Summary
Neuronal morfogenese og migration er afgørende begivenheder, der ligger til grund korrekt hjernens udvikling. Her beskriver vi fremgangsmåder til genetisk at manipulere dyrkede cerebellare granuleneuroner og udviklingen af cerebellum til vurdering af morfologi og vandrende karakteristika neuroner.
Abstract
Udviklingsmæssige begivenheder i hjernen, herunder neuronal morfogenese og migration er stærkt orkestreret processer. In vitro og in vivo analyser giver mulighed for en grundig karakterisering at identificere veje involveret i disse begivenheder. Cerebellare granuleneuroner (CGN), der er afledt fra det udviklende cerebellum er en ideel model, der giver mulighed for morfologiske analyser. Her beskriver vi en metode til, hvordan man genetisk manipulere CGN, og hvordan man studerer axono-og dendritogenesis af individuelle neuroner. Med denne metode virkningerne af RNA-interferens, overekspression eller små molekyler kan sammenlignes for at kontrollere neuroner. Desuden gnaver cerebellar cortex er en let tilgængelig in vivo system, på grund af dens fremherskende postnatal udvikling. Vi præsenterer også en in vivo elektroporation teknik til genetisk manipulere udvikle cerebella og beskrive efterfølgende cerebellar analyser at vurdere neuronal morfologi ennd migration.
Introduction
Lillehjernen er et fremragende system til at studere mekanismer axon vækst og migration. Lillehjernen har været genstand for anatomiske studier siden begyndelsen af neurovidenskab 1. Moderne mikroskopi og immunhistokemiske teknikker har væsentligt udvidet og forfinet de første opdagelser af Santiago, Ramon og Cajal 2-4. Mus genetik og molekylære undersøgelser afdækket væsentlige vækst-og transkriptionsfaktorer i kontrollen af cerebellar udvikling, som førte til større forståelse af afgørende begivenheder, der kræves for korrekt ledningsføring af forskellige typer af neuroner, herunder cerebellare granuleneuroner (CGN) 5-7.
Cerebellum er et derivat af rhombomere 1 i udviklingslandene baghjerne 8. Det rombiske læbe, som er en del af taget på den 4. ventrikel, giver anledning til cerebellare granula neuron progenitorceller, der skal udgøre den mest talrige neuronal population ivoksen lillehjernen 9.. Efter rostrale migration, de slår sig ned i det cerebellare anlage. Her mitose granule neuron forstadier fører til dramatisk udvidelse af det ydre granulære lag (EGL), som finder sted postnatalt hos gnavere. Fra EGL, neuroner begynde at migrere indad gennem den molekylære lag (ML), forbi Purkinje cellelag i sidste ende at tage ophold i det indre kornede lag (IGL 2). Under denne vandrende proces, de får en bipolar form med to axoner strækker sig ind i ML. Efter yderligere migration cellelegemet vandrer væk fra axoner og de to processer smelte til dannelse af en tvedelt, T-formet Axon 10. Efterfølgende disse axoner fasciculate og omtales som parallelle fibre. Efter at have afviklet i IGL, CGN vokser dendritter, som danner dendritiske kløer for at etablere synapser med Mossy fibre. For at undersøge de grundlæggende processer i udviklingen af cerebellum en kombineret in vitro og in vivo approach giver mulighed for pålidelige resultater og konklusioner.
CGN er ikke kun de mest talrige neuroner i lillehjernen, men af hele hjernen og kan dyrkes til høj renhed 11-13. I kultur, bliver dette meget homogen neuronal befolkning hurtigt postmitotiske og erhverver en polær morfologi med let identificerbare axoner og dendritter. Dyrkede CGN har vist sig at være særdeles nyttige til at studere forskellige aspekter af neuronal udvikling, herunder stamfader proliferation, differentiering aksonal og dendritceller udvikling, neuronal migration, apoptose og elektrofysiologiske egenskaber (14-19 og mange andre). Brugen af genetisk manipulation har udvidet den alsidighed af dyrkede CGN og mulighed for yderligere mekanistiske indblik i de angivne arrangementer. Transfektion af dyrkede neuroner ved hjælp af lav effektivitet calciumphosphat eller lipofile metoder efterfulgt af immuncytokemi med polaritet markører eller software-støttede analyse letteTates vurdering af f.eks morfologi af individuelle neuroner i en tæt neuronal kultur. Med denne fremgangsmåde kan den rolle af proteiner af interesse i Axon eller dendritceller vækst blive undersøgt 20-25,26-28. Denne kultur-system er dog mindre nyttigt at analysere neuronal migration som migration er meget begrænset i kulturer med høj densitet og ville kræve cokulturer. In vitro analyse af Axon og dendritceller vækst giver også mulighed for undersøgelse af indbyrdes forbundne proteiner af en signalvej bruger kombinationer af RNA-interferens (i), over-udtryk eller små molekyler.
At etablere relevansen af det interessante protein i Axon og dendritceller vækstregulering eller neuronal migration, in vivo elektroporation (IVE) teknik gør det muligt for analysen i udviklingslandene cerebellare cortex. På grund af det faktum, at cerebellare udvikling hos gnavere strækker ind i de to første postnatale uger lillehjernen repræsenterer en accessible hjernens struktur for genetiske manipulationer til at undersøge udviklingen af axoner og dendritter, neuronal migration synaptogenesis og apoptose 20-24,29,30,26,27,31-34. Desuden denne model system er også nyttigt for andre aspekter af neuronal udvikling, der kræver den intakte cerebellar cortex såsom Axon stifinding, ledningsføring og tilslutning af neuroner og neuron-glia interaktioner tilsammen denne protokol giver in vitro og in vivo teknikker til at tackle en komplementær tilgang til neuronal morfogenese og migration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
CGN kan fremstilles fra postnatal dag (P) 5 museungers eller P6 rotteunger. Vi følger en protokol, der er beskrevet af Bilimoria og kolleger, som bruger en mitotisk inhibitor til at vælge for postmitotiske CGN 13.
Etik erklæring:
Alle forsøg med levende dyr er blevet udført i overensstemmelse med dyret protokol godkendt af "Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit" Niedersachsen, Tyskland.
In vitro-assay:
1.. Fremstilling af DNA Plasmid Medier og buffere til calciumphosphat-transfektion Metode
- Plasmid-DNA opløses i steril, endotoksin-frit vand, DMEM (høj glucose), lave 2,5 M CaCl2, gøre 2x HBSS (opløse 4 g NaCl, 0,1775 g KCl, 0,095 g Na 2 HPO 4 • 7H 2 O 0,675 g glukose og 2,5 g HEPES i 250 ml ultrarent vand og justere pH til 7,05, 7,08 og 7,11). Bemærk: Ved udarbejdelsen2x HBSS opløsning test, pH giver de bedste resultater med hensyn til transfektionseffektivitet af en given kombination af plasmider.
2. Transfektion af dyrkede neuroner
Figur 1. Rutediagram af in vitro-Axon og dendritceller vækstassay. Cultured CGN (24-brønds plade med dækglas), isoleret fra P6 rotteunger, transficeres ved DIV 0 eller 1 med DNA præcipitatet indeholdende en fluorescerende transfektion markør (f.eks GFP). Efter fiksering og immuncytokemi, er neuroner filmede i en blindet måde. Billeder importeres i ImageJ og processer måles. Målinger behandles derefter ved hjælp af en statistisk program.
- Seed CGN (20 x 10 6 per 24-brønds plade, BME, 10% kalveserum, 2 mM penicillin-Streptomycin-glutamin (PSG), 25 mM KCI) på salpetersyre vasket, polyornithin-overtrukne 12 mm dækglas i en 24-brønds plade med 500 pi medier per brønd.
- På dag in vitro (DIV) 0 (mindst 8 timer efter plating) eller DIV 1, indsamle vækst medier og holde ved 37 ° C. Vask neuroner to gange med 500 pi forvarmet DMEM og tilsæt 500 ul DMEM.
- Place neuroner i inkubator (37 ° C, 5% CO2) i 45 min.
- Forbered 40 pi DNA bundfaldet til hver brønd ved at blande: DNA (2-2,5 ug / brønd, skal 10% af total DNA være en transfektion markør f.eks GFP at visualisere transficerede neuroner), vand (op til 18 ul), tilsættes 2 pi 2,5 M CaCl2, bland godt og tilsæt 20 ul 2x HBSS.
