Summary
海洋蜗牛 阿普利西亚卡利福尼卡 已被广泛用作神经生物学模型，用于细胞和分子行为基础的研究。这里描述了一种探索 阿普利西亚 神经系统的方法，用于识别神经回路单神经元的电生理学和分子分析。
Abstract
神经生物学的一个主要挑战是了解控制特定行为的神经回路的分子基础。一旦确定特定的分子机制，就可以开发新的治疗策略，以治疗退行性疾病或神经系统老化引起的特定行为中的异常。海洋蜗牛 阿普利西亚卡利福尼卡 非常适合研究细胞和分子的行为基础，因为神经电路背后的特定行为可以很容易地确定，电路的各个组成部分可以很容易地操纵。 阿普利西亚的 这些优点导致了学习和记忆神经生物学的几个基本发现。在这里，我们描述了为个体神经元的电生理学和分子分析准备 的阿普利西亚 神经系统。简言之，从神经系统解剖的结膜暴露在蛋白酶中，以去除结膜护套，使神经元暴露，但保留神经元活动，就像在完整的动物中一样。这种制剂用于对单个或多个神经元进行电生理测量。重要的是，使用简单的方法进行记录后，神经元可以直接从神经中分离出来进行基因表达分析。这些协议用于同时进行L7和R15神经元的电生理记录，研究它们对乙酰胆碱的反应，以及在分离的单L7、L11、R15和 阿普利西亚R2神经元中对CREB1基因的量化表达。
Introduction
人脑极其复杂，有近1000亿个神经元和数万亿个突触连接。几乎有同样数量的非神经细胞与神经元相互作用，并调节其在大脑中的功能。神经元被组织成调节特定行为的电路。尽管我们对大脑功能和神经回路的理解有所进步，但对于控制特定行为的电路组件的身份却知之甚少。了解电路中各种成分的身份将大大促进我们对细胞和分子行为基础的理解，并有助于制定神经精神病的新治疗策略。
海洋蜗牛阿普利西亚卡利福尼卡一直是确定神经元电路的基础特定行为1-14的工作马。阿普利西亚神经系统包含大约20，000个神经元，这些神经元被组织成9个不同的神经质。Aplysia的神经元很大，可以根据它们的大小、电特性和在神经中的位置轻松识别。阿普利西亚有丰富的行为，可以研究。研究良好的行为之一是刺退出反射 （GWR）。这种反射的中心部分位于腹部结节。已绘制 GWR 电路的组件，并确定各种组件的贡献。重要的是，GWR电路经历关联和非关联学习5，6，15-19。数十年来对这种反射的研究也发现了几个信号通路，这些信号通路在学习和记忆20-24中起着关键作用。
几种不同的 阿普利西亚 制剂用于研究记忆存储的细胞和分子基础。其中包括完整的动物2，3，半完整的准备1，7，13，14，16 和重建神经电路的主要组成部分25-29。这里描述了为探索 阿普利西亚 神经元电路的电生理学和分子分析而减少的准备。研究了以下四个已识别的神经元。R15，一个爆裂的神经元，L7和L11，两个不同的运动神经元和R2，一个胆碱神经元被研究。R2是无脊椎动物神经系统中描述的最大神经元。简言之，该方法涉及结节蛋白酶治疗、药理治疗前后的电生理测量以及单个神经元的分离，用于基因表达的定量分析。这种方法使我们能够将分子分析与多个神经元同时记录相结合。这种方法通过配对细胞内记录成功地用于研究R15和L7神经元对乙酰胆碱（Ach）的反应。经过电子生理测量，R15和L7以及L11和R2等其他已识别的神经元被分离出来，用于定量聚合酶链反应（qPCR）对CREB1表达的分析，CREB1是记忆存储的重要转录因子。
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Protocol
1. 准备腹腔甘利亚，电生理测量，和隔离单一识别神经元从阿普利西亚加州的腹部刚利翁
- 在实验室水族馆中保持 阿普利西亚 ，在 12：12 光下在 16 °C 处循环人工海水 （ASW）：黑暗条件。
- 腹部结肠分离。
- 通过注射380毫米MGCl2 溶液5-10分钟（相当于动物体重的30-35%）麻醉动物。
- 根据腹部在中枢神经系统中的位置24，28识别腹部结肠。
- 通过手术切除黑帮，并立即储存在人工海水中，包括450立方米纳克、10米KCl、10米卡Cl2、55毫米MMMcl 2、2.5m NaHCO3和10m HEPES（pH 7.4）。
- 蛋白酶治疗。
