Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Genetic Manipulation av Cerebellar granulneuroner Published: March 17, 2014 doi: 10.3791/51070
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Cellular and Molelcular Neurobiology, Max Planck Institute of Experimental Medicine, 2Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (CNMPB)

Summary

Neuronal morfogenes och migration är viktiga händelser som ligger till grund för korrekt hjärnans utveckling. Här beskriver vi metoder för att genetiskt manipulera odlade cerebellära granulat nervceller och utvecklingslillhjärnan för bedömning av morfologi och flyttande egenskaper nervceller.

Abstract

Utvecklings händelser i hjärnan, inklusive neuronala morfogenes och migration är mycket iscensatt processer. In vitro och in vivo-analyser möjliggöra en fördjupad karaktärisering för att identifiera involverade i dessa händelser. Cerebellära granulneuroner (CGNs) som kommer från utvecklingslillhjärnan är ett perfekt modellsystem som gör det möjligt för morfologiska analyser. Här beskriver vi en metod för hur man genetiskt manipulera CGNs och hur man studerar axono-och dendritogenesis av enskilda neuroner. Med denna metod effekterna av RNA-interferens, överuttryck eller små molekyler kan jämföras för att styra neuroner. Dessutom är ett lättillgängligt in vivo-system på grund av sin dominerande utveckling efter födsel gnagare cerebellar cortex. Vi presenterar också en in vivo-elektroporering teknik för att genetiskt manipulera utveckla cerebella och beskriva efterföljande cerebellär analyser för att bedöma neuronal morfologi and migration.

Introduction

Lillhjärnan är ett utmärkt system för att studera mekanismerna för axon tillväxt och migration. Lillhjärnan har varit föremål för anatomiska studier sedan början av neuroscience 1. Modern mikroskopi och immunhistokemiska tekniker har kraftigt expanderat och förfinat de första upptäckterna av Santiago, Ramon, och Cajal 2-4. Mus genetik och molekylära studier avslöjade viktiga tillväxt-och transkriptionsfaktorer i kontrollen av cerebellar utveckling, vilket lett till ökad förståelse för viktiga händelser som krävs för korrekt inkoppling av olika typer av nervceller, inklusive cerebellära granulneuroner (CGNs) 5-7.

Lillhjärnan är ett derivat av rhombomere en av framkallnings bakhjäman 8. Den rombiska läpp, som är en del av taket på 4: e ventrikeln, ger upphov till cerebellär granulat neuron progenitorceller, som kommer att utgöra den mest talrika neuronala befolkningen ivuxen lillhjärnan 9. Efter rostral migration, de sätter sig i lillhjärnan anlage. Här mitos av granul neuron prekursorer leder till dramatisk expansion av den yttre granulära skiktet (EGL), som äger rum postnatalt hos gnagare. Från EGL, nervceller börjar migrera inåt genom den molekylära lagret (ML), förbi Purkinje cellager att slutligen bosätta sig på den inre granulära skiktet (IGL 2). Under denna vandrande process, de får en bipolär form med två axoner sträcker sig in i ML. Vid ytterligare migration, migrerar cellkroppen bort från axoner och de två processerna smälter bildar en gaffelformad, T-formad Axon 10. Därefter dessa axoner fasciculate och kallas parallella fibrer. Efter att ha bosatt sig i IGL, CGNs växa dendriter, som utgör dendritiska klor för att etablera synapser med mossiga fibrer. För att undersöka de grundläggande processerna i framkallnings cerebellum, en kombinerad in vitro och in vivo approach möjliggör tillförlitliga resultat och slutsatser.

CGNs är inte bara de många nervceller i lillhjärnan, men i hela hjärnan och kan odlas till hög renhet 11-13. I kultur, blir detta mycket homogen neuronala befolkningen snabbt postmitotisk och förvärvar en polär morfologi med lätt identifierbara axoner och dendriter. Odlade CGNs har visat sig vara mycket användbart för att studera olika aspekter av neuronal utveckling inklusive stamfader proliferation, differentiering, axonal och Dendrite utveckling, neuronal migration, apoptos och elektrofysiologiska egenskaper (14-19 och många andra). Användningen av genetisk manipulation har utökat mångsidighet odlade CGNs och tillåtet för ytterligare mekanistiska inblick i ovan nämnda händelser. Transfektion av odlade nervceller med hjälp av låg verkningsgrad kalciumfosfat eller lipofila metoder följt av immunocytokemi med polaritet markörer eller mjukvarustödd analys underlättalättar bedömningen av t.ex. morfologi av enskilda nervceller i en tät neuronal kultur. Med denna metod kan studeras rollen av proteiner av intresse för axon eller Dendrite tillväxt 20-25,26-28. Denna kultur-systemet är dock mindre lämpligt att analysera neuronal migration som migration är mycket begränsad i hög densitet kulturer och kräver samodlingar. Analysen av axon och dendrit tillväxt in vitro möjliggör också granskning av sammankopplade proteiner i en signalväg som använder kombinationer av RNA-interferens (i), överuttryck eller små molekyler.