- Inkuber DNA bundfaldet i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Læg DNA bundfaldet til hver brønd og inkuberes neuroner i 18 minutter i inkubatoren.
- Fjern DMEM / DNA-blandingen og vask neuroner to gange med 500 pi forvarmet DMEM.
- Tilføj indsamlet medier fra trin 2.2 tilbage til neuroner. Hvis neuroner vil være i kultur i mere end 3 dage, supplere medier med 25 mM glucose på DIV 3 til at genopbygge kulstofkilde.
- Efter 1-5 dage, er omfattet neuroner til immuncytokemi ved anvendelse af GFP-antistoffer.
- Billedet mindst 30 individuelle neuroner pr betingelse i en blindet måde ved hjælp af et fluorescerende mikroskop.
3. Mål Axoner og dendritter med NeuronJ, en NIH ImageJ Plugin
Vigtigt: Sørg for, at billederne skaleres correctluy ved hjælp af passende pixel: mM forhold afhængig af forstørrelse og opløsning af billedet.
- Konvertere billeder til 8-bit med ImageJ: Åbn billede, skal du vælge 'Billede' -> 'Type' -> '8-bit '->' Gem 'image.
- Kør NeuronJ plugin og åbn 8-bit billede.
- Brug 'Tilføj tracings' muligheden for at spore Axon: click venstre museknap én gang i begyndelsen af Axon og flytte musen langs processen. Dobbeltklik på spidsen af Axon, hvis spor matcher axonal form.
Bemærk: Skal den foreslåede trace afvige fra axonal figuren, klik én gang på axonale proces at forankre spor, og derefter klikke dobbelt på spidsen af Axon. - Klik på »foranstaltning tracings ', vælg' Vis tracing målinger 'og tryk på' Kør '. Axon målinger er alt vises i et nyt vindue. For dendritter, vælg 'Vis gruppe målinger option' og tryk 'Kør'.
Samlet dendritceller målinger alle vises i et nyt vindue. Gem dem som en separat fil, der kan åbnes i enhver regnearksprogram. - Alternativt til manuel sporing bruge Fiji software: Højreklik på the 'Straight line' muligheden, vælg 'Freehand line «,
holde venstre museknap nede og manuelt spore processen skal du trykke 'Ctrl + M «at måle. - Beregn gennemsnit aksonal / dendritiske længde pr tilstand og bruge passende statistisk test.
In vivo elektroporation:
1.. Udstyr og Klargøring af reagenser
- Du har brug for 30 G kanyler, spacer (1-2 mm), sprøjte, døde volumen reducering (DVR), elektroporator og tweezertrodes, varmepude eller infrarød varmelampe, svanehalslampe og isofluran.
- Put DVR i nål, og derefter vedhæfte nålen til sprøjten, og endelig sætte spacer på nål (figur 2).
Figur2. Fremstilling af nålen. DVR afskæres en 200 pi pipettespids og anbragt i kanylen for at reducere døde volumen. Spacer stammer fra en 200 pi loading spids og er placeret på enden af nålen til at regulere indtrængningsdybden i lillehjernen til ca 2 mm. Linealenheder: cm - Opløs DNA i PBS/0.03% Fast Green. Bemærk: Som transfektion markering, er det fordelagtigt at anvende et fluorescerende protein, som er under en neuron-specifik promotor (f.eks synapsin) til kun at visualisere neuroner. 25% af det totale plasmid-beløb skal være plasmid, der koder transfektion markør.
- Gør 70% ethanol.
- Bland lige volumener af oktober, og 30% saccharose opløst i PBS.
- Fyld sprøjte med 4 pi af DNA (4 pg / pl af plasmid-DNA i PBS/0.03% Fast Green).
2. IVE af rotteunger
Flowchart IVE: se figur 3
Figur 3. Rutediagram in vivo elektroporation. P4 rotteunger bedøves med isofluran, og plasmid DNA kodende for et fluorescerende transfektion markør (f.eks GFP) injiceres i lillehjernen, efterfulgt af udsættelse for 5 elektriske impulser. Fem dage senere, er isoleret GFP-positive cerebella gennemskåret og underkastet immunhistokemi. Billeder er taget med et konfokalt mikroskop og analyseret under anvendelse af Imaris-software. Oplysninger behandles med en statistisk program.