- 在上面描述的 ASW 中稀释 0.1% 蛋白酶 （脱脂） 的培养皿中，在 34 °C ±0.5 处孵化腹部结节 30 分钟。
注意：使用的蛋白酶数量需要随着动物的年龄和体重而标准化。一般来说，年龄较大和较大的动物需要更多的蛋白酶。
- 在上面描述的 ASW 中稀释 0.1% 蛋白酶 （脱脂） 的培养皿中，在 34 °C ±0.5 处孵化腹部结节 30 分钟。
- 去除帮派护套。
- 酶治疗后，将结膜固定到细胞室的 Sylgard 硅胶底座（+1 厘米;卷 = 0.3 毫升），并在室温下（18 °C ±2）与 ASW（流速：150μl/min）一起灌注。
注意：为了提高已识别神经元的可见性，将结核放在聚碳酸酯玻璃缸（图1）的顶部（直径+2毫米修改后的细胞室），使用双目立体显微镜，可轻松从底部亮起，放大20倍和40倍。 - 使用钳子和微剪刀小心地从结石中取出护套。
- 酶治疗后，将结膜固定到细胞室的 Sylgard 硅胶底座（+1 厘米;卷 = 0.3 毫升），并在室温下（18 °C ±2）与 ASW（流速：150μl/min）一起灌注。
- 同时从两个神经元进行电子生理学记录。
- 识别感兴趣的神经元。
- 用一个具有电阻10-15 MΩ、充满3M KCl溶液的单细胞内锐利微电极来填充神经元。
- 使用细胞内记录系统记录神经元活动（10 kHz 带通）。
- 使用电子生理学软件（如轴电图）处理记录数据。
注：人们可以很容易地从多个神经元进行记录。神经元 L7、L11 或 R15 和 R2 很容易根据它们的位置进行识别。同时从两个L7和R15神经元（图2）进行记录需要两个放大器和两个微脉动器。
- 药物应用。
- 通过轻轻的管道或直接注射到神经元中，将选择的药物应用到细胞室中。
- 进行电生理测量。
注：根据实验目标，可以测量神经元的不同电生理参数，如药物应用前、应用期间和之后膜电位 （MP） 或行动潜力 （AP） 的变化。
- 单个神经元的隔离。
- 在电生理实验结束时，停止ASW的灌注，用100%乙醇清洗结膜。 接触乙醇会使神经元石化，并使用细钳，在不损害神经元的情况下，很容易去除单个神经元。
- 在立体显微镜下取出单个神经元，并转移到含有冰冷 500 μl RNA 提取试剂的小 Eppendorf 管中。孤立的单个神经元可存储在 -80 °C 的 RNA 提取试剂中，以便将来进行分析。
2. 通过定量实时 PCR （qPCR） 与单一神经元和基因表达分析的 RNA 隔离
- 尽量减少RNA退化的预防措施：
核糖核酸（RNases）降解RNA，是非常稳定和活性酶。在处理RNA时采取以下步骤。- 用 RNase 停用剂清洁工作区域和仪器。
- 在处理RNA时随时戴手套，并经常更换手套。
- 仅使用无RNA的RNA。
- 将RNA总数与单个神经元分离：
- RNA隔离的标准三佐尔协议可用于将RNA与单个神经元分离。简单地将 20% v/v 的氯仿添加到 Trizol 中，通过短暂的漩涡很好地混合。
- 将管子放在旋转器上 10 分钟，在 4 °C。 在 12，000 x g 下旋转三氯仿混合，在 4 °C 下旋转 15 分钟。
- 收集水相并转移到新鲜管。
- 加入醋酸钠溶液（pH 5.5），最终浓度为0.3M、100 ng/ml的共生糖蓝和2.5卷100%乙醇沉淀RNA。
- 将样品混合好，在-80°C的夜间孵化。
- 在 4 °C 下以 12，000 x g 旋转样品 20 分钟，在管子底部可以看到一个小的蓝色颗粒。
- 取出超自然剂，在 4 °C 下用 850 μl 的 75% 冰冷乙醇在 12，000 x g 下洗净颗粒 10 分钟。
- 小心地取出超细剂，将RNA颗粒空气干燥7-10分钟，最大。
注意：确保RNA不会像过度干燥那样长时间干燥-干燥RNA颗粒会使溶解变得非常困难。 - 干燥后，将RNA颗粒在10微升的RNA酶无水中补充，并确定RNA浓度。
注：使用光谱仪确定RNA浓度。不立即使用时，将RNA存储在-80°C。
- 单个神经元的 aRNA 合成：
- 使用市售的线性RNA放大系统放大RNA（根据实验目标进行一到两轮）。
注：来自单个神经元的RNA总数在~10-60 ng之间。第一轮放大的预期收益率为+100-300 ng，第二轮放大为+0.8-1.5微克RNA。
- 使用市售的线性RNA放大系统放大RNA（根据实验目标进行一到两轮）。
- RNA 的反向转录：
- 要从 aRNA 生成 cDNA，请在 20μl 的反向转录反应中使用 1.0μg 的 aRNA。为此目的，有几个套件可在商业上提供。
注：cDNA 是根据制造商的协议，使用热循环器上的以下设置合成的。
5 分钟，25°C
30 分钟，42 °C
5 分钟，85 °C
保持在4°C - 反向转录步骤后，将 cDNA 存储在 -20 °C 以进行长期存储。
- 要从 aRNA 生成 cDNA，请在 20μl 的反向转录反应中使用 1.0μg 的 aRNA。为此目的，有几个套件可在商业上提供。
- 引言设计和标准化：
有几个优秀的软件程序是免费的，用于设计实时放大的引物。- 选择 18-24 mer 寡核苷酸，生产 70-110 bp 放大器，并使用商业来源合成引物。
注：应为每个感兴趣的基因设计两到三个引言对。每个引号集都需要通过 qPCR 进行标准化。用于基因CREB1（图4）的前向和反向引数对如下：
引号集 1
前进： 5'-塔加特加-3'
反向： 5 '- 阿卡格加加特加加 - 3'
引号集 2
前进： 5 '- 阿加特加特加加加 - 3'
反向： 5 '- 加卡卡加加塔特加卡 - 3' - 要选择用于下游分析的最佳引物，请监视 ct 值和 qPCR 中放大曲线的形状。
注：在 PCR 指数阶段，在 40 轮放大中给出 Ct（周期阈值）值在 10-35 之间的引物和平滑曲线，然后是平滑的高原，是基因表达分析的最佳选择。
- 选择 18-24 mer 寡核苷酸，生产 70-110 bp 放大器，并使用商业来源合成引物。
- 定量实时 PCR （qPCR）：
注意：使用与 qPCR 机器兼容的适当管子或板。- 用无核水将cDNA稀释至5倍。
- 到稀释的 cDNA 的 2μl，加入 8 μl 的 qPCR 主混合，其中包含 2 μl 的 H2O、5 μl 的 2x SYBR 绿色主混合和 1.0 μl 的 10 μM（每个）前进和反向引物。
- 关闭管子，并在管道 cDNA 和主混合后密封板。通过轻轻敲击混合内容，在 1，500 rpm 下旋转 30 秒。
- 继续设置 qPCR 机器。
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Representative Results
本研究中使用的动物重量在100-200克之间。按照上述协议，我们对从2-5克到200-300克的动物分离的腹部神经元进行了电生理测量和分子分析。
蛋白酶治疗的标准化对于成功测量神经元的神经元具有重要意义。最初，使用多个蛋白酶（假发）浓度和持续时间，R15神经元的爆裂作用潜力记录为26，31。这些测量被比较成从完整的帮派中直接（没有蛋白酶治疗）记录。在随后的实验中，使用了蛋白酶（0.1%的蛋白酶，见第1.3步）的浓度，这种蛋白酶产生与从没有蛋白酶的裸露结条中获得的爆发潜力相当的爆裂电位。
使用所述协议，记录了响应 Ach 接触 R15（胆碱神经元和 L7）的动作潜力 （AP），这是一种对 Ach 没有反应的运动神经元。不出所料，同时进行的电生理记录显示，Ach在R15中诱发去极化，而L7的发射没有变化。 图2 显示乙酰胆碱（Ach）直接进入细胞室的应用。1 M Ach（体积 0.3 μl）使用微皮带直接应用于腔室，以便在腔室内获得最终 1 mM 浓度。
Ach 被灌注从浴缸中冲走，并再次从 R15 神经元中记录下来。 图3 显示波形，表明 Ach 效应是可逆的。显示 AP 在控制、去极化和洗涤后所控制的参数的分析。在去极化振幅降低期间，AP 的持续时间显著增加。
在进行电子生理测量后，R15 和 L7 神经元被分离，RNA 为 qPCR 分析做好准备。使用来自安比恩的邮件和II aRNA放大套件的线性T7 RNA聚合酶驱动转录用于放大单个神经元的RNA。为了进行比较，还研究了成人（6-9个月大）和幼年动物（1-2个月大）的神经元R2和L11以及整个腹部神经结节。qPCR 放大在以下条件下在 7900HT 快速实时 PCR 系统中进行：95 °C 10 分钟，然后是 40 个周期的 95 °C 15 秒、60 °C 的 1 分钟。实验中有四个生物复制品。每个生物复制品在 qPCR 设置中有四个技术复制。平均计算了四个复制品的 Ct 值，计算了 1/Ct，以在每个样本中找到 CREB1 的绝对表达水平（图 4）。从 qPCR 测量中获得的 Ct 值监测了年轻和成人 Aplysia 神经质中 CREB1 基因的绝对表达水平，并在四个已识别的单个神经元中进行了监测。
开始mRNA浓度是相同的，在年轻和成人腹部结节。相同的前向和反向CREB1引信集用于所有qPCR，无论是在研究使用帮派和单一神经元。Ct 值在年轻和成人腹部帮派之间非常相似。同样，Ct 值在单个神经元的情况下进行测量，在单个神经元中，开始的总 mRNA 浓度较低，两轮放大为 cDNA 合成产生了大量的 RNA。CREB1 放大的 Ct 值表明，R15 和 L7 神经元中的 CREB1 表达是可比的，而 R2 和 L11 与 L7 或 R15（学生的 T 测试，p<0.05） （图 4）相比，在表达上存在显著差异。
图1。显微镜阶段和灌注系统为帮派电生理学。灌注系统和舞台是使用Plexiglas制作的，是透明的。此设置安装在金属块上（未显示）以保持位置。金属块的设计使样品可以从底部亮起。显示了从R15神经元记录的样本电子生理爆裂模式。
图2。同时记录从L7和R15神经元的腹部神经结节。（A） 腹部神经质的卡通显示 L7 和 R15 神经元的位置 （修改自 Kandel 2001， 经 AAAS 许可转载）。还显示了R2和L11在腹部帮派中的位置。（B） L7 和 R15 的代表细胞内录音。箭头表示 Ach 应用程序的时间。人们可以继续这些测量8-10小时。
图3。Ach 诱发 R15 的动作潜力 （AP） 变化。AP 波形在 Ach 暴露之前、期间和之后进行了分析。显示具有代表性的波形。毫秒：毫秒，mV：毫伏。
图4。qPCR分析CREB1在腹部神经质和单一识别神经元的表达。（A） 绝对量化CREB1成绩单在阿普利西亚的年轻和成人腹部帮派。使用方法中描述的标准三色协议隔离了总RNA。1μg 的总 RNA 用于合成 cDNA，然后使用 CREB1 引物进行实时 PCR 放大。（B） 在老阿普利西亚已识别的单神经元中对 CREB1 成绩单进行绝对量化。在 cDNA 合成之前，总 RNA 进行了两轮体外放大。1μg 的 aRNA 用于合成 cDNA，然后使用 CREB1 引物进行实时 PCR 放大。
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Discussion
神经元R15参与调节心血管，消化，呼吸和生殖系统30。AP 的定期有节奏的爆裂活动是 R15 的一个功能。如结果部分所示，R15 和 L7 的配对记录显示，神经质制备保留了 R15 神经元的活性。R15和L7神经元对阿赫反应恰当。这种神经质制备可维持8-10小时，电生理活动可持续监测。因此，我们可以长期研究短暂神经递质暴露（局部暴露在特定神经元或洗澡中）的电生理效应。此外，人们还可以研究接触多种神经递质（同时或串联）对同一神经元对自身或跟随神经元或两者的影响。
qPCR基因表达测量示例见图 4。由于单个神经元的RNA含量较低，体外放大对于获得足够数量的RNA以量化多个基因的表达是必要的。商业套件可用于体外转录过程。CREB1成绩单的放大直接由获得标准化荧光信号（Ct-方法31）所需的周期数进行量化。单个神经元的放大RNA足以确定大量基因的基因表达变化使用微阵雷32和整个转录组由RNASeq分析33。
这种技术的一个局限性是，这种制备可能无法保留腹部神经质的所有突触连接。几个神经元形成突触与神经元在其他帮派和在神经质准备这些长途连接将被错过。然而，这里描述的方法可以很容易地修改，包括整个CNS或可以很容易地集成到半精装准备13，14，16， 描述研究细胞和电生理变化的刺和虹吸提取反射。
基因组学技术的最新进展现在使我们能够深入了解编码和非编码RNA34表达的动态。此处描述的减少准备是研究基因表达与电生理测量相结合的时间变化的理想之选。例如，可以应用药理学制剂，测量它们对单个神经元或多个神经元电特性的影响，这些神经元是同一神经回路的一部分，并在不同时间分离单个神经元以进行RNA隔离。单个神经元的操纵（如电刺激或接触药理制剂）对整个已识别电路的影响，可以研究单个神经元中特定基因表达的变化水平。因此，这种方法有助于电生理学和基因组方法学的成功整合，以研究 阿普利西亚的神经电路。
这种方法可以很容易地扩展到其他无脊椎动物模型的研究，如神经支部软体动物三叶草，池塘蜗牛莱姆奈亚，和陆地蜗牛螺旋，其神经系统包含几个识别神经元35-57。这些模型还广泛应用于逃生游泳、磁场方向、突触形成、学习和记忆存储等行为的神经控制研究。我们描述的方法是基因组学分析与单细胞水平神经元活动的生理测量的简单结合。从这些研究中可以更深入地了解神经控制行为的分子和生理基础。
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Disclosures
作者没有任何相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们衷心感谢白厅基金会为斯克里普斯研究所开展这项工作提供的资金支持和启动资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aplysia | National Aplysia Resource Facility, University of Miami | ||
| NaCl | SIGMA | S 3014-1KG | |
| KCl | SIGMA | P 9333-500G | |
| CaCl2•2H2O | SIGMA | C5080- 500G | |
| MgCl2•6H2O | Fisher Scientific | BP 214-501 | |
| NaHCO4 | SIGMA | S 6297-250G | |
| HEPES | SIGMA | H 3375-500G | |
| Protease | GIBCO | 17105-042 | |
| Trizol | Ambion | 15596-026 | |
| Chloroform | MP Biomedicals | 2194002 | |
| 100% Ethanol | ACROS | 64-17-5 | |
| GlycoBlue | Ambion | AM9515 | |
| 3 M NaOAc, pH 5.5 | Ambion | AM9740 | |
| Nuclease free water | Ambion | AM9737 | |
| MessageAmp II aRNA Amplification Kit | Ambion | AM1751 | |
| qScript cDNA SuperMix | Quanta Biosciences | 95048-100 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Stainless Steel Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 or | |
| 26002-20 | |||
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | Veriti Thermal Cycler | |
| 5430R Centrifuge | Eppendorf | 5430R Centrifuge | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | 7900HT Fast Real-Time PCR | |
| Amplifier | BRAMP-01R | NPI Electronics | |
| Digidata Converter | Instrutech ITC-18 | HEKA ELEKTRONIK | |
| Micro Manipulator | Patch Star | Scientifica |
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