För att fastställa relevansen av proteinet av intresse i axon och dendrit tillväxtreglering eller neuronal migration, in vivo elektroporering (IVE) teknik gör det möjligt för analysen i utvecklings cerebellar cortex. På grund av det faktum att cerebellar utveckling hos gnagare sträcker sig in i de två första postnatala veckorna representerar cerebellum en accessible hjärnans struktur för genetiska manipulationer för att undersöka utvecklingen av axoner och dendriter, neuronal migration, synaptogenesis och apoptos 20-24,29,30,26,27,31-34. Dessutom är detta modellsystem också användbart för andra aspekter av neuronal utveckling som kräver intakt cerebellar cortex t.ex. Axon pathfinding, ledningar och anslutningar av nervceller och neuron-Glia interaktioner Sammantaget ger detta protokoll in vitro och in vivo-tekniker för att ta itu med en kompletterande strategi avseende neuronala morfogenes och migration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

CGNs kan framställas antingen från postnatal dag (P) 5 mus valpar eller P6 råttungar. Vi följer ett protokoll, som beskrivs av Bilimoria och kollegor, som använder en mitosinhibitor att välja för postmitotiska CGNs 13.

Etik uttalande:
Alla försök med levande djur har utförts i enlighet med djur protokollet godkänts av "Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit" i Niedersachsen, Tyskland.

In vitro-analys:

1. Preparation av DNA plasmid, Media och buffertar för kalciumfosfattransfektion Metod

  1. Lös plasmid-DNA i sterilt, endotoxin-fritt vatten, DMEM (hög glukos), gör 2,5 M CaCl2, gör 2x HBSS (lös upp 4 g NaCl, 0,1775 g KCl, 0,095 g Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, 0,675 g glukos och 2,5 g HEPES i 250 ml ultrarent vatten och justera pH-värdet till 7,05, 7,08 och 7,11). OBS: När man förbereder2x HBSS lösningen, test som pH ger bäst resultat när det gäller transfektion effektivitet given kombination av plasmider.

2. Transfektion av odlade neuroner

Figur 1
Figur 1. Flödesschema av in vitro-axon och dendrittillväxt assay. Odlade CGNs (24-brunnar med täckglas av glas), isolerad från P6 råttungar, transfekteras vid DIV 0 eller 1 med DNA-fällningen innehållande en fluorescerande transfektion markör (t.ex. GFP). Efter fixering och immuncytokemi, är nervceller avbildas på en blindad sätt. Bilderna importeras till ImageJ och processer mäts. Mätningar bearbetas sedan med hjälp av ett statistikprogram.

  1. Seed CGNs (20 x 10 6 per 24-brunnars platta, BME, 10% kalvserum, 2 mM penicillin-Streptomycin-glutamin (PSG), 25 mM KCl) med salpetersyra tvättad, polyornitin belagda 12 mm glastäckglas i en 24-brunnsplatta med 500 | il medium per brunn.
  2. På dag in vitro (DIV) 0 (minst 8 timmar efter plätering) eller DIV 1, samla tillväxtmedier och förvara vid 37 ° C. Tvätta nervceller två gånger med 500 l av förvärmd DMEM och tillsätt 500 l av DMEM.
  3. Placera nervceller i inkubator (37 ° C, 5% CO 2) i 45 min.
  4. Förbered 40 l DNA-fällning för varje brunn genom att blanda: DNA (2-2,5 ng / brunn, bör 10% av den totala DNA vara en transfektion markör t.ex. GFP att visualisera transfekterade nervceller), vatten (upp till 18 l), tillsätt 2 l av 2,5 M CaCl2, blanda väl och tillsätt 20 ìl av 2x HBSS.
    1. Inkubera DNA fällning i 5 min vid RT.
  5. Lägg DNA fällning till varje brunn och inkubera nervceller under 18 min i inkubatorn.
  6. Ta bort DMEM / DNA-mix och tvätta nervceller två gånger med 500 l av förvärmd DMEM.
  7. Lägg insamlat material från steg 2.2 till nervceller. Om neuroner kommer att vara i kultur under mer än tre dagar, komplettera medium med 25 mM glukos vid DIV 3 för att fylla på kolkälla.
  8. Efter 1-5 dagar, ämnes nervceller till immuncytokemi använda GFP antikroppar.
  9. Bild minst 30 enskilda nervceller per tillstånd i en blindad sätt med hjälp av en fluorescerande mikroskop.

3. Mät axoner och dendriter med NeuronJ, en NIH ImageJ Plugin

Viktigt: Se till att bilder skalas correctluy med hjälp av lämpliga bildpunkt: um förhållande beroende på förstoring och upplösning av bilden.

  1. Konvertera bilder till 8-bit med ImageJ: Öppna bild, välj "Bild" -> "Typ" -> '8-bit "->" Spara "image.
  2. Kör NeuronJ plugin och öppna 8-bitars bild.
    skärmdump
  3. Använd alternativet "Lägg kurvor" för att spåra axonet: click den vänstra musknappen en gång i början av axonen och flytta musen längs processen. Dubbelklicka på toppen av axon om spår matchar axonal form.
    skärmdump
    Notera: Om den föreslagna spår skilja sig från axonal form, klicka en gång på axonal process att förankra spår, dubbelklicka sedan på toppen av axon.
  4. Klicka på "Mät tracings", välj "Display mätningar spåra" och tryck på "Kör". Axon mätningar visas alla i ett nytt fönster. För dendriter, välj alternativet mätningar Display grupp "och tryck på" Kör ".
    skärmdump
    Totalt Dendrite mätningar visas alla i ett nytt fönster. Spara dem som en separat fil som kan öppnas i ett kalkylprogram.
  5. Alternativt för manuell spårning, använd Fiji program: Högerklicka på the "Rak linje" alternativet, välj "Freehand line",
    skärmdump
    håll vänster musknapp nedtryckt och spåra processen manuellt, tryck 'Ctrl + M för att mäta.
  6. Beräkna genomsnittlig axonal / dendritiska längd per tillstånd och använda lämplig statistisk metod.

    In vivo elektroporering:

1. Utrustning och beredning av reagenser

  1. Du behöver 30 G nålar, distans (1-2 mm), spruta, död volym Reducer (DVR), elektroporator och tweezertrodes, värmedyna eller infraröd värmelampa, svanhalslampa och isofluran.
  2. Sätt DVR in nålen, fäst sedan nålen till sprutan, och äntligen få distans på nålen (Figur 2).
    Figur 2
    Figur2. Framställning av nålen. DVR är avskuren en 200 mikroliter pipettspets och placerades in i nålen för att minska dödvolymen. Spacer är härledd från en 200 | il laddningsspetsen och är placerad på änden av nålen för att reglera inträngningsdjupet i cerebellum till cirka 2 mm. Linjal heter: cm
  3. Lös upp DNA i PBS/0.03% Fast Green. Anmärkning: Som en transfektion markör, är det fördelaktigt att använda ett fluorescerande protein som är under en neuron-specifik promotor (t.ex. Synapsin) till endast visualisera nervceller. 25% av det totala plasmid-mängd skall vara den plasmid som kodar för transfektion markör.
  4. Gör 70% etanol.
  5. Blanda lika stora volymer av oktober och 30% sackaros löst i PBS.
  6. Fyll sprutan med 4 l av DNA (4 mikrogram / l av plasmid-DNA i PBS/0.03% Fast Green).

2. IVE av råttfoster

Flödesschema över IVE: se figur 3


Figur 3. Flödesschema av in vivo-elektroporering. P4 råttungar är bedövades med isofluran och plasmid-DNA som kodar för en fluorescerande transfektion markör (t.ex. GFP) injiceras i lillhjärnan, följt av exponering för 5 elektriska pulser. Fem dagar senare, är isolerade GFP-positiva cerebella sektioneras och utsätts för immunohistokemi. Bilder har tagits med en konfokalmikroskop och analyseras med hjälp Imaris programvara. Uppgifter behandlas med ett statistikprogram.

  1. Använd P4 råttungar från albino stam (Wistar eller Long Evans).
  2. Söva valpar (en efter en) med isofluran i liten låda (t.ex. P1000 pipettspetsen låda) med 200 pl av isofluran (indränkt i vävnad) för 1-2 min tills valpen är inte längre rör sig. Se till att valparna inte komma i kontakt with Iiquid isofluran. Övervaka tid nära som enskilda valpar reagerar olika på anestesi.
  3. Sterilisera baksida pup huvud med 70% etanol.
  4. Fix chef för valp mellan tummen och pekfingret och använder svanhalslampa för att lokalisera lillhjärnan av albino valp. Den tvärgående sinus avgränsas skarpt mitthjärnan (överlägsna och underlägsna colliculi) från de kortikala hemisfärerna (Figur 3). Lillhjärnan är belägen i anslutning till mitthjärnan och visas i en mörkare nyans. Använd en permanent markör för att indikera lillhjärnan med en prick. Viktigt: Håll valpen i fast läge! OBS: Bör anestesi avta under denna procedur, utsätta valpen för isofluran före injektion av DNA.
  5. För in nålen (Figur 3) och injicera långsamt 3 l av DNA i lillhjärnan.
  6. Låt DNA-lösningen diffusa för 30-60 sek.
    1. Placera chef för valp mellan tweezertrodes så att minuspolen får kontakt med bakhuvudet (cerebellaR-regionen), och att den positiva pol i kontakt med den motsatta sidan av huvudet (Figur 3).
    2. Ämne valp till 5 elektriska pulser. Justera spänningen på vikten av valpar för att säkerställa god elektroporation effektivitet utan att äventyra deras överlevnad (Tabell 1).
      Vikt Spänning Puls Intervall
      8-9 g 160 V 50 msec 950 msek
      9-10 g 165 V 50 msec 950 msek
      > 10 g 170 V 50 msec 950 msek
      Tabell 1. Elektroporation av P4 råttungar.
    3. Låt valpar åter på uppvärmd dyna eller under en infraröd lampa. Återgå valpar till Dam. Viktigt: Se till att värmekällan inte orsaka brännskador.
  7. Offra valpar 5 dagar efter elektroporation genom att placera dem i CO2 följt av halshuggning.
    1. Isolera cerebella och skärm för GFP-positiva och kära cerebella använder ett fluorescerande mikroskop.
  8. Fix cerebella i 4% PFA O / N vid 4 ° C, sedan inkubera i 30% sackaros vid 4 ° C tills cerebella diskho till botten av röret.
  9. Bädda cerebella i OCT/30% sackaros och skär 40 um koronala sektioner med hjälp av en kryostat. Anm: Avsnitt varje lillhjärnan i en blindad sätt.
  10. Ämnes sektioner för att immunohistokemi med hjälp av GFP antikropp. Motfärga med nukleär färgämne (DAPI eller Hoechst 33258) och bestämma lokalisering av minst 200 transfekterade nervceller per djur.
  11. För en fördjupad analys, dela upp IGL i halvor, vilket resulterar i en övre IGL mot ML och en lägre IGL inför den vita substansen och räkna GFP-positiva neuroner som bor i varje halva. OBS: Räkna GFP-positiva neuroner i varje avsnitt i en blindad sätt.

    3. Mätning Dendrite längd, Förvärva Bilder sektionens i x, y, z Plane med en konfokalmikroskop

    Anmärkning: till exempel använder 40 bilder på en 40 ìm avsnitt med en z-stwp av 1 mikrometer.

    1. Öppna bildserier i programvaran, Imaris, för att generera en 3D-bild av dendriter.
    2. Klicka på "Surpass"-läge för att visa neuron i 3D.
      skärmdump
    3. Välj "Lägg till ny glödtråd" och klicka på "Hoppa automatiska skapandet" för att starta halvautomatisk spårning.
      skärmdump
      OBS: Analysera varje 3D-bild på en blindad sätt
    4. Välj "Draw"-fliken och "AutoPath".
      skärmdump
    5. Flytta muspekaren på cell kropp och Skift + högerklick för att markera cellkroppen. OBS: Autocalculation av programvara kan kräva några minuter.
      skärmdump
    6. Lägg vägar till glödtråden (dendrit) med hjälp av Skift + musen vänster klick. Anm: Banor kan visualiseras i realtid.
      skärmdump
    7. Gå till glödstatistik fönster och klicka på "Detaljerad", "särskilda värden" och "Tråd Dendrite längd (summan) för summan av total Dendrite längd.
      skärmdump
    8. Använd lämpliga statistiska test för att analysera data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att analysera morfologin hos CGNs som svar på olika odlingsbetingelser, transfekterade vi nervceller på DIV 0 såsom beskrivits ovan. Efter transfektion placerades vi en uppsättning av neuroner in i fullt medium (BME, 10% kalvserum, 2 mM PSG, 25 mM KCl) och en annan uppsättning i minimalt medium innehållande insulin (BME, 25 mM glukos, 2 mM PSG, 10 | ig / ml insulin). Vi utsätts nervceller för immuncytokemi hjälp av GFP antikropp på DIV 1, 2, och 3, följt av mätning av axoner och dendriter för set 1 och axoner endast för set 2. På grund av serum och KCl, som ger tillväxtfaktorer och härma nervaktivitet, respektive, axoner och dendriter utvecklades och växte snabbt under tidsfönstret anges (Figur 4A). Axonal tillväxt set 2 var främst en följd av inre stimulans och därmed mycket reducerad. Dendriter misslyckades dock att utvecklas på rätt sätt på grund av bristen serum och KCl, som stimulerar dendrit tillväxt (Figur 4B).


Figur 4. Analys av axon och dendrit tillväxt CGNs (A, B) CGNs, transfekteras med en plasmid som kodar för GFP vid DIV 0, odlades under en, två eller tre dagar i antingen full mediet (A) eller BME kompletterat med insulin (B). Efter fixering, var nervceller utsätts för immuncytokemi med hjälp av GFP antikropp och axon och dendrit längder mättes. En summa av 82 (A) och 65 (B) neuroner mättes (ANOVA, * p <0,05, *** p <0,001, medelvärde ± SEM). Vita pilar och gula pilspetsar indikerar axoner och dendriter, respektive. Skala bar är lika med 100 nm. klicka gärna här för att seen större version av denna figur.

För att utföra morfologisk analys av rått cerebella, vi utsattes P4 foster för IVE såsom beskrivits ovan och isolerade cerebella 5 dagar senare. Immunohistokemi av 40 um koronalt kryosnitt visade att 86% GFP-positiva neuroner härstammade från EGL till IGL (Figur 5A). Bland dessa hade 50% observerades i den övre delen av EGL och 36% migrerade längre in i den undre delen av IGL. Vi bestämde också dendrit tillväxt på tre oberoende elektro cerebella och jämförde genomsnittliga längder (Figur 5B).

Figur 5
Figur 5. Analys av neuronala migration och Dendrite längd i in vivo elektro cerebella. Cerebella avP4 råttungar var elektro med pSyn-GFP plasmid och isoleras 5 dagar senare. 40 um koronala sektioner utsattes för immunhistokemi med hjälp av GFP antikropp. (A) Lokalisering av CGNs i cerebellum bedömdes. (Kruskal Wallis, Mann Whitney-korrigering, * p <0,05, *** p <0,001) (B) Totalt dendrit längd mättes med användning Imaris programvara (ANOVA, Bonferroni korrektion, ns = icke signifikant, medelvärde ± SEM). Pilar indikerar CGN cell organ. Pilar indikerar dendriter. Skala bar är lika med 50 pm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fördelar och begränsningar för den beskrivna in vitro-och in vivo-metoder:

Odlade CGNs från mus och råtta är lika väl lämpade för morfologiska analyser. På grund av den större storleken på en råttcerebellum var utbytet av CNGs från råttungar överstiger vikten av musungar 3-4x. Bortsett från CGNs kan kortikala och hippocampus nervceller användas som odlingssystemet också. Den kalciumfosfatmetoden resulterar i en låg (0,01-5%) transfektionseffektivitet, vilket är önskvärt att analysera morfologin hos individuella neuroner. Alternativa lipofila transfektion metoder kan också användas, men är alltför dyrt utan ytterligare förstärkning. Viral transfektion metoder för hög densitet kulturer såsom CGNs bör undvikas så hög effektivitet kommer att göra det mycket svårt att urskilja enskilda processer. I CGNs, finner vi oftast en korrelation av transfektion effektivitet och dagar in vitro. Ju längre de nervceller har odlats, Den mindre påverkade de kommer att vara med transfektion-inducerad stress. Som en konsekvens transfektionseffektiviteten kommer att gå upp. Dessutom, för att fokusera på inneboende mekanismer för axon tillväxt och omfattar påverkan av tillväxtfaktorer som härrör från serum närvarande i media, CGNs kan odlas i överlevnadsmedia kompletterat med insulin, ett billigt surrogat för insulinliknande tillväxtfaktor 1 (IGF-1 ), som främjar neuronal överlevnad 35. En media förändring från hela media till insulin-innehållande media måste ske antingen vid DIV 0 eller DIV 1 för att förhindra serum / KCl-tillbakadragande-inducerad apoptos. Analysen av dendrittillväxt kan utföras analogt med axontillväxt assay. Det är dock viktigt att hålla CGNs i media kompletterat med KCl att simulera nervaktivitet, vilket främjar dendritiska utveckling. Analys av neuronal migrering bör utföras med hjälp av in vivo-elektroporering teknik.

Den transfektion av odlade neuroner kommer typiskt att medförasamtransfektion av åtminstone två plasmider: en plasmid som kodar för transfektion markör, som kan vara en plasmid, som kodar för ett fluorescerande protein (t.ex. GFP) eller b-galaktosidas, och antingen RNAi eller överexpression plasmider. För att säkerställa en lyckad samuttryck av plasmider, bör den rekommenderade mängden av transfektion markör vara 10% av den totala mängden av DNA (2-2,5 | ig / brunn av en 24-brunnars platta). Vi har tidigare konstaterat att transfektion av lika stora mängder av DNA (GFP tillsammans med DsRed) resulterar i mer än 85% av nervceller samuttrycker de två plasmider 22,24. Bör knockdown, överuttryck eller exponering för små molekyler inducerar nervcellsdöd, kan en plasmid som kodar för Bcl-XL samtransfekteras att säkerställa neuronal överlevnad utan effekter på morfologi 20. Samtransfektion på upp till tre eller fyra plasmider är också oproblematisk, vilket är användbart för att utföra epistasis analyser för att etablera en linjär bana eller samverkan av två proteiner i axon eller dendrit growth. Här kan två oberoende RNAi eller överexpression plasmider eller en kombination av båda samtransfekteras tillsammans med en transfektion markör.

In vivo elektroporering teknik är en idealisk metod för analys av neuronala migration i utvecklingen cerebellar cortex. Det är en fördel att använda valpar från en albino stam jämfört med en stam med mörk hy. Dessutom är det lättare att arbeta med råttungar på grund av sin större storlek cerebella. I våra händer, nästan alla cerebella är GFP-positiva, men i olika grad. En väl elektrolillhjärnan har många hundra GFP-positiva neuron, en dåligt-transfekterade lillhjärnan är mindre än 100. Med lite övning, är det också möjligt att använda möss om transgena möss som krävs för studien. Denna metod är betydligt snabbare än den generation av transgena möss och det gör det möjligt att analysera olika förhållanden (förlust-av-funktion, få-av-funktion och struktur-funktionsanalyser). IVE ringer inEquire Stereo är en svanhals lampa tillräckligt för att detektera cerebellum av en ganska genomskinlig albino valp. Detta kommer också att förkorta förfarandet tiden per valp och en kort anestesi med isofluran suffices. Det kräver dock lite övning för att rikta rätt region och på så sätt att behärska tekniken.

Utvecklingsproblem som orsakas av knockdown eller överuttryck är obetydliga på grund av den region genetisk manipulation av lillhjärnan. Detta gör det möjligt för analysen av inneboende mekanism som elektroporation resulterar i ett mosaikmönster av genetiskt modifierade neuroner inbäddade i en vild typ miljö. Nackdelen är att de elektroporerade råttor eller möss inte kan utsättas för beteende prov på grund av den låga mängden transfekterade nervceller. För att säkerställa att samuttryck av plasmider i neuroner rekommenderar vi samtransfektion med en plasmid som kodar för GFP (eller någon annan fluorescerande protein) under en neuron-specifika promotorn för att undvika visualiseringtion av transfekterade gliaceller. Effekter som resulterar i en minskning av axonal längd lätt kan upptäckas och mätas 24. Däremot är det tekniskt omöjligt att kvantifiera stimulerande effekter på axoner som hela sin längd inte kan spåras. Defasciculation av parallella fibrer är emellertid mätbart 20. Samma sak gäller för bedömningen av dendrit längd och neuronal migration 23,24,30. Vi utför vanligen ut våra analyser 5 dagar efter elektroporation. Det är naturligtvis möjligt att utföra analysen tidigare och senare. En senare tidpunkt rekommenderas att undersöka bildandet av dendritiska klor 29, som representerar den synaptiska samband mellan CGNs och mossiga fibrer.

För att slutföra analyserna, är det viktigt att välja lämplig statistisk metod. För detta måste man ta hänsyn till om värdena för grupperna följer en normalfördelning (t.ex. axonal eller dendriter längder) och om 2 eller mmalm än 2 grupper ingår i analysen. För 2 grupper, använder vi Students test, för mer än 2 grupper ANOVA. Om de värden som följer en icke-normal fördelning (t.ex. migrationsavstånd), Mann Whitney U-testet och Kruskal Wallis test måste användas för två eller fler än två grupper, respektive.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi tackar N. Schwedhelm-Domeyer för utmärkt tekniskt stöd, C. Hammer och S. Papiol för hjälp med statistiska analyser. Vårt arbete finansieras av Max Planck-sällskapet, Deutsche Forschungsgemeinschaft, Centrum för nano mikroskopi, och Molekylär fysiologi av hjärnan (CNMPB), Göttingen, Tyskland och av GGNB Junior Group stipendium på universitetet i Göttingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Gibco 11960-044
BME Gibco 41010-026
Insulin Sigma-Aldrich Si-1-4011
Poly-L-Ornithine Sigma-Aldrich P-2533
CaCl2 Appli-Chem A3652
Isoflurane Actavis Deutschland
Tissue-Tek OCT Sakura
ECM 830 and tweezertrodes Harvard Apparatus
Epifluorescence microscope and camera Nikon
SP2 confocal microscope Leica
ImageJ NIH
Imaris 7.4.2 Bitplane, Inc.
GraphPad Prism GraphPad Software, Inc.
MS Excel Microsoft
Loading tip 1-200 µl Costar 4853
Pipette tip 200 µl Sarstedt 70.760.502
Microlance 3 needle, 30 G BD 302200
50 µl gastight Syringe 1705 Hamilton
Glass coverslips  Thermo Scientific Menzel Glaeser CB00120RA1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cajal, S. R. Histology of the nervous system of man and vertebrates. , Oxford University Press. (1995).
  2. Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. (1997).
  3. White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography. J. Vis. Exp. , (2012).
  4. Palay, S. L., Chan-Palay, V. Cerebellar cortex: cytology and organization. , Springer. (1974).
  5. Hatten, M. E., Alder, J., Zimmerman, K., Heintz, N. Genes involved in cerebellar cell specification and differentiation. Curr. Opin. Neurobiol. 7, 40-47 (1997).
  6. Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu. Rev. Neurosci. 18, 385-408 (1995).
  7. Sillitoe, R. V., Joyner, A. L. Morphology molecular codes, and circuitry produce the three-dimensional complexity of the cerebellum. Ann. Rev. Dev. Biol. 23, 549-577 (2007).
  8. Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1. Neuron. 43, 345-357 (2004).
  9. Wingate, R. J. The rhombic lip and early cerebellar development. Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).
  10. Kawaji, K., Umeshima, H., Eiraku, M., Hirano, T., Kengaku, M. Dual phases of migration of cerebellar granule cells guided by axonal and dendritic leading processes. Mol. Cell Neurosci. 25, 228-240 (2004).
  11. Hatten, M. E., Gao, W. -Q., Morrison, M. E., Mason, C. A. Cellular and molecular neuroscience. , MIT Press. 419-41 Forthcoming.
  12. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J. Vis. Exp. , (2009).
  13. Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. 2008, (2008).
  14. Rivas, R. J., Hatten, M. E. Motility and cytoskeletal organization of migrating cerebellar granule neurons. J. Neurosci. 15, 981-989 (1995).
  15. Kuhar, S. G., et al. Changing patterns of gene expression define four stages of cerebellar granule neuron differentiation. Development. 117, 97-104 (1993).
  16. Baird, D. H., Hatten, M. E., Mason, C. A. Cerebellar target neurons provide a stop signal for afferent neurite extension in vitro. J. Neurosci. 12, 619-634 (1992).
