绿色荧光蛋白标记的质膜蛋白质的扩散系数的简易测量采用K空间图像相关光谱

Summary

本文提供了一个一步一步引导到波动分析技术K空间图像相关光谱（KICS），用于测量扩散系数的荧光在活的哺乳动物细胞标记质膜蛋白。

Abstract

横向扩散和质膜蛋白的条块被严格调控的细胞，因此，研究这些过程，就会发现新的见解到质膜蛋白的功能和调节。最近，K空间图像相关光谱^（KICS）1的开发，使扩散系数的常规测量直接从荧光标记细胞膜蛋白的图像，即避免探头光物理引入系统偏差。虽然用于分析的理论基础是复杂的，该方法可以通过使用一个免费提供的代码来测量蛋白质的扩散系数非专家来实现。 KICS计算时间相关函数从荧光显微图像堆栈的每个图像的傅立叶变换倒数（K-）空间后。随后，圆形平均，自然对数变换和线性拟合的相关函数产生的扩散系数。这本文提供了一步一步的指导，通过KICS图像分析和扩散系数的测量。

首先，使用荧光显微镜获取荧光标记的细胞质膜蛋白质的高帧频的图像序列。然后，感兴趣区域（ROI）避免细胞内细胞器，移动囊泡或凸膜区域的区域被选中。投资回报率堆栈被导入到一​​个可以自由使用的代码和几个定义的参数（见方法部分）是为KICS分析设置。然后程序会生成一个情节从k空间时间相关函数“的坡坡”，而扩散系数是从该曲线的斜率计算。下面是一步一步的KICS程序使用肾水通道蛋白-3标有绿色荧光蛋白作为一个典型的例子来衡量一个膜蛋白的扩散系数。

Introduction

质膜蛋白质的四维时空组织和横向流动被严格调控，并可能在蛋白质的功能，活性和蛋白质 - 蛋白质相互作用中发挥作用。质膜蛋白的侧向扩散，在传统上被研究通过计算单个微粒的扩散系数由量子点的时间推移成像或染料标记的质膜蛋白^2-4。这种方法需要插入质膜中的蛋白质对量子点或染料标记，它可以破坏蛋白质折叠和功能，因此，不能达到对某些蛋白质的胞外标记。量子点的空间体积已经显示出减缓蛋白⁵的扩散，而且，在人口中的蛋白质只有一小部分被标以量子点，并且如果该馏分是代表对总它不知道池质膜蛋白。单粒子TRA扩散系数从形象系列量子点标记的蛋白他妈的（SPT）的测量涉及的映射与二维高斯粒子的适应其次是广泛的分析算法成像的峰位。该分析在计算上是非常密集的，需要大量的非线性曲线拟合中的时间推移序列的每个图像帧的显微镜点扩散函数（通常为2维空间高斯）和粒子位置的后续联的近似成粒子轨迹描述单分子^6,7的运动。

一项最近开发的图像相关技术，K空间图像相关光谱（KICS）使扩散系数的相对简单的测量的荧光标记质膜蛋白。经常性地计算由KICS标有荧光蛋白膜蛋白的扩散系数的可能性是它拥有独特的工具比传统的量子几个优点点SPT分析：外标签和费时外标签无插入是必需的（可用于表达荧光蛋白的细胞系）;扩散系数是从比较标记的量子点的子集的荧光蛋白的总萃取池;分析是简单而不需要跟踪单个蛋白质和分析，可以使用具有附加的用户编程不要求现有的代码来执行。该方法快速，因为它是一个平均的技术，它能够快速计算扩散系数和计算。这些快速扩散测量的蛋白质补充人口的艰苦SPT方法获得的总体的子集的更详细的分子运输信息。

KICS相关时间已先被转化为傅立叶空间荧光显微图像序列，从而分离FL由于从那些由于分子运输¹光物理uorescence波动。其结果是，KICS可以确定数密度，流动速度和扩散的荧光而被中立通过复杂的光漂白或闪烁的荧光团标记的分子。这使得KICS用于快速确定荧光标记的细胞的膜蛋白的扩散动力学，而不需要自定义写入算法的有用工具。除了 ​​荧光标记的蛋白，KICS也可以应用到量子点标记的膜蛋白^8。

本文提供了一步一步的介绍如何使用KICS演示了如何将作物，如何使用代码，以及如何评估产生的地块，提取绿色荧光蛋白标记的质膜蛋白质的扩散系数从中扩散系数进行萃取。作为一个例子，通过旋转圆盘镜组中半全内反射所获得的数据发荧光NCE（TIRF）模式标记EGFP肾水通道蛋白水通道蛋白3（AQP3）中，提出了。

Protocol

采集在质膜EGFP-标记的蛋白的KICS分析可以在落射荧光显微镜，TIRF设置或在一个旋转盘显微镜设置为获取所关注的膜的图像来完成。摄像机像素尺寸以及图像帧之间的时间是需要的分析。可用于分析在4-30赫兹帧频100-1,200帧的图像序列。在采集时，要保持对焦的膜在整个成像持续时间和集中于平膜，其中，荧光均匀分布的一小部分是很重要的。移动囊泡，突出膜区域和细胞器可以稍后在分析过程中裁剪出。采集时间的选择应使得存在的细胞的无漂移或运动。

要获得KICS代码脚本的MATLAB，请联系保罗·怀斯曼（Paul.Wiseman @ McGill.ca）。第一次KICS代码时，打开MAT劳顾会，并单击文件，然后设置路径，然后单击添加子文件夹，并在其中找到了KICS代码所在的计算机上的文件夹。然后点击确定，保存并关闭。现在，继续在未来的点描述作物的分析。

1，导入利息的图像序列到成像分析程序为TIFF堆栈

与保存的文件名称：stack1.tif。

1. 在膜不包括运动细胞器和膜突出区域的平坦部分选择的感兴趣区（ROI）的矩形区域。裁切尺寸选择，使那些好的K ²地块产生了足够的统计数据。
2. 裁剪区域并保存作物在适当的文件夹中的TIFF文件。如果有多个庄稼从同一影片，使用数增加量， 例如 “stack1crop.tif”，“stack1crop2.tif”，“stack1crop3.tif”。
3. 将包含本地作物的文件夹在电脑上，而不是在服务器上，而这样做KICS分析。

2，导入作物进入分析软件逐一进行分析

1. 在命令窗口，然后按打开MATLAB和类型“icsgui”ENTER。 ICS的界面是针对图像相关光谱图形用户界面程序的可执行文件名。
2. 在ICS界面点击“KICS”选项卡。屏幕截图的分析窗口如图1。
3. 找到文件夹名称“MATLAB代码”的文件夹，然后滚动到文件，文件名为“脚本”，并双击它打开此。或者，右键单击该文件，选择“打开用MATLAB”，或转到文件，在MATLAB中打开并打开脚本文件。此文件被称为编辑器。
4. 在编辑器中滚动到“加载KICS数据集”，然后复制或键入文件名和文件夹位置到命令行的开始与IMG = 例如 “C：用户文档 AQP3dynamics stack1crop.tif”。在下面的文件夹位置在命令行中设置帧进行分析的号码- 如：[1:500]。使用相同的设置适用于所有连续的电影中的数据系列。如果有焦点漂移在以后的框架，这些都应该被排除在分析之外。
5. 在编辑器中单击“保存”，然后点击“计算单元”。该数据集现在被装载到到分析软件。
6. 在GUI中KICS分析窗口中，输入分析的设置：
   1. 不要选取“T细胞”框。
   2. 输入的时间滞后数进行分析。的时间延迟（τ）的数量将有作用，对扩散情节，必须选择这样的扩散图是线性的。开始输入25，然后下降到扩散剧情是线性的。 τ是多少时间滞后于KICS分析比较和一个时间滞后的时刻Between一帧和下一。最小的值，给出了一个线性图应该被选中。时间的最大数量滞后选择这样的线性拟合得到，选择较高的值会产生不能被线拟合数据。
   3. 输入最大^的 K ²的值（见圆圈1在图1中），它通常是20-50。一个好的K ²图是一个阴谋，其中有些是沿直线分布的许多数据点。从输入70，然后在评估的K ²和扩散曲线后下降，并选择最低的值，其中围绕一条直线上的数据点簇。第k ²的值是空的k-矢量在傅立叶空间中的平方幅度。
      最初，分析重复，应直到最好的值被确定，然后使用相同的设置适用于所有连续的电影中的数据系列，但请务必检查所选择的设置提供一个良好的适合的数据：好K ²地块和线性扩散的情节。
   4. 点击“保存设置并继续”。
   5. 点击“是”，显示所有的图形。
   6. 点击“载入图像系列”（见圈2 图1），然后单击“工作空间”。
   7. 选择“imgSerCrop”，然后单击“从工作区”。
   8. 进入成像系统采集设置。在框“像素大小”中输入的预测像素大小为在该图像栈获得的成像系统。为AQP3-EGFP 0.111使用。在方块“帧之间输入时间（s）”，0.1150用于水通道蛋白3-EGFP。
   9. 单击“选择感兴趣区”，输入“1”，点击确定，“使用整个图像”。
   10. 单击“做KICS分析”，然后单击是做“动过滤”。结果将作为图像自动打开。
   11. 最小化的设置窗口，尽量减少电池信息windo的w和最小化的光物理窗口。在动力学窗口，检查动力学曲线显示的数据，以具有负斜率意味着该数据点相关，并自由扩散可以假设的直线的线性拟合。记录中的扩散系数的特定的时间滞后和k ²的设置（这是没有必要留意拟合的标准偏差）。在K图²中的数据点必须围绕线被聚集在指定的时间滞后。
   12. 勾选框“另存开放数字图像”，然后单击“保存打开的数字图像”保存结果文件。保存在C一个新的文件夹：用户文档 AQP3diffusion。点击“清除当前数据”，然后继续下榨季的分析。

3，平均的计算扩散系数的计算方式来获取分析数据的概述

1. 从一个SPRE每个ROI输入个人扩散系数adsheet（一定要注意τ和K ²的值），使用作物如上面设定的名称。
2. 使用电子表格程序计算平均扩散系数和标准偏差。
3. 执行Kolmogorov-Smirnov检验或学生t检验用5％的显着性水平来评估统计学差异。细胞（例如处理与未处理）之间Quantitave可以用比较的。
4. 打开这是由分析软件产生用于每个作物和平均数据为每个条件的每个时间间隔的扩散曲线的电子表格的版本。产生一个新的平均扩散阴谋在提交论文或演讲。

Representative Results

为了获得合适的图像栈与KICS进行分析，不同的显微镜系统都可以使用。因此能够分析来自一个落射荧光显微镜，以及一个TIRF或旋转盘设置图像序列。该膜必须是平的，没有任何大的运动细胞器或移动囊泡/对象。本文提出AQP3的具有标记的EGFP在成象在一个旋转盘显微镜的焦点设定到质膜在9.2赫兹帧频活MDCK细胞一缩时图像序列。的焦点被设置在基底（底）质膜。该数据已出版的AJP细胞^13。

图2A示出的细胞的图像。比例尺为10毫米，例如投资回报率作物的矩形高亮显示。对于作物的选择它来裁剪在那里的膜是均匀的，平坦的，从而只有一个二维扩散被可视化的小区的周边是重要的。切尔升细胞器，囊泡和膜突起应当避免，这是为分析重要的是有时间经过期间没有漂移。作物，将被排除在分析的例子示于图2B和2C。移动囊泡向相关性（ 图2B），并在膜中的孔，在这种情况下，稍微移动（ 图2C）显然不应该被包括在分析中。同样重要的是，该ROI作物是足够大，以有足够的空间采样的分析（用于成像具有高NA物镜的32个像素的最小线性尺寸是合理的指导方针）。对于这个数据集60X（NA 1.40）的使用。

图3A显示了与KICS产生一种作物的扩散情节。此方法可用于发现具有标记EGFP（或其他荧光蛋白）的蛋白质的扩散系数，染料或量子点。在扩散曲线的曲线的斜率是单纯的扩散系数的负值。在这种情况下，AQP3-GFP的扩散系数为0.0104±0.0040微米² /秒。 图3B是一个计算扩散情节有太多的时间滞后，在这种情况下，分析是重做而是用更少的时间滞后，使得扩散情节是线性的。

图4A呈现出典型的K ²的情节。这是用于在选定的时间滞后的径向平均和LN转化的相关曲线。从这些K ²曲线的斜率被绘制随时间变化的滞后，其结果是扩散情节， 如图3A所示 。当检测第k ²图，它是重要的配合进行了评价。 图4B是AK ²积的量，可以得出结论，该作物是太小了，不能因为它应该分析的例子具有负斜率和线性衰减到地面的噪音。 图4C是AK ²剧情的需要，最大K可减少²值作为适合进行重新分析一个例子是不再好（截至当k比较大审判的增加残差²值）。在这种情况下，分析必须运行再次进入较低的最大^的 K ²值，在本例25。

图5示出一个平均扩散积平均超过10作物。扩散情节被发现在从分析的Excel文件，并且所有的扩散曲线现在可以被平均为来自同一实验的所有作物。在所得到的扩散曲线的小区的不同治疗方法可以在相同的数字相结合。平行的趋势线是相等的扩散系数和非平行的趋势线表明不​​平等的扩散。在该图中，AQP3-EGFP扩散系数的计算（从AJP电池¹³的数据）。

图1：屏幕截图的KICS分析窗口，在该窗口中的KICS分析完成。圆圈表示按在协议中各个步骤的按钮。 点击这里查看大图。

在MDCK细胞稳定表达AQP3-GFP和显示代表性作物的图2。纺纱表达GFP的细胞的磁盘映像（A）代表图像。所述图像获取关于一个旋转盘显微镜焦点靠近基底质膜。 （B）Repres entative作物，将其从分析中排除在KICS因为有移动的囊泡，其可以向扩散系数。 （C）一种作物，其中有一个在该膜的孔的一个例子，因此，这种作物被排除在分析之外。所有的比例尺是10微米。 点击这里查看大图。

图3。扩散曲线（A）代表扩散的情节中，所有点都接近拟合直线。这是一个很好的扩散阴谋，因为数据是线性的。 （B）的扩散阴谋的分析必须使用timelags的数量较少重做一个例子。 3highres.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。

图4的k例²图。的良好K ²情节，其中数据点被平均分布在拟合直线的任一侧（A） 的一个例子。 （ 二）AK ²地块的作物比最优规模较小的一个例子。在此，K ²情节，拟合直线的斜率为正时，它应该是否定的，因此，该作物是从分析中排除。 （C）该K ²的图显示了分析必须以较低的最大的K ²值，以便选择的K ²曲线的一部分重做分别的数据被平均分布在拟合直线的两侧。oad/51074/51074fig4highres.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。

图5。场均扩散情节。一个平均被平均超过10作物扩散的情节。

Discussion

本文介绍了如何应用KICS分析方法，从蛋白质标记荧光蛋白的显微镜图像确定扩散系数的详细一步一步的概述。该分析是独立探针的选择与标记密度非常广阔的动态范围，并且可以由此也可以应用到标记的量子点以及染料和荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白的蛋白质。

计算该蛋白质的有效扩散系数，有几个关键步骤，这已经得到了优化。至关重要的是仅在膜图像标记的蛋白质。如果有像移动小泡或细胞器对图像序列进行分析的另外的目的，这些将有助于所计算的扩散系数而导致过低或过高估计的扩散系数。

按照上面列出的步骤，为KICS GUI代码是用户友好的一个ND分析迅速。它包括几个平均步骤：包括圆形和平均的斜坡扩散曲线的斜率计算的时间滞后，这有利于快速生成的扩散系数的平均和统计显著的价值功能。因此，与计算从SPT实验，KICS扩散系数所需要的大量的分析是用户友好的，快速和可生物物理学无需专门培训来执行。

如果分析结果是负的扩散系数或水平扩散情节，故障排除包括作物的目视检查，看它是否满足这里所描述的所有要求。作物，太小可以产生非物理的负扩散系数，并且必须被丢弃。为了计算扩散系数，它往往可能使一个新的作物的其他地方，适用于分析或简单地增加作物的数据集大小如果可能的话。

这种技术可以应用于大多数数据集，但目前，KICS分析只能计算出的平均扩散系数，并且不能区分不同的蛋白质迁移模式或产生轨迹。使用KICS，扩散系数可以很容易地被提取和蛋白质的扩散可以比较例如处理和非处理的细胞之间或野生型和突变型蛋白，这将揭示，如果治疗基因突变的诱发中扩散的差异，因此可能在蛋白质 - 蛋白质和/或蛋白质 - 脂质相互作用。 AQP2由FRAP测定细胞膜扩散结果表明，以减少在加入毛喉素，一内cAMP激动剂^10，而且，在ER中，AQP2的突变版本引起肾性尿崩症，扩散不同于野生型AQP2 ^9。

虽然它是可以计算从单个粒子三维扩散系数ATA采用均方位移，步长分析或粒子图像相关光谱^2,11,12，这些分析方法可以计算要求，往往需要定制编写的计算机算法。这里提出的KICS协议的优点是，它是相对独立的标记密度和计算容易。因此，这种穿行KICS分析将是许多细胞生物学家，谁可以很容易地将其应用到自己感兴趣的膜蛋白是有用的。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	31600-083
FBS	Invitrogen	10082147
Penicilin	Sigma	13752
Kanamycin	Gibco	15160070
Streptomycin	Gibco	11860038
Phenol red free medium	Gibco	11880-028
DMSO	Sigma	D8418
HEPES	Gibco	15630056
Apparatus
Spinning Disk Microscope	Nikon	Ti Eclipse
EMCCD Camera	Andor	Ixon+