Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

K-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi kullanarak EGFP-etiketli Plazma Membran Proteinleri Difüzyon Katsayılarının kolay Ölçümü

doi: 10.3791/51074 Published: May 10, 2014

Summary

Bu kağıt floresan canlı memeli hücrelerinde plazma zarı proteinleri etiketli difüzyon katsayılarını ölçmek için dalgalanma analizi tekniği k-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi (kICS) için adım kılavuz bir adım sağlar.

Abstract

Yanal difüzyon ve plazma membran proteinlerinin kompartmentalizasyonunun sıkı hücrelerinde düzenlenir ve bu nedenle, bu süreçleri inceleyerek plazma membran proteini fonksiyonu ve regülasyonu için yeni anlayışlar ortaya çıkaracaktır. Son zamanlarda, k-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi (kICS) 1 doğrudan prob fotofizikten tarafından tanıtıldı sistematik önyargıları kaçınılması floresan etiketli plazma zarı proteinlerinin görüntüleri, gelen difüzyon katsayılarının rutin ölçümler sağlamak için geliştirilmiştir. Analiz için teorik temel karmaşık olsa da, bu yöntem proteinlerin difüzyon katsayıları ölçmek için bir kodu kullanarak serbestçe kullanılabilir nonexperts ile uygulanabilir. kICS karşılıklı (k-) alan her görüntünün Fourier dönüşümünden sonra bir floresan mikroskopi görüntü yığınından bir zaman korelasyon işlevi hesaplar. Daha sonra, dairesel ortalama, doğal logaritma dönüşümü ve doğrusal verir korelasyon fonksiyonuna difüzyon katsayısı uyuyor. BuKağıt kICS üzerinden görüntü analizi ve difüzyon katsayılarının ölçümü için bir adım-adım kılavuz sağlar.

İlk olarak, bir floresan etiketli plazma zar proteini yüksek çerçeve hızlı görüntü dizisi, bir floresans mikroskobu kullanılarak elde edilir. Daha sonra, ilgi (ROI) membran bölgeleri, hücre içi organelleri kaçınarak veziküllerini hareketli veya çıkıntılı bir bölge seçilir. ROI yığını bir serbestçe kullanılabilir koduna ithal edilir ve birkaç tanımlanmış parametreler (Yöntem bölümüne bakınız) kICS analiz için ayarlanır. Program daha sonra k-uzay zaman korelasyon fonksiyonlarından komplo bir "yamaçlarında yamaç" oluşturur ve difüzyon katsayısı arsa eğiminden hesaplanır. Aşağıda bir örnek olarak, bir kanonik EGFP ile etiketlendi renal su kanalı aquaporin-3 ile, bir membran proteini difüzyon katsayısı ölçmek için bir adım adım kICS işlemdir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Plazma zar proteinlerinin dört boyutlu uzaysal Organizasyon ve yanal hareket sıkı bir şekilde düzenlenmiş ve protein fonksiyonu, aktivite ve protein-protein etkileşimleri, bir rol oynayabilir. Plazma zarı proteinlerinin yanal difüzyon, geleneksel kuantum nokta time-lapse görüntüleme gelen tek parçacıklar için difüzyon katsayılarını hesaplayarak veya etiketli plazma zarı proteinleri 2-4 boya tarafından incelenmiştir. Bu yaklaşım, protein katlanmasına ve işlevini olumsuz etkileyebilir ve bu nedenle, bazı proteinler için elde edilemez kuantum nokta ya da boya etiketleme için plazma zar proteini, bir hücre dışı etiketi sokulmasını gerektirir. Kuantum nokta sterik hacmi, proteinin 5 difüzyonunu yavaşlatmak için ve ayrıca, popülasyondaki proteinlerin sadece çok küçük bir bölümü kuantum noktaları ile etiketlenir gösterilmiştir, ve bu fraksiyon toplam temsili ise bilinmemektedir plazma zarı proteinlerinin havuzu. Tek parçacık trakuantum dot etiketli proteinlerin görüntü dizisinden difüzyon katsayıları cking (SPT) ölçümleri haritalayan iki boyutlu Gauss olan parçacıkların görüntülenmiş zirve pozisyonları kapsamlı analizi algoritmaları ardından uyar içerir. Analiz açıklayan parçacık yörüngeleri içine mikroskop nokta dağılım fonksiyonu (genellikle iki boyutlu uzamsal Gauss) ve partikül pozisyonları sonraki bağlayan yaklaşımları bir time-lapse dizisi her resim çerçevesi uydurma geniş doğrusal olmayan eğri gerektiren hesaplama çok yoğun tek moleküllerin 6,7 hareketi.