  17. Segal, R. A., Pomeroy, S. L., Stiles, C. D. Axonal growth and fasciculation linked to differential expression of BDNF and NT3 receptors in developing cerebellar granule cells. J. Neurosci. 15, 4970-4981 (1995).
  18. Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).
  19. Smith, T. C., Wang, L. Y., Howe, J. R. Distinct kainate receptor phenotypes in immature and mature mouse cerebellar granule cells. Physiol. 517 (1), 51-58 (1999).
  20. Konishi, Y., Stegmuller, J., Matsuda, T., Bonni, S., Bonni, A. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain). Science. 303, 1026-1030 (2004).
  21. Stegmuller, J., Huynh, M. A., Yuan, Z., Konishi, Y., Bonni, A. TGFbeta-Smad2 signaling regulates the Cdh1-APC/SnoN pathway of axonal morphogenesis. J. Neurosci. 28, 1961-1969 (2008).
  22. Stegmuller, J., et al. Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN. Neuron. 50, 389-400 (2006).
  23. Kannan, M., Lee, S. J., Schwedhelm-Domeyer, N., Nakazawa, T., Stegmuller, J. p250GAP is a novel player in the Cdh1-APC/Smurf1 pathway of axon growth regulation. PLoS One. 7, (2012).
  24. Kannan, M., Lee, S. J., Schwedhelm-Domeyer, N., Stegmuller, J. The E3 ligase Cdh1-anaphase promoting complex operates upstream of the E3 ligase Smurf1 in the control of axon growth. Development. 139, 3600-3612 (2012).
  25. Gaudilliere, B., Konishi, Y., de la Iglesia, N., Yao, G., Bonni, A. A. CaMKII-NeuroD Signaling Pathway Specifies Dendritic Morphogenesis. Neuron. 41, 229-241 (2004).
  26. Yang, Y., et al. A Cdc20-APC ubiquitin signaling pathway regulates presynaptic differentiation. Science. 326, 575-578 (2009).
  27. Litterman, N., et al. An OBSL1-Cul7Fbxw8 ubiquitin ligase signaling mechanism regulates Golgi morphology and dendrite patterning. PLoS Biol. 9, (2011).
  28. Kim, A. H., et al. A centrosomal Cdc20-APC pathway controls dendrite morphogenesis in postmitotic neurons. Cell. 136, 322-336 (2009).
  29. Shalizi, A., et al. A calcium-regulated MEF2 sumoylation switch controls postsynaptic differentiation. Science. 311, 1012-1017 (2006).
  30. Vadhvani, M., Schwedhelm-Domeyer, N., Mukherjee, C., Stegmuller, J. The Centrosomal E3 Ubiquitin Ligase FBXO31-SCF Regulates Neuronal Morphogenesis and Migration. PLoS One. 8, (2013).
  31. Puram, S. V., et al. A CaMKIIbeta signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nat. Neurosci. , (2011).
  32. Jia, Y., Zhou, J., Tai, Y., Wang, Y. TRPC channels promote cerebellar granule neuron survival. Nat. Neurosci. 10, 559-567 (2007).
  33. Huynh, M. A., et al. An isoform-specific SnoN1-FOXO1 repressor complex controls neuronal morphogenesis and positioning in the mammalian brain. Neuron. 69, 930-944 (2011).
  34. de la Torre-Ubieta, L., Bonni, A. Transcriptional regulation of neuronal polarity and morphogenesis in the mammalian brain. Neuron. 72, 22-40 (2011).
  35. Calissano, P., et al. Recombinant human insulin-like growth factor I exerts a trophic action and confers glutamate sensitivity on glutamate-resistant cerebellar granule cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8752-8756 (1993).

Tags

Neurovetenskap axoner dendriter neuronal migration lillhjärnan odlade nervceller transfektion,
Genetic Manipulation av Cerebellar granulneuroner<em&gt; In Vitro</em&gt; Och<em&gt; In Vivo</em&gt; Att studera neuronal morfologi och migration
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holubowska, A., Mukherjee, C.,… More

Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmüller, J. Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration. J. Vis. Exp. (85), e51070, doi:10.3791/51070 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter