Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

أأليسيا إعداد Ganglia للتحليلات الكهربية والجزيئية للخلايا العصبية المفردة

Published: January 13, 2014 doi: 10.3791/51075
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute, Florida

Summary

الحلزون البحري Aplysia californica وقد استخدمت على نطاق واسع كنموذج البيولوجيا العصبية للدراسات على أساس الخلوية والجزيئية للسلوك. هنا يتم وصف منهجية لاستكشاف الجهاز العصبي من Aplysia للتحليلات الكهربية والجزيئية من الخلايا العصبية واحدة من الدوائر العصبية المحددة.

Abstract

يتمثل التحدي الرئيسي في علم الأحياء العصبية في فهم الأسس الجزيئية للدوائر العصبية التي تحكم سلوكا محددا. بمجرد تحديد الآليات الجزيئية المحددة ، يمكن تطوير استراتيجيات علاجية جديدة لعلاج التشوهات في سلوكيات محددة تسببها الأمراض التنكسية أو شيخوخة الجهاز العصبي. الحلزون البحري Aplysia californica مناسب تماما للتحقيقات في الأساس الخلوي والجزيئي للسلوك لأن الدوائر العصبية الكامنة وراء سلوك معين يمكن تحديدها بسهولة ويمكن التلاعب بسهولة المكونات الفردية للدوائر. وقد أدت هذه المزايا من Aplysia إلى العديد من الاكتشافات الأساسية لعلم الأعصاب من التعلم والذاكرة. هنا نحن نصف إعداد الجهاز العصبي Aplysia للتحليلات الكهربية والجزيئية للخلايا العصبية الفردية. لفترة وجيزة، يتعرض العقدة تشريح من الجهاز العصبي إلى بروتياز لإزالة غمد العقدة بحيث تتعرض الخلايا العصبية ولكن الاحتفاظ النشاط العصبي كما هو الحال في الحيوان سليمة. يستخدم هذا الإعداد لإجراء القياسات الكهربية للخلايا العصبية واحدة أو متعددة. الأهم من ذلك، بعد التسجيل باستخدام منهجية بسيطة، يمكن عزل الخلايا العصبية مباشرة من العقدة لتحليل التعبير الجيني. واستخدمت هذه البروتوكولات لتنفيذ التسجيلات الكهربية في وقت واحد من الخلايا العصبية L7 و R15, دراسة استجابتها للأستيل والتعبير الكمية من الجينات CREB1 في L7 واحدة معزولة, L11, R15, و R2 الخلايا العصبية من Aplysia.

Introduction

الدماغ البشري معقد بشكل غير عادي مع ما يقرب من 100 مليار خلية عصبية وتريليونات من الاتصالات متشابك. هناك ما يقرب من عدد متساو من الخلايا غير العصبية التي تتفاعل مع الخلايا العصبية وتنظيم وظيفتها في الدماغ. يتم تنظيم الخلايا العصبية في الدوائر التي تنظم سلوكيات محددة. على الرغم من التقدم في فهمنا لوظائف الدماغ والدوائر العصبية ، لا يعرف سوى القليل عن هوية مكونات الدوائر التي تتحكم في سلوك معين. معرفة هويات مكونات مختلفة من الدوائر سوف تسهل كثيرا فهمنا للأساس الخلوي والجزيئي على حد سواء من السلوك والمساعدة في تطوير استراتيجيات علاجية جديدة للاضطرابات العصبية والنفسية.

الحلزون البحري Aplysia californica كان العمود الفقري لتحديد الدوائر العصبية الكامنة وراء سلوكيات محددة1-14. يحتوي الجهاز العصبي Aplysia على ما يقرب من 20،000 خلية عصبية يتم تنظيمها في 9 ganglia مختلفة. الخلايا العصبية من Aplysia كبيرة ويمكن التعرف عليها بسهولة على أساس حجمها، والخصائص الكهربائية، والموقف في العقدة. Aplysia لديها ذخيرة غنية من السلوكيات التي يمكن دراستها. أحد السلوكيات المدