Easy Måling av diffusjonskoeffisienter av EGFP-merket plasma membran Proteiner Bruke k-Space Bilde Korrelasjon spektroskopi

Summary

Denne artikkelen gir en trinnvis guide til svingninger analyseteknikken k-Space Bilde Korrelasjon spektroskopi (kICS) for å måle diffusjonskoeffisienter av fluorescensmerkede plasma membran proteiner i levende pattedyrceller.

Abstract

Lateral spredning og compartmentalization av plasma membran proteiner er strengt regulert i celler og dermed vil studere disse prosessene avsløre nye innsikter til plasma membran protein funksjon og regulering. Nylig, k-Space Bilde korrelasjon spektroskopi (kICS) ¹ ble utviklet for å muliggjøre rutinemålinger av diffusjonskoeffisienter direkte fra bilder av fluorescently merkede plasma membran proteiner, som unngikk systematiske skjevheter introdusert av probe photophysics. Selv om det teoretiske grunnlag for analysen er komplekse, kan fremgangsmåten gjennomføres ved nonexperts ved hjelp av en fritt tilgjengelig kode for å måle diffusjonskoeffisienter i proteiner. kICS beregner en tid korrelasjon funksjon fra en fluorescens mikrosbildestakk etter Fourier transformasjon av hvert bilde til gjensidige (k-) plass. Deretter sirkulær gjennomsnitt, naturlig logaritme transformere og lineær passer til korrelasjonen funksjonen gir den diffusjonskoeffisienten. DetteArtikkelen gir en steg-for-steg guide til bildeanalyse og måling av diffusjonskoeffisienter via kICS.

Først blir en høy bildefrekvens bildesekvens fra et fluorescensmerkede plasmamembranprotein ervervet ved hjelp av et fluorescens mikroskop. Så, er en region av interesse (ROI) unngå intracellulære organeller, flytting vesikler eller utstående membran regioner valgt. Den avkastningen stabelen importeres til en fritt tilgjengelig kode og flere definerte parametere (se metode kapittel) er satt for kICS analyse. Programmet genererer deretter en "skråningen av bakkene" plottet fra k-space tid korrelasjonsfunksjoner, og spredningen koeffisienten beregnes fra skråningen av tomten. Nedenfor er en steg-for-steg kICS prosedyre for å måle spredningen koeffisient av en membran protein ved hjelp av nedsatt vann kanal aquaporin-3 tagget med EGFP som en kanonisk eksempel.

Introduction

Den firedimensjonal tid og rom organisering og lateral mobilitet av plasmamembranproteiner er strengt regulert, og kan spille en rolle i proteinfunksjon, aktivitet og protein-protein interaksjoner. Lateral spredning av plasma membran proteiner, har tradisjonelt blitt studert ved å beregne diffusjonskoeffisienter for enkeltpartikler fra time-lapse avbildning av quantum dot eller dye merket plasma membran proteiner ^2-4. Denne tilnærmingen krever innsetting av et ekstracellulært tag i plasmamembranprotein for quantum prikk eller fargestoff merking, som kan kompromittere proteinfolding og funksjon og derved kan ikke oppnås for noen proteiner. Den sterisk volum av et kvantesprang dot har vist seg å forsinke diffusjonen av proteinet ⁵ og dessuten bare er en liten brøkdel av proteinene i populasjonen merket med quantum prikker, og det er ikke kjent om denne fraksjon er representativt for den totale pool av plasma membran proteiner. Enkelt partikkel tracking (SPT) målinger av diffusjonskoeffisienter fra bildeserie av quantum dot merkede proteiner innebærer kartlegging de fotografert topposisjonene av partiklene med todimensjonal Gaussian passer fulgt av omfattende analyse algoritmer. Analysen er beregningsmessig svært intensiv, som krever omfattende ikke-lineær kurvetilpasning i hvert bilderammen fra en intervallsekvensen til tilnærmelser av mikroskopet punktspredefunksjon (typisk to-dimensjonal romlig Gaussians), og etterfølgende kobling av partikkelposisjoner i partikkelbaner som beskriver bevegelse av enkle molekyler ^6,7.

En nylig utviklet bilde korrelasjon teknikk, k-Space Bilde Korrelasjon spektroskopi (kICS) gjør relative enkle målinger av diffusjonskoeffisienter av fluorescently tagget plasma membran proteiner. Muligheten til rutinemessig beregne diffusjonskoeffisienter av membran proteiner merket med fluorescerende proteiner ved kICS er et unikt verktøy som holderflere fordeler fremfor tradisjonelle quantum dot SPT-analyse: Ingen innsetting av ekstracellulære koder og tidkrevende ekstracellulære merking er nødvendig (cellelinjer som uttrykker fluorescerende proteiner kan anvendes); diffusjonskoeffisienter blir trukket ut fra den totale pool av fluorescerende proteiner sammenlignet med en delmengde som er merket med kvanteprikker; Analysen er enkel, uten behov for å spore enkle proteiner, og analysen kan utføres ved å bruke en eksisterende kode uten krav om økt brukerprogrammering. Metoden er hurtig, fordi det er en midlingsteknikk som muliggjør rask beregning og beregning av diffusjonskoeffisienter. Disse raske diffusjon målinger for protein befolkningen utfylle mer detaljert molekylær transport informasjon innhentet for en undergruppe av befolkningen av de møysommelig SPT metoder.

kICS tid korrelerer fluorescens mikrosbildesekvenser som har første blitt forvandlet til Fourier plass, og dermed skiller fluorescence svingninger som følge av photophysics fra de som skyldes molekylære transport ^en. Som et resultat, kan kICS bestemme antall tetthet, strømningshastighet, og spredning av fluorescensmerkede molekyler som samtidig er objektivt ved komplekse fotobleking eller blinking av fluoroforer. Dette gjør kICS et nyttig verktøy for raskt å bestemme diffusjon dynamikken i fluorescently-merket celle membran proteiner uten å måtte tilpassede skrive algoritmer. Foruten fluorescensmerkede proteiner, kan kICS også brukes på quantum dot-merket membran proteiner ^åtte.

Denne artikkelen gir en trinn-for-trinn innføring av hvordan du bruker kICS å trekke diffusjonskoeffisienter av EGFP-tagget plasma membran proteiner ved å demonstrere hvordan man skal plassere beskjære, hvordan å bruke koden, og hvordan man skal vurdere de genererte tomter, som diffusjon koeffisientene er hentet. Som et eksempel av data som oppnås fra den roterende disk-mikroskopi-apparatet i semi-total intern refleksjon fluoresceNCE (TIRF) modus, av en nedsatt vann kanal protein aquaporin-3 (AQP3) merket med EGFP presenteres.

Protocol

Oppkjøp av EGFP-merket proteiner i plasmamembranen for kICS analyse kan gjøres på en epifluorescence mikroskop, en TIRF oppsett eller på en roterende disk mikroskop satt til å hente bilder av membranen av interesse. Kameraet pikselstørrelse, så vel som tiden mellom bilderammer som er nødvendig for analysen. Bilde sekvenser av 100-1,200 rammer ved en frekvens på 4-30 Hz kan anvendes for analyse. Under kjøpet, er det viktig å holde membranen i fokus gjennom hele varigheten av avbildning, og fokusere på en brø…

Representative Results

Å skaffe egnede bildestakker å bli analysert med kICS, kan ulike mikroskop systemer brukes. Det er mulig å analysere bildesekvenser fra en epi-fluorescens mikroskop samt en TIRF eller en roterende disk oppsett. Membranen må være flat uten noen store bevegelige celleorganeller eller flytte blemmer / objekter. Dette notatet presenterer en tid lapse bildesekvens av AQP3 tagget med EGFP i levende MDCK celler fotografert på en roterende disk mikroskop med fokus satt til plasmamembranen med en bildefrekvens på 9,2 Hz. …

Discussion

Denne artikkelen presentert en detaljert steg-for-steg oversikt over hvordan du skal bruke den kICS analysemetode for å bestemme diffusjonskoeffisienter fra mikroskopi bilder proteiner merket med fluorescerende proteiner. Analysen er uavhengig av sonden valg med et meget bredt dynamisk område i etikette densitet og kan således også anvendes på proteiner merket med kvanteprikker samt fargestoffer og fluorescerende proteiner som EGFP.

For å beregne gyldige diffusjonskoeffisienter for pro…

Materials

DMEM	Gibco	31600-083
FBS	Invitrogen	10082147
Penicilin	Sigma	13752
Kanamycin	Gibco	15160070
Streptomycin	Gibco	11860038
Phenol red free medium	Gibco	11880-028
DMSO	Sigma	D8418
HEPES	Gibco	15630056
Apparatus
Spinning Disk Microscope	Nikon	Ti Eclipse
EMCCD Camera	Andor	Ixon+