CGNs की आकारिकी का विश्लेषण करने के लिए, हम DIV 0 पर न्यूरॉन्स ट्रांसफ़ेक्ट. अभिकर्मक के बाद, हम पूर्ण मध्यम (बीएमई, 10% बछड़ा सीरम, 2 मिमी पी एस जी, 25 मिमी KCl) और कम से कम मध्यम युक्त इंसुलिन में एक और सेट (बीएमई, 25 मिमी ग्लूकोज, 2 मिमी पी एस जी, 10 माइक्रोग्राम / में न्यूरॉन्स के एक सेट रखा मिलीलीटर इंसुलिन). हम DIV 1, 2 पर GFP एंटीबॉडी का उपयोग immunocytochemistry न्यूरॉन्स अधीन है, और 3, केवल सेट 2 के लिए सेट 1 और axons के लिए axons और dendrites मापने के द्वारा पीछा किया. वृद्धि कारक है और नकल neuronal गतिविधि, क्रमशः, axons और dendrites प्रदान जो सीरम और KCl, के कारण विकसित और (चित्रा -4 ए) बताए गए समय खिड़की पर तेजी से बढ़ी है. सेट 2 की axonal विकास मुख्य रूप से आंतरिक उत्तेजना का एक परिणाम था और इस प्रकार बहुत कम कर दिया. डेन्ड्राइट हालांकि dendrite विकास (चित्रा 4 बी) को प्रोत्साहित जो कमी सीरम और KCl, के कारण ठीक से विकसित करने में विफल रहा.


चित्रा 4. विश्लेषण अक्षतंतु और CGNs (ए, बी) DIV 0 पर एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग GFP के साथ ट्रांसफ़ेक्ट CGNs,, या तो पूर्ण मध्यम (ए) या ​​बीएमई में 1, 2, या 3 दिन के लिए इंसुलिन के साथ पूरक सुसंस्कृत थे में dendrite विकास की (बी). निर्धारण के बाद, न्यूरॉन्स GFP एंटीबॉडी का उपयोग immunocytochemistry के अधीन थे और अक्षतंतु और dendrite लंबाई मापा गया. 82 (ए) और 65 (बी) न्यूरॉन्स की कुल (+ SEM मतलब, *** 0.001 <पी, * <0.05 पी, एनोवा) मापा गया. सफेद तीर और पीले तीर axons और dendrites से संकेत मिलता है, क्रमशः. स्केल बार 100 मीटर के बराबर होती है. देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण.

चूहा cerebella की रूपात्मक विश्लेषण करने के लिए, हम 5 दिन बाद cerebella ऊपर और अलग रूप में वर्णित Ive को पी 4 पिल्ले अधीन. 40 माइक्रोन राज्याभिषेक cryosections की immunohistochemistry 86% GFP पॉजिटिव न्यूरॉन्स आईजीएल (चित्रा 5A) में EGL से उतरा कि पता चला. लोगों में, 50% EGL के ऊपरी भाग में मनाया गया और 36% आईजीएल के निचले हिस्से में दूर चले गए. हम भी डेन्ड्राइट तीन स्वतंत्र electroporated cerebella की वृद्धि की तुलना में और औसत लंबाई (चित्रा 5 ब) निर्धारित की.

चित्रा 5
चित्रा 5. के विवो electroporated cerebella में. Cerebella में neuronal प्रवास और dendrite लंबाई का विश्लेषणपी 4 चूहे पिल्ले pSyn-GFP प्लाज्मिड साथ electroporated और 5 दिन बाद अलग थे. 40 माइक्रोन राज्याभिषेक वर्गों GFP एंटीबॉडी का उपयोग कर immunohistochemistry के अधीन थे. सेरिबैलम में CGNs (ए) स्थानीयकरण मूल्यांकन किया गया था. (Kruskal वालिस, मान व्हिटनी सुधार, * पी ​​<0.05, *** पी <0.001) (बी) के कुल डेन्ड्राइट लंबाई Imaris सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मापा गया था (एनोवा, Bonferroni सुधार, एन एस = nonsignificant, + SEM मतलब है). तीर CGN सेल शरीर से संकेत मिलता है. तीर डेन्ड्राइट से संकेत मिलता है. स्केल बार 50 माइक्रोन के बराबर होती है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

फायदे और इन विट्रो और इन विवो तरीकों में वर्णित की सीमाएं:

माउस और चूहों से सुसंस्कृत CGNs समान रूप से अच्छी तरह से रूपात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं. एक चूहा सेरिबैलम के बड़े आकार के कारण, चूहे पिल्ले से CNGs की उपज माउस पिल्ले 3-4x की है कि अधिक है. एक तरफ CGNs से, cortical और hippocampal न्यूरॉन्स के रूप में अच्छी तरह से संस्कृति प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. कैल्शियम फॉस्फेट विधि व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की आकारिकी का विश्लेषण करने के लिए वांछित है जो एक कम (0.01-5%) अभिकर्मक दक्षता, में यह परिणाम है. वैकल्पिक lipophilic अभिकर्मक तरीकों के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया, लेकिन आगे लाभ बिना जरूरत से ज्यादा महंगे हैं हो सकता है. उच्च क्षमता यह बहुत मुश्किल व्यक्तिगत प्रक्रियाओं भेद करने के लिए कर देगा के रूप में इस तरह के CGNs के रूप में उच्च घनत्व संस्कृतियों का वायरल अभिकर्मक तरीकों से बचा जाना चाहिए. CGNs में, हम आम तौर पर इन विट्रो में अभिकर्मक दक्षता और दिनों की एक संबंध हैं. न्यूरॉन्स सुसंस्कृत किया गया है लंबे समय तक, कम प्रभावित वे अभिकर्मक तनाव प्रेरित द्वारा किया जाएगा. एक परिणाम के रूप में अभिकर्मक दक्षता ऊपर जाना होगा. इसके अलावा, अक्षतंतु विकास के आंतरिक तंत्र पर ध्यान केंद्रित करने और मीडिया में मौजूद सीरम से व्युत्पन्न वृद्धि कारकों के प्रभाव को बाहर करने, CGNs इंसुलिन, इंसुलिन की तरह विकास फैक्टर 1 के लिए एक सस्ते किराए के साथ पूरक अस्तित्व मीडिया में संवर्धित किया जा सकता है (आईजीएफ -1 ), जो neuronal अस्तित्व 35 को बढ़ावा देता है. इंसुलिन युक्त मीडिया को पूरी मीडिया से एक मीडिया परिवर्तन सीरम / KCl-वापसी प्रेरित apoptosis को रोकने के लिए DIV 0 पर या div 1 या तो होने चाहिए. dendrite विकास का विश्लेषण अक्षतंतु विकास परख के अनुरूप किया जा सकता है. यह वृक्ष के समान विकास को बढ़ावा देता है जो neuronal गतिविधि, अनुकरण करने के लिए KCl के साथ पूरक मीडिया में CGNs रखने के लिए महत्वपूर्ण है. Neuronal प्रवास के विश्लेषण में vivo electroporation तकनीक का उपयोग किया जाना चाहिए.

सभ्य न्यूरॉन्स के अभिकर्मक आम तौर पर आवश्यक होगाएक प्लाज्मिड एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे GFP) या बी galactosidase के लिए कोडिंग, और आरएनएआई या overexpression plasmids या तो हो सकता है जो अभिकर्मक मार्कर एन्कोडिंग एक प्लाज्मिड,: कम से कम दो plasmids के cotransfection. Plasmids के सफल Coexpression सुनिश्चित करने के लिए, अभिकर्मक मार्कर की सिफारिश की राशि डीएनए (24 अच्छी तरह से थाली के 2-2.5 ग्राम / अच्छी तरह से) की कुल राशि का 10% होना चाहिए. हम पहले की स्थापना की है कि डीएनए (एक साथ DsRed साथ GFP) के दो plasmids 22,24 coexpressing न्यूरॉन्स की 85% से अधिक में परिणाम के बराबर राशि के अभिकर्मक. Overexpression या छोटे अणुओं के लिए जोखिम neuronal सेल मृत्यु को उत्पन्न, पछाड़ना चाहिए, बीसीएल एक्स्ट्रा लार्ज एन्कोडिंग एक प्लाज्मिड आकारिकी 20 पर प्रभाव के बिना neuronal अस्तित्व को सुनिश्चित करने cotransfected किया जा सकता है. अप करने के लिए तीन या चार plasmids के Cotransfection एपिस्टासिस बाहर ले जाने के लिए उपयोगी है, जो भी unproblematic है एक रेखीय मार्ग या तालमेल दो प्रोटीनों के अक्षतंतु में या डेन्ड्राइट gro स्थापित करने का विश्लेषण करती हैwth. यहां, दो स्वतंत्र आरएनएआई या overexpression plasmids या दोनों के संयोजन एक अभिकर्मक मार्कर के साथ एक साथ cotransfected किया जा सकता है.

में vivo electroporation तकनीक अनुमस्तिष्क प्रांतस्था के विकास में neuronal प्रवास के विश्लेषण के लिए एक आदर्श तरीका है. यह काले रंग के साथ एक तनाव की तुलना में एक सूरजमुखी मनुष्य तनाव से पिल्ले का उपयोग करने के लिए लाभ का है. इसके अलावा, यह चूहे पिल्ले को अपने बड़े आकार के cerebella के कारण के साथ काम करना आसान है. हमारे हाथ में, लगभग सभी cerebella GFP पॉजिटिव लेकिन विभिन्न डिग्री के लिए कर रहे हैं. एक अच्छी तरह से electroporated सेरिबैलम सौ कई GFP पॉजिटिव न्यूरॉन्स, 100 से भी कम समय में एक गलत ट्रांसफ़ेक्ट सेरिबैलम है. थोड़ा अभ्यास के साथ, यह ट्रांसजेनिक चूहों अध्ययन के लिए आवश्यक हैं अगर चूहों का उपयोग करने के लिए भी संभव है. इस विधि ट्रांसजेनिक चूहों की पीढ़ी की तुलना में काफी तेज है और यह अलग अलग परिस्थितियों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है (हानि के समारोह, लाभ के समारोह और संरचना समारोह विश्लेषण). IVE आर नहीं करताequire Stereotaxis, एक gooseneck दीपक एक काफी पारदर्शी सूरजमुखी मनुष्य पिल्ला के सेरिबैलम का पता लगाने के लिए पर्याप्त है. यह भी पिल्ला प्रति प्रक्रिया समय और isoflurane suffices के साथ एक संक्षिप्त संज्ञाहरण छोटा होगा. हालांकि यह सही क्षेत्र को लक्षित करने के लिए और इस तरह की तकनीक में महारत हासिल करने के लिए थोड़ा अभ्यास की आवश्यकता होती है.

पछाड़ना या overexpression की वजह से विकास की समस्याओं सेरिबैलम के regionalized आनुवंशिक हेरफेर के कारण तुच्छ हैं. यह एक जंगली प्रकार के माहौल में एम्बेडेड आनुवंशिक रूप से संशोधित न्यूरॉन्स की एक मोज़ेक पैटर्न में electroporation के परिणाम के रूप में आंतरिक तंत्र के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. नकारात्मक पक्ष electroporated चूहों या चूहों के कारण ट्रांसफ़ेक्ट न्यूरॉन्स की कम राशि के लिए व्यवहार परीक्षण के अधीन नहीं किया जा सकता है. न्यूरॉन्स में plasmids के Coexpression सुनिश्चित करने के लिए, हम visualiza से बचने के लिए एक न्यूरॉन विशेष प्रमोटर के तहत एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग GFP (या किसी भी अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन) के साथ cotransfection की सिफारिशट्रांसफ़ेक्ट glial कोशिकाओं के tion. Axonal लंबाई की कमी का परिणाम है कि प्रभाव आसानी से पता लगाया और 24 मापा जा सकता है. इसके विपरीत, यह अपनी पूरी लंबाई का पता लगाया नहीं जा सकता है के रूप में axons पर उत्तेजक प्रभाव यों तो तकनीकी रूप से असंभव है. समानांतर फाइबर की Defasciculation हालांकि 20 measureable है. एक ही डेन्ड्राइट लंबाई और neuronal प्रवास 23,24,30 के आकलन के लिए सच है. आम तौर पर हम 5 दिनों electroporation के बाद हमारे विश्लेषण के लिए बाहर ले. यह जल्दी और बाद में विश्लेषण करने के लिए बिल्कुल संभव है. बाद में एक समय बिंदु CGNs और काई से भरा फाइबर के बीच synaptic कनेक्शन का प्रतिनिधित्व करते हैं जो वृक्ष के समान पंजे 29, के गठन की जांच की सिफारिश की है.

विश्लेषण को अंतिम रूप देने के लिए, यह उचित सांख्यिकीय परीक्षण चुनने के लिए महत्वपूर्ण है. इस के लिए, एक समूह के मूल्यों को एक सामान्य वितरण (जैसे axonal या डेन्ड्राइट लंबाई) का पालन करें, तो ध्यान में रखना है और यदि 2 या एम2 समूहों की तुलना अयस्क विश्लेषण में शामिल किए गए हैं. 2 समूहों के लिए, हम अधिक से अधिक 2 समूहों एनोवा के लिए, विद्यार्थी का परीक्षण का उपयोग करें. मानों एक गैर सामान्य वितरण (जैसे प्रवास दूरी), मान व्हिटनी यू परीक्षण और Kruskal वालिस परीक्षण का पालन करना चाहिए क्रमशः 2 या 2 समूहों की तुलना में अधिक है, के लिए इस्तेमाल किया जाना है.

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.

Acknowledgments

हम सांख्यिकीय विश्लेषण के साथ मदद के लिए, उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए सी. हैमर और एस Papiol एन Schwedhelm-Domeyer धन्यवाद. हमारा काम मैक्स प्लैंक सोसायटी, ड्यूश Forschungsgemeinschaft, नेनो पैमाने माइक्रोस्कोपी के लिए केंद्र, और मस्तिष्क के आण्विक फिजियोलॉजी (CNMPB), गौटिंगेन, जर्मनी और गौटिंगेन विश्वविद्यालय के GGNB जूनियर ग्रुप वजीफा द्वारा द्वारा वित्त पोषित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Gibco 11960-044
BME Gibco 41010-026
Insulin Sigma-Aldrich Si-1-4011
Poly-L-Ornithine Sigma-Aldrich P-2533
CaCl2 Appli-Chem A3652
Isoflurane Actavis Deutschland
Tissue-Tek OCT Sakura
ECM 830 and tweezertrodes Harvard Apparatus
Epifluorescence microscope and camera Nikon
SP2 confocal microscope Leica
ImageJ NIH
Imaris 7.4.2 Bitplane, Inc.
GraphPad Prism GraphPad Software, Inc.
MS Excel Microsoft
Loading tip 1-200 µl Costar 4853
Pipette tip 200 µl Sarstedt 70.760.502
Microlance 3 needle, 30 G BD 302200
50 µl gastight Syringe 1705 Hamilton
Glass coverslips  Thermo Scientific Menzel Glaeser CB00120RA1

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 85 axons डेन्ड्राइट neuronal प्रवास सेरिबैलम सभ्य न्यूरॉन्स अभिकर्मक,
अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन्स की आनुवंशिक हेरफेर<em&gt; इन विट्रो</em&gt; और<em&gt; में Vivo</em&gt; Neuronal आकृति विज्ञान और प्रवास का अध्ययन करने के लिए
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Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmüller, J. Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration. J. Vis. Exp. (85), e51070, doi:10.3791/51070 (2014).

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