- Brug P4 rotteunger fra albino stamme (Wistar eller Langt Evans).
- Bedøver unger (én efter den anden) med isofluran i lille kasse (f.eks P1000 pipette spids boks) med 200 pi isofluran (dyppet i væv) for 1-2 min, indtil hvalpen ikke længere bevæger sig. Pas på, at hvalpe ikke komme i kontakt wed Iiquid isofluran. Overvåg tid nøje som individuelle unger reagerer forskelligt på anæstesi.
- Sterilisere bagsiden af hvalp hoved med 70% ethanol.
- Fix leder af hvalp mellem tommel-og pegefinger og bruge svanehalslampe at lokalisere lillehjernen af albino hvalp. Den tværgående sinus skarpt afgrænser midthjernen (superior og inferior colliculus) fra kortikale halvkugle (Figur 3). Lillehjernen er placeret støder op til midthjernen og vises i en mørkere nuance. Brug en permanent markør til at angive cerebellum med en prik. Vigtigt: Hold hvalpen i fast position! Bemærk: Skal anæstesi slid off i løbet af denne procedure, udsætte hvalp frem for isofluran før indsprøjtning af DNA.
- Stik nålen (figur 3) og langsomt injiceres 3 pi DNA i cerebellum.
- Lad DNA-opløsningen diffundere i 30-60 sek.
- Placer leder af hvalp mellem tweezertrodes så minuspolen får kontakt med bagsiden af hovedet (cerebellar-regionen), og at plus pol kontakter den modsatte side af hovedet (figur 3).
- Emne hvalp til 5 elektriske impulser. Juster spænding til vægten af unger til at sikre en god elektroporation effektivitet uden at kompromittere deres overlevelse (Tabel 1).
Tabel 1. Elektroporation P4 rotteunger.Vægt Spænding Pulse Interval 8-9 g 160 V 50 msek 950 msek 9-10 g 165 V 50 msek 950 msek > 10 g 170 V 50 msek 950 msek - Lad unger komme på opvarmede pad eller under en infrarød lampe. Retur hvalpe til dæmningen. Vigtigt: Sørg for, at varmekilde ikke påføre nogen forbrændinger.
- Sacrifice hvalpe 5 dage efter elektroporation ved at placere dem i CO 2 efterfulgt af halshugning.
- Isolér cerebella og skærm for GFP-positive dem cerebella bruge et fluorescerende mikroskop.
- Lave cerebella i 4% PFA O / N ved 4 ° C, og derefter inkuberes i 30% sucrose ved 4 ° C indtil cerebella synke til bunden af røret.
- Indkapsle cerebella i OCT/30% sucrose og skæres 40 um koronale sektioner ved hjælp af en kryostat. Bemærk: Snit hver lillehjernen på en blindet måde.
- Om sektioner immunhistokemi under anvendelse af GFP-antistof. Kontrastfarve med nukleare farvestof (DAPI eller Hoechst 33258) og bestemme lokalisering af mindst 200 transficerede neuroner per dyr.
- For en dybdegående analyse, opdele IGL i to halvdele, hvilket resulterer i en øvre IGL ML og en lavere IGL står den hvide substans over for, og tælle GFP-positive neuroner, der er bosiddende i hver halvdel. Bemærk: Tæl GFP-positive neuroner i hver sektion i en blindet måde.
3. Måling Dendritceller Længde erhverve billeder af afsnit i x, y, z Plane Ved hjælp af en Konfokal mikroskop
Bemærk: for eksempel bruge 40 billeder til en 40 um sektion med en z-stwp på 1 mM.
- Åbent billedserier i softwaren, Imaris, for at generere en 3D-billede af dendritter.
- Klik på 'overgå' tilstand for at se neuron i 3D.
- Vælg 'Tilføj ny glødetråd' og klik på 'Skip automatisk oprettelse' for at starte halvautomatisk sporing.
Bemærk: Analysere hver 3D-billede i en blindet måde - Vælg fanen og 'AutoPath' Draw ".
- Flyt musemarkøren hen på cell krop og Shift + højre museknap for at markere cellen kroppen. Bemærk: Autocalculation af softwaren kan kræve et par minutter.
- Føj veje til glødetråden (dendritceller) ved hjælp af Shift + mus venstre klik. Bemærk: Kurver kan visualiseres i realtid.
- Gå til endeløse statistik vindue og klik på 'Detailed', 'Særlige værdier' og 'Filament dendritceller længde (sum) "for summen af den samlede dendritceller længde.
- Brug passende statistiske test til at analysere data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at analysere morfologi CGN som respons på forskellige dyrkningsbetingelser, transficerede vi neuroner på DIV 0 som beskrevet ovenfor. Efter transfektion vi placeret et sæt af neuroner i fuld medium (BME, 10% kalveserum, 2 mM PSG, 25 mM KCI) og et andet sæt i minimalt medium indeholdende insulin (BME, 25 mM glucose, 2 mM PSG, 10 ug / ml insulin). Vi udsatte neuroner til immuncytokemi ved anvendelse af GFP-antistof ved DIV 1, 2 og 3, efterfulgt af måling af axoner og dendritter til sæt 1 og axoner kun tempknæk2. På grund af serum og KCl, som giver vækstfaktorer og efterligne neuronal aktivitet henholdsvis axoner og dendritter udviklet og voksede hurtigt i løbet af den tid, vinduet angivet (figur 4A). Axonal vækst i sæt 2 var primært en følge af iboende stimulering og dermed meget reduceret. Dendritter dog undladt at udvikle sig ordentligt på grund af manglende serum og KCl, som stimulerer dendritceller vækst (figur 4B).
Fig. 4. Analyse af Axon og dendritceller vækst i CGN (A, B) CGN, transficeret med et plasmid, der koder for GFP DIV 0, blev dyrket i 1, 2 eller 3 dage i enten komplet medium (A) eller BME suppleret med insulin (B). Efter fiksering blev neuroner udsat for immuncytokemi ved anvendelse af GFP-antistof og Axon og dendritceller længder blev målt. I alt 82 (A) og 65 (B)-neuroner blev målt (ANOVA, * p <0,05, *** p <0,001, gennemsnit + SEM). Hvide pile og gule pilespidser angiver axoner og dendritter, hhv. Målestokken er lig med 100 mM. Klik her for at seen større version af dette tal.
For at udføre morfologisk analyse af rotte-cerebellum vi udsat P4 unger til at ive som beskrevet ovenfor og isoleret cerebella 5 dage senere. Immunhistokemi af 40 um koronale kryosektioner afslørede, at 86% GFP-positive neuroner nedstammer fra EGL i IGL (figur 5A). Blandt disse var 50% observeret i den øvre del af EGL og 36% migrerede længere ind i den nedre del af IGL. Vi bestemt også dendritceller vækst på tre uafhængige elektroporerede cerebella og sammenlignet den gennemsnitlige længder (figur 5B).
Figur 5.. Analyse af neuronal migration og dendritceller længde i in vivo elektroporerede cerebella. Cerebella afP4 rotteunger blev elektroporeret med PSYN-GFP plasmid og isoleres 5 dage senere. 40 um kronafsnit blev underkastet immunhistokemisk under anvendelse af GFP-antistof. (A) Lokalisering af CGN i cerebellum blev vurderet. (Kruskal Wallis, Mann Whitney korrektion, * p <0,05, *** p <0,001) (B) Samlet dendritceller længde blev målt ved hjælp af Imaris software (ANOVA, Bonferroni korrektion, ns = ikke er væsentlige, betyder + SEM). Pile angiver CGN celle organer. Pilespidser indikerer dendritter. Målestokken er lig med 50 mM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fordele og begrænsninger, der er beskrevet in vitro og in vivo-metoder:
Dyrkede CGN fra mus og rotter er lige velegnet til morfologiske analyser. På grund af den større størrelse af rottecerebellum udbyttet af CNGs fra rotteunger overstiger værdien af museunger 3-4x. Bortset fra CGN kan corticale og hippocampale neuroner anvendes som dyrkningssystem samt. Calciumphosphatmetoden resulterer i en lav (0,01-5%) transfektionseffektivitet, som ønskes at analysere morfologi af individuelle neuroner. Alternative lipofile transfektionsfremgangsmåder kan bruges som godt, men er alt for dyrt uden yderligere gevinst. Virale transfektionsfremgangsmåder af high-density kulturer som CGN bør undgås, da høje virkningsgrader vil gøre det meget vanskeligt at skelne de enkelte processer. I CGN, finder vi typisk en korrelation af transfektion effektivitet og dage in vitro. Jo længere neuroner er blevet dyrketDen mindre påvirket de vil være ved transfektion-induceret stress. Som en konsekvens transfektionseffektiviteten vil gå op. Også for at fokusere på iboende mekanismer axon vækst og udelukke indflydelse af vækstfaktorer, der stammer fra serum til stede i medierne, CGN kan dyrkes i overlevelse medium suppleret med insulin, en billig erstatning for insulin-lignende vækstfaktor 1 (IGF-1 ), som fremmer neuronal overlevelse 35. Et medie skifte fra fuld medier til insulin-holdige medier skal ske enten ved DIV 0 eller DIV 1 for at forhindre serum / KCl-tilbagetrækning-induceret apoptose. Analysen af dendritceller vækst kan udføres analogt med Axon vækstassay. Det er imidlertid vigtigt at holde CGN i medier suppleret med KCI at simulere neuronal aktivitet, som fremmer dendritisk udvikling. Analyse af neuronal migration bør udføres ved hjælp af in vivo elektroporation teknik.
Transfektion af dyrkede neuroner vil typisk indebærecotransfektion af mindst to plasmider: et plasmid, der koder for transfektion markering, som kan være et plasmid, der koder for et fluorescerende protein (f.eks GFP) eller b-galactosidase, og enten RNAi eller overekspression plasmider. For at sikre en vellykket coekspression af plasmider, bør den anbefalede mængde af transfektion markør være 10% af den samlede mængde DNA (2-2,5 ug / brønd af en 24-brønds plade). Vi har tidligere fastslået, at transfektion af lige store mængder af DNA (GFP sammen med DsRed) resulterer i mere end 85% af neuroner coekspression de to plasmider 22,24. Skulle knockdown overekspression eller udsættelse for små molekyler inducere nervecelledød kan et plasmid, der koder for Bcl-XL cotransficeres at sikre neuronal overlevelse uden virkninger på morfologi 20. Cotransfektion af op til tre eller fire plasmider er også uproblematisk, hvilket er nyttigt at foretage epistasis analyser at etablere en lineær sti eller synergi af to proteiner i Axon eller Dendrit groGJ. Her kan to uafhængige RNAi eller overekspression plasmider eller en kombination af begge co-transficeres sammen med en transfektion markør.
In vivo elektroporation teknik er en ideel metode til analyse af neuronal migration udvikle cerebellar cortex. Det er en fordel at anvende afkom fra en albino stamme sammenlignet med en stamme med mørk hud. Det er også nemmere at arbejde med rotteunger på grund af deres større størrelse cerebella. I vores hænder, næsten alle cerebella er GFP-positive, men i forskellige grader. Et godt elektroporerede lillehjernen har mange hundrede GFP-positive neuroner, et dårligt transficeret lillehjernen mindre end 100. Med lidt praksis er det også muligt at anvende mus, hvis der kræves transgene mus i undersøgelsen. Denne fremgangsmåde er betydeligt hurtigere end generering af transgene mus, og det giver mulighed for analysen af forskellige forhold (tab af funktion, få af funktion og struktur-funktions-analyser). IVE ikke require Stereotaxis, en svanehalslampe er tilstrækkeligt til at påvise lillehjernen af en temmelig gennemsigtigt albino hvalp. Dette vil også forkorte procedure tid pr hvalp og en kort anæstesi med isofluran tilstrækkelig. Det kræver dog lidt øvelse at målrette den korrekte region og dermed til at mestre teknikken.
Udviklingsmæssige problemer forårsaget af knockdown eller overekspression er ubetydelige på grund af den regionaliserede genmanipulation af lillehjernen. Dette giver mulighed for analyse af iboende mekanisme som elektroporation resulterer i et mosaikmønster af genetisk modificerede neuroner indlejret i en vildtype-miljø. Ulempen er, at de elektroporerede rotter eller mus, der ikke kan underkastes adfærdstest grund af den lave mængde af transficerede neuroner. For at sikre coexpression af plasmider i neuroner, anbefaler vi cotransfektion med et plasmid, der koder GFP (eller enhver anden fluorescerende protein) under en neuron-specifik promotor for at undgå visualizaning af transficerede gliaceller. Effekter, der resulterer i en reduktion af axonal længde kan let opdages og målte 24. I modsætning hertil er det teknisk umuligt at kvantificere stimulerende virkning på axoner som hele deres længde ikke kan spores. Defasciculation af parallelle fibre er dog målbare 20. Det samme gælder for vurderingen af dendritceller længde og neuronal migration 23,24,30. Vi typisk udfører vores analyser 5 dage efter elektroporering. Det er naturligvis muligt at udføre analyse før og senere. Der anbefales en senere tidspunkt at undersøge dannelsen af dendritiske kløer 29, som repræsenterer den synaptiske forbindelse mellem CGN og Mossy fibre.
At færdiggøre analyserne, er det vigtigt at vælge den passende statistisk test. For dette, skal man tage hensyn til, hvis værdierne for de grupper, følger en normal fordeling (f.eks axonale eller dendritter længder), og hvis 2 eller mmalm end 2 grupper er medtaget i analysen. For 2 grupper, bruger vi Students test, for mere end 2 grupper ANOVA. Hvis værdierne følger en ikke-normal fordeling (f.eks migration afstand), Mann Whitney U test og Kruskal Wallis test skal bruges til 2 eller mere end 2 grupper, hhv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker N. Schwedhelm-Domeyer for fremragende teknisk assistance C. Hammer og S. Papiol hjælp til statistiske analyser. Vores arbejde er finansieret af Max Planck Society, Deutsche Forschungsgemeinschaft, Center for Nanoscale mikroskopi, og Molekylær Fysiologi af Brain (CNMPB), Göttingen, Tyskland og af GGNB Junior Group stipendium på universitetet i Göttingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 11960-044 | |
| BME | Gibco | 41010-026 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | Si-1-4011 | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | P-2533 | |
| CaCl2 | Appli-Chem | A3652 | |
| Isoflurane | Actavis Deutschland | ||
| Tissue-Tek OCT | Sakura | ||
| ECM 830 and tweezertrodes | Harvard Apparatus | ||
| Epifluorescence microscope and camera | Nikon | ||
| SP2 confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Imaris 7.4.2 | Bitplane, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
| MS Excel | Microsoft | ||
| Loading tip 1-200 µl | Costar | 4853 | |
| Pipette tip 200 µl | Sarstedt | 70.760.502 | |
| Microlance 3 needle, 30 G | BD | 302200 | |
| 50 µl gastight Syringe 1705 | Hamilton | ||
| Glass coverslips | Thermo Scientific Menzel Glaeser | CB00120RA1 |
References
- Cajal, S. R. Histology of the nervous system of man and vertebrates. , Oxford University Press. (1995).
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. (1997).
- White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography. J. Vis. Exp. , (2012).
- Palay, S. L., Chan-Palay, V. Cerebellar cortex: cytology and organization. , Springer. (1974).
- Hatten, M. E., Alder, J., Zimmerman, K., Heintz, N. Genes involved in cerebellar cell specification and differentiation. Curr. Opin. Neurobiol. 7, 40-47 (1997).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu. Rev. Neurosci. 18, 385-408 (1995).
- Sillitoe, R. V., Joyner, A. L. Morphology molecular codes, and circuitry produce the three-dimensional complexity of the cerebellum. Ann. Rev. Dev. Biol. 23, 549-577 (2007).
- Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1. Neuron. 43, 345-357 (2004).
- Wingate, R. J. The rhombic lip and early cerebellar development. Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).
- Kawaji, K., Umeshima, H., Eiraku, M., Hirano, T., Kengaku, M. Dual phases of migration of cerebellar granule cells guided by axonal and dendritic leading processes. Mol. Cell Neurosci. 25, 228-240 (2004).
- Hatten, M. E., Gao, W. -Q., Morrison, M. E., Mason, C. A. Cellular and molecular neuroscience. , MIT Press. 419-41 Forthcoming.
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J. Vis. Exp. , (2009).
- Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Rivas, R. J., Hatten, M. E. Motility and cytoskeletal organization of migrating cerebellar granule neurons. J. Neurosci. 15, 981-989 (1995).
- Kuhar, S. G., et al. Changing patterns of gene expression define four stages of cerebellar granule neuron differentiation. Development. 117, 97-104 (1993).
- Baird, D. H., Hatten, M. E., Mason, C. A. Cerebellar target neurons provide a stop signal for afferent neurite extension in vitro. J. Neurosci. 12, 619-634 (1992).
- Segal, R. A., Pomeroy, S. L., Stiles, C. D. Axonal growth and fasciculation linked to differential expression of BDNF and NT3 receptors in developing cerebellar granule cells. J. Neurosci. 15, 4970-4981 (1995).
- Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).
- Smith, T. C., Wang, L. Y., Howe, J. R. Distinct kainate receptor phenotypes in immature and mature mouse cerebellar granule cells. Physiol. 517 (1), 51-58 (1999).
- Konishi, Y., Stegmuller, J., Matsuda, T., Bonni, S., Bonni, A. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain). Science. 303, 1026-1030 (2004).
- Stegmuller, J., Huynh, M. A., Yuan, Z., Konishi, Y., Bonni, A. TGFbeta-Smad2 signaling regulates the Cdh1-APC/SnoN pathway of axonal morphogenesis. J. Neurosci. 28, 1961-1969 (2008).
- Stegmuller, J., et al. Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN. Neuron. 50, 389-400 (2006).
- Kannan, M., Lee, S. J., Schwedhelm-Domeyer, N., Nakazawa, T., Stegmuller, J. p250GAP is a novel player in the Cdh1-APC/Smurf1 pathway of axon growth regulation. PLoS One. 7, (2012).
- Kannan, M., Lee, S. J., Schwedhelm-Domeyer, N., Stegmuller, J. The E3 ligase Cdh1-anaphase promoting complex operates upstream of the E3 ligase Smurf1 in the control of axon growth. Development. 139, 3600-3612 (2012).
- Gaudilliere, B., Konishi, Y., de la Iglesia, N., Yao, G., Bonni, A. A. CaMKII-NeuroD Signaling Pathway Specifies Dendritic Morphogenesis. Neuron. 41, 229-241 (2004).
- Yang, Y., et al. A Cdc20-APC ubiquitin signaling pathway regulates presynaptic differentiation. Science. 326, 575-578 (2009).
- Litterman, N., et al. An OBSL1-Cul7Fbxw8 ubiquitin ligase signaling mechanism regulates Golgi morphology and dendrite patterning. PLoS Biol. 9, (2011).
- Kim, A. H., et al. A centrosomal Cdc20-APC pathway controls dendrite morphogenesis in postmitotic neurons. Cell. 136, 322-336 (2009).
- Shalizi, A., et al. A calcium-regulated MEF2 sumoylation switch controls postsynaptic differentiation. Science. 311, 1012-1017 (2006).
- Vadhvani, M., Schwedhelm-Domeyer, N., Mukherjee, C., Stegmuller, J. The Centrosomal E3 Ubiquitin Ligase FBXO31-SCF Regulates Neuronal Morphogenesis and Migration. PLoS One. 8, (2013).
- Puram, S. V., et al. A CaMKIIbeta signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nat. Neurosci. , (2011).
- Jia, Y., Zhou, J., Tai, Y., Wang, Y. TRPC channels promote cerebellar granule neuron survival. Nat. Neurosci. 10, 559-567 (2007).
- Huynh, M. A., et al. An isoform-specific SnoN1-FOXO1 repressor complex controls neuronal morphogenesis and positioning in the mammalian brain. Neuron. 69, 930-944 (2011).
- de la Torre-Ubieta, L., Bonni, A. Transcriptional regulation of neuronal polarity and morphogenesis in the mammalian brain. Neuron. 72, 22-40 (2011).
- Calissano, P., et al. Recombinant human insulin-like growth factor I exerts a trophic action and confers glutamate sensitivity on glutamate-resistant cerebellar granule cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8752-8756 (1993).