Yakın zamanda geliştirilen görüntü korelasyonu tekniği, k-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi (kICS) floresan plazma zarı etiketli proteinlerin difüzyon katsayılarının göreceli basit ölçümler sağlar. Rutin kICS tarafından floresan proteinleri ile etiketlenmiş membran proteinlerinin difüzyon katsayılarını hesaplamak için olasılık tutan benzersiz bir araçtırGeleneksel kuantum üzerinde çeşitli avantajları SPT analizi dot: hücre dışı etiketleme alıcı dışı etiketleri ve zaman hiçbir ekleme (floresan proteinleri ifade hücre hatları kullanılabilir) gereklidir; difüzyon katsayıları kuantum noktaları ile etiketlenmiş bir alt ile karşılaştırıldığında floresan proteinlerin toplam miktarından çıkarılır; Analiz tek proteinler izlemek için gerek olmadan basit ve analiz ek kullanıcı programlanması için bir şartı ile olan bir kodu kullanarak gerçekleştirilebilir. Difüzyon katsayılarının hızlı hesaplama ve hesaplamayı sağlayan bir ortalama tekniktir çünkü yöntem hızlıdır. Protein nüfusun bu hızlı difüzyon ölçümleri özenli SPT yöntemlerle nüfusun bir alt kümesi için elde daha ayrıntılı moleküler taşıma bilgileri tamamlar.

kICS sefer ilk Fourier uzayında dönüştürülmüştür floresan mikroskobu görüntü dizileri ilişkilidir ve böylece fl ayırırMoleküler ulaşım 1 dolayı olanlardan fotofizikten nedeniyle uorescence dalgalanmalar. Sonuç olarak, kICS, sayı yoğunluğu belirlemek akış hızı ve kompleks ışıkla ağartma ile ilgili olan ya da florofor yanıp sönen difüzyon floresan etiketli moleküller olabilir. Bu, hızlı bir şekilde özel kICS yazma algoritmalar için gerek kalmadan floresan etiketli hücre zarı proteinlerinin difüzyon dinamiklerinin belirlenmesi için uygun bir araç sağlar. Bunun yanı sıra floresan etiketli proteinler, kICS da kuantum dot-işaretli zar proteinleri 8 uygulanabilir.

Bu kağıt kodu ve nasıl oluşturulan araziler, değerlendirmek için nasıl kullanılacağını, kırpma yerleştirmek için nasıl göstererek EGFP-etiketli plazma membran proteinlerinin difüzyon katsayıları ayıklamak için kICS kullanmak için nasıl bir adım-adım giriş sağlayan difüzyon itibaren katsayıları ayıklanır. Bir örnek olarak, yarı toplam iç yansıma disk mikroskopi dizi eğirme ile elde edilen veriler floresanEGFP'nin ile etiketlenmiş bir böbrek su kanalı proteini aquaporin-3 (AQP3) ve nce (TIRF) modu, sunulmuştur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

KICS analiz için plazma membranında EGFP-etiketli proteinlerinin kazanılması Epifloresans mikroskop, bir TIRF kurulum veya ilgi membran görüntüler elde etmek için ayarlanmış bir dönen disk mikroskop üzerinde yapılabilir. Görüntü kareleri arasında Kamera piksel boyutu hem de zaman analiz için gereklidir. 4-30 Hz çerçeve hızında 100-1,200 kare görüntü dizileri analizi için kullanılabilir. Edinimi sırasında, görüntüleme süresince odak membran tutmak ve floresans düzgün bir şekilde dağılmış olduğu düz bir zarın bir kısmı üzerinde odaklanmak için önemlidir. Kabarcıklara hareketli membran bölgeleri ve hücre organellerini çıkıntılı sonra analiz sürecinde dışarı kırpılmış olabilir. Hücrenin herhangi bir kayma ya da hareket olmadığı, böylece zaman alıcı seçilmelidir.

MATLAB için kICS kod komut almak için, Paul Wiseman başvurun (Paul.Wiseman @ McGill.ca). İlk kez kICS kod, açık MAT kullanılırLAB ve dosyayı tıklatın, sonra da set yol, alt klasörler ile ekleyebilir tıklayın ve kICS kod bulunduğu bilgisayarda klasörü bulmak. Ardından ok tıklayın kaydedin ve kapatın. Şimdi önümüzdeki puan açıklanan ürünlerin analizi ile devam ediyor.

1.. TIFF Stack olarak Görüntüleme Analiz Programı içine İlgi görüntü sırası alma

Stack1.tif: adı ile dosyayı kaydedin.

  1. Membran hareketli hücre organelleri hariç ve membran bölgeleri çıkıntılı düz kısmında ilgi alanları (ROI) dikdörtgen bir bölge seçin. Yeterli istatistik iyi k 2 araziler için oluşturulan böylece ekin boyutu seçilir.
  2. Bölgeyi kırpın ve uygun bir klasörde TIFF dosyası olarak kırpma kaydedin. Aynı film çeşitli bitkiler varsa, örneğin "stack1crop.tif", "stack1crop2.tif", "stack1crop3.tif" bir sayı artışı kullanın.
  3. Yerel bitkileri içeren klasörü yerleştirinbilgisayarda değil, bir sunucu üzerinde, kICS analiz yaparken.

2.. Analizi gerçekleştirin One tarafından Analizi Yazılım One'a Bitkileri alma

  1. Komut penceresi ve basın açık MATLAB ve tip "icsgui" ENTER. ICS GUI görüntü korelasyon spektroskopisi grafik kullanıcı arayüzü programı için yürütülebilir adıdır.
  2. ICS GUI "kICS" sekmesine tıklayın. Analiz penceresinin bir ekran görüntüsü, Şekil 1 'de gösterilmiştir.
  3. Klasör adı "MATLAB kod" ile klasörünü bulun ve dosya adı "Scripts" ile dosyaya ilerleyin ve çift tıklayarak bu açın. Alternatif olarak, dosyaya sağ tıklayın ve "MATLAB ile açmak" veya dosyaya gidin, MATLAB açık ve komut dosyasını açın seçin. Bu dosya Editör denir.
  4. Editör kaydırma "Load kICS veri setleri", daha sonra komut satırına kopyalamak veya tipi dosya adı ve klasör konumu başlar içindeimg = örneğin ": Users Documents AQP3dynamics stack1crop.tif C" ile. Örneğin [1:500] - klasör konumu altında komut satırında analiz edilecek kare sayısını ayarlayın. Veri serisindeki tüm ardışık filmler için aynı ayarları kullan. Odak kayması sonraki kare varsa, bu analize dahil edilmelidir.
  5. Editör tıklatın "kurtarmak" ve ardından "hücre değerlendirmek" tıklayın. Veri kümesi şimdi analiz yazılımı yüklenir.
  6. GUI kICS Analizi penceresinde, analiz için ayarları girin:
    1. "T-hücresi" kutuları unclick.
    2. Giriş zaman sayısı analiz edilecek kalmaktadır. Gecikme süresi (τ) sayısı difüzyon arsa üzerinde etkisi olacaktır ve difüzyon arsa doğrusal şekilde seçilmelidir. 25 ile girerek başlayın ve daha sonra difüzyon arsa doğrusal olduğu için azalır. τ sayısı kICS analiz karşılaştırır zaman-gecikme ve bir gecikme zamanı between bir kare ve bir sonraki. Lineer bir çizgi veren küçük değer seçilmelidir. Süresi en fazla doğrusal uygun daha yüksek bir değer hat takılamaz bilgi verir seçimi, elde edilir, böylece seçilir kalmaktadır.
    3. Maksimum k 2 değerini girin (Şekil 1 daire 1 bakınız), genellikle 20-50 olduğunu. İyi bir k 2 arsa bir hat boyunca dağıtılmış olan birçok veri noktası olduğu bir grafiğidir. 70 ile girerek başlayın ve daha sonra k 2 ve difüzyon araziler değerlendirilerek sonra azalma ve düşük değerini seçmek nerede düz bir çizgi etrafında veri noktaları küme. K 2 değeri Fourier uzayında mekansal k-vektörünün kare büyüklüğü.
      Iyi K 2 araziler: Başlangıçta, analiz iyi değerler belirleninceye kadar, daha sonra seçilmiş ayarları verilere iyi bir uyum vermesi kontrol her zaman veri serisindeki tüm ardışık filmler için aynı ayarları kullanabilirsiniz ama tekrar edilmelidirve lineer difüzyon arsa.
    4. "Store ayarları ve devam" tıklayın.
    5. Tüm grafikleri göstermek için "evet" tıklayın.
    6. "Load görüntü serilerini" (Şekil 1 daire 2 bakınız) tıklayın, ardından "çalışma alanı" tıklayın.
    7. "ImgSerCrop" seçeneğini seçin, ardından "Workspace al" seçeneğini tıklatın.
    8. Görüntüleme sistemi toplama ayarlarını girin. Kutu "piksel boyutuna" in görüntü yığınlarının satın alınan hangi görüntüleme sistemi için öngörülen piksel boyutunu girin. AQP3-EGFP'nin için, 0.111 kullanılmıştır. Kutusuna "çerçeveler arasındaki süreyi (ler) gir", 0,1150 AQP3-EGFP'nin için kullanıldı.
    9. "1", ok tıklayın ve "bütün görüntüyü kullanmak" girin "İB'leri seçin" seçeneğini tıklayın.
    10. "Do kICS analizi" ni tıklayın ve "hareketsiz filtreleme" yapmak için tıklayın evet. Sonuçlar görüntüleri otomatik olarak açılacaktır.
    11. Ayarlar penceresini minimize, hücre bilgi windo en aza indirmekw ve PHOTOPHYSICS penceresini minimize. Dinamikleri penceresinde, dinamik arsa veri noktaları korelasyon ve ücretsiz difüzyon kabul edilebilir, yani bir negatif eğimli bir çizgiye veri doğrusal bir uyum gösterdiğini kontrol edin. Belirli bir zaman gecikme için difüzyon katsayısı kaydedin ve 2 ayarları (bu uyum standart sapması dikkat etmek gerekli değildir) k. K 2 parsellerde veri noktaları gecikme belirli bir süre için hat etrafında kümelenmiş gerekir.
    12. Tick ​​box "görüntüler olarak açık rakamları kaydet", daha sonra neden dosyaları kaydetmek için "görüntü olarak açık rakamları kaydet" seçeneğini tıklayın. C altında yeni bir klasöre kaydet: Users Documents AQP3diffusion. "Net güncel veri" tıklayın ve bir sonraki ürün analizi ile devam ediyor.

Hesaplanan Difüzyon Katsayısının 3.. Ortalama Analiz Verilerin bir bakış Get Hesaplanır

  1. Bir spre her ROI bireysel difüzyon katsayıları girinadsheet (τ not ve 2 değerlerini k emin olun), yukarıda belirtilen ürünlerin adları kullanın.
  2. Bir elektronik tablo programı kullanarak ortalama difüzyon katsayısı ve standart sapma hesaplayın.
  3. Kolmogorov-Smirnov testi veya öğrencilerin% 5 anlamlılık düzeyi kullanılarak istatistiksel farklılıkları değerlendirmek için t-testi gerçekleştirin. Hücreler (örneğin, tedavi edilmeyen genel muamele edilmiş) arasında Niceliksel karşılaştırmalar yapılabilir.
  4. Her ürün için analiz yazılımı tarafından üretilen ve her zaman lag için her durum için verileri ortalama difüzyon parsellerin elektronik tablo sürümünü açın. Gazetelerde veya sunumlarda sunmak için yeni bir ortalama difüzyon arsa üretmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

KICS ile analiz edilmesi için uygun resim yığınları elde etmek için, farklı bir mikroskop sistemleri kullanılabilir. Bu bir epi-floresan mikroskop gibi bir TIRF veya dönen bir disk kurulumu görüntü dizileri analiz etmek mümkündür. Membran herhangi bir büyük hareketli hücre organelleri olmayan veya kesecikleri / hareketli nesneleri düz olmalıdır. Bu kağıt 9.2 Hz'lik bir kare hızında plazma zarı ayarlanmış bir odaklanma ile dönen disk mikroskop görüntülü canlı MDCK hücrelerinde EGFP'nin ile etiketlendi AQP3 bir zaman atlamalı görüntü dizisi sunuyor. Odak bazal (alt) plazma membranında belirlenmiştir. Veriler son zamanlarda AJP Cell 13 yayımlanmıştır.

Şekil 2A, hücrenin bir görüntü gösterilir. Ölçek çubuğu 10 mm ve örnek ROI bitkileri dikdörtgenler vurgulanır. Ürünlerin seçimi için bu membran düzgün ve düz yüzden sadece bir iki-boyutlu difüzyon görüntülenmiştir olan hücrenin çevresine kırpmak için önemlidir. Cell organeller, veziküller ve membran çıkıntılar kaçınılmalıdır ve hiçbir kayma zamanı sırasında atlamalı olduğu analizi için önemlidir. Analize dahil olacağını bitkilerinin örnekleri Şekiller 2B ve 2C'de gösterilmiştir. Hareketli veziküller korelasyon (Şekil 2B) ve bu durumda (Şekil 2C) açıkça analize dahil edilmemelidir hafifçe hareket zarda delikler katkıda bulunur. Bu ROI ürün analizi için yeterli uzaysal örnekleme (yüksek NA objektif lens ile görüntüleme için 32 piksel minimum doğrusal boyutu makul bir kılavuzdur) için yeterince büyük olması da önemlidir. Bu veri kümesi için 60X (NA 1.40) kullanılmıştır.

Şekil 3A kICS ile üretilen bir ürünün difüzyon grafiğini göstermektedir. Bu yöntem, EGFP (veya başka bir flüoresan protein) ile etiketlenmiş bir protein difüzyon katsayısı bulmak için kullanılabilir, bir boyaveya kuantum noktalar. Difüzyon arsa eğrinin eğimi basit difüzyon katsayısının negatiftir. Bu durumda, AQP3-GFP difüzyon katsayısı 0.0104 ± 0.0040 mikron 2 / s. Şekil 3B, çok fazla zaman ile, hesaplanan difüzyon plot bu durumda, analiz redone, ancak daha az gecikme süresi ile kalmaktadır böylece difüzyon arsa doğrusaldır.

Şekil 4A, tipik k 2 çizimini sunar. Bu seçilen bir zaman gecikme için radyal ortalama ve ln dönüştürülmüş korelasyon eğrisi. Zaman gecikmeleri ve Şekil 3A'da gösterildiği gibi sonuç difüzyon grafiğidir karşı bu k 2 araziler kaynaktan eğim çizilir. K 2 araziler kontrol ederken, bu uygun değerlendirilir önemlidir. Şekil 4B, bu ürün çok küçük olduğu sonucuna varılabilir ve gerektiği gibi analiz edilememiştir hangi ak 2 arsa örneğidirBir gürültü tabanı doğrusal bir negatif eğim ve çürüme sahiptir. Şekil 4C uygun olarak bir indirgenmiş fazla k 2 değeri ile tekrar analiz edilmesi gerekmektedir ak 2 arsa örneğidir büyük k artan artıklar ile değerlendirildiği gibi (artık iyidir 2 değerleri). Bu durumda analiz tekrar bu durumda 25, daha düşük bir maksimum k 2 değer girerek çalıştırılması gerekir.

Şekil 5, bir ortalama difüzyon arsa üzerinde 10 ekinler ortalama gösterir. Difüzyon arsa analizi Excel dosyasına bulundu ve tüm yayılma araziler hemen aynı deneyden gelen tüm ürünler için ortalama edilebilir. Elde edilen difüzyon arsa olarak hücrenin farklı tedaviler aynı şekilde birleştirilebilir. Paralel trend çizgileri eşit difüzyon katsayıları ve paralel olmayan trend çizgileri eşit yayılmasını gösterir. Bu şekilde, AQP3-EGFP difüzyon katsayısı (AJP Cell 13 veri) hesaplanır.


Şekil 1. KICS analiz penceresinin ekran görüntüsü. Bu pencerede kiCS analiz yapılır. Çevreler protokolde bireysel adımlar için basın hangi düğmeleri gösterir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 2,
Kararlı biçimde AQP3-GFP ve gösterilen temsili bitkileri sentezleyen bir MDCK hücre Şekil 2.. GFP ifade eden bir hücrenin disk görüntü İplik. (A) Örnek görüntüsü. Görüntü bazal plazma zarı odak yakın olan bir dönen disk mikroskop elde edilir. (B) Repres Difüzyon katsayısı katkıda bulunabilir hareketli kesecikler, olduğu için kICS analiz çıkarılmıştır entative ürün. (C), zar içinde bir delik olan bir ekinin bir örneği, bu nedenle, bu ürün analizden çıkarılmıştır. Bütün ölçekli çubuklar 10 mikron. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 3,
Şekil 3.. Difüzyon araziler. (A) tüm nokta çizgi oturması yakın olduğu bir temsilci difüzyon arsa. Veri doğrusal olduğu için bu iyi bir difüzyon grafiğidir. (B) analiz timelags daha düşük bir numarayı kullanarak yeniden yapılması gereken bir difüzyon arsa bir örnek. 3highres.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Şekil 4,
Şekil 4,. K örnekleri arasında 2 araziler. Veri noktaları eşit hat uyum her iki tarafında dağıtıldığı iyi k 2 arsa (A) bir örnek. (B) en uygun boyutundan daha küçük bir ürün için ak 2 arsa bir örnek. Bu k 2 arsa olarak, hat uyum eğim pozitif olup, bu negatif ve bu nedenle ürün analize dahil edilir olmalıdır. (C) bu k 2 arsa analiz k 2 arsa parçası seçmek için daha düşük bir maksimum 2 k değeri ile yeniden yapılması gerektiğini gösteren veriler eşit çizgi uyum her iki tarafında dağıtılır edildi.oad/51074/51074fig4highres.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Şekil 5,
Şekil 5. Difüzyon arsa Ortalamalı. Bir 10 yılı bitkileri ortalama edildi difüzyon arsa ortalama.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu kağıt floresan proteinleri ile etiketli proteinlerin mikroskopi görüntüleri difüzyon katsayıları belirlemek için kICS analiz yöntemi uygulamak için nasıl ayrıntılı adım-adım bir bakış sundu. Analiz etiketleme yoğunluğunda çok geniş bir dinamik aralık ile prob seçimi bağımsızdır ve bu yüzden aynı zamanda Kuantum noktalarının yanısıra boyalar ve EGFP gibi floresan proteinleri ile etiketlenmiş proteinleri uygulanabilir.

Proteinler için geçerli difüzyon katsayılarını hesaplamak için, optimize edilmiş birçok kritik adımlar vardır. Sadece zar üzerinde görüntü etiketli proteinler için gereklidir. Analiz edilecek görüntü sırayla veziküllerini veya hücre organellerini hareket gibi ek nesneler varsa, bu difüzyon katsayısının altında veya overestimates sonuçları hesaplanan difüzyon katsayısına katkıda bulunacaktır.

Yukarıda sıralanan adımları takip kICS için GUI kodu kullanıcı dostu bir olduğunund analiz hızlıdır. Difüzyon katsayısı için bir ortalama ve istatistiksel olarak önemli bir değer arasında pratik üretimi kolaylaştırır gecikme süresi, bir fonksiyonu olarak ortalama alma ve dairesel difüzyon eğimleri grafiğinin eğiminden hesaplanmasında dahil olmak üzere: Birkaç ortalama adımlarını içerir. Böylece, SPT deneyleri, kICS gelen difüzyon katsayılarını hesaplamak için gerekli kapsamlı analize göre, kullanıcı dostu, hızlı ve biyofizik özel eğitim olmadan yapılabilir.

Analizinde negatif difüzyon katsayısı veya yatay difüzyon arsa sonuçlanır varsa, sorun giderme burada açıklanan tüm şartları yerine getirmesi halinde görmek için mahsulün görsel denetim içerir. Çok küçük Bitkileri Fiziksel olmayan negatif difüzyon katsayıları verebilir ve atılmalıdır. Bir difüzyon katsayısını hesaplamak amacıyla, bu analiz için ya da sadece mahsulü artırmak uygun kümesi içinde başka bir yerde yeni bir ürün yapmak için sık sık mümkünboyutu mümkünse.

Bu tekniğin en çok veri setlerine uygulanabilir ancak şu anda, kICS analizi sadece ortalama bir difüzyon katsayısını hesaplayabilir ve farklı protein göç desen veya ayırt yörüngeleri elde edemez. KICS kullanarak, difüzyon katsayıları kolayca elde edilebilir ve bir proteinin yayılma muamele edilmiş ve edilmemiş olan hücrelerde arasında ya da bir vahşi-tip ve mutasyonların tedavi difüzyon farklılıkları neden olmadığını ortaya bir mutant protein arasında, ve bu nedenle, örneğin karşılaştırılabilir Potansiyel olarak protein-protein ve / veya protein-lipid etkileşimlerinde. FRAP ile ölçülen AQP2 plazma membran yayılma, ER, ayrıca farklı vahşi tipli AQP2 9 daha dağınık nefronejik tatsız diyabet neden AQP2 mutasyona uğramış bir versiyonu, forskolin, bir cAMP agonistinin 10 eklenmesi üzerine azaltmak ve gösterilmiştir.

Bu tek parçacık d difüzyon katsayılarını hesaplamak mümkün olsaata ortalama kare yer değiştirme, adım büyüklüğü analiz veya parçacık görüntü korelasyon spektroskopisi 2,11,12 kullanarak, bu analiz yöntemleri hesaplama talep edilebilir ve genellikle özel bilgisayar algoritmaları yazılı gerektirir. Burada yer alan kICS protokolünün avantajı etiketleme yoğunluğunun nispeten bağımsız ve hesaplama kolay olmasıdır. KICS analiz yoluyla bu yürüyüş böylece kolaylıkla kendi ilgi membran proteini bunu uygulayabilirsiniz birçok hücre biyologlar için faydalı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Acknowledgments

Bu çalışma Han'a bir Lundbeck Gençler Grubu Lideri Bursu ile desteklenmiştir. PWW Doğa Bilimleri ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) hibe fon desteği kabul eder. Biz Ayrıca disk mikroskobu iplik erişim için Güney Danimarka Üniversitesi Danimarkalı Moleküler Biyogörüntüleme Merkezi'ni teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Gibco 31600-083
FBS Invitrogen 10082147
Penicilin   Sigma 13752
Kanamycin Gibco 15160070
Streptomycin Gibco 11860038
Phenol red free medium Gibco 11880-028
DMSO Sigma D8418
HEPES Gibco 15630056
Apparatus
Spinning Disk Microscope Nikon Ti Eclipse
EMCCD Camera Andor Ixon+

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics. Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).
  2. Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).
  3. Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots. Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).
  4. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
  5. Pinaud, F., et al. Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking. Traffic. 10, 691-712 (2009).
  6. Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations. Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).
  7. Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).
  8. Durisic, N., et al. Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules. Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).
  9. Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera. Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).
  10. Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus. The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).
  11. Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys J. 92, 613-621 (2007).
  12. Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).
  13. Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Løcke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion. Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).
K-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi kullanarak EGFP-etiketli Plazma Membran Proteinleri Difüzyon Katsayılarının kolay Ölçümü
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Marlar, S., Wiseman, P. W., Nejsum, L. N. Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (87), e51074, doi:10.3791/51074 (2014).More

Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Marlar, S., Wiseman, P. W., Nejsum, L. N. Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (87), e51074, doi:10.3791/51074 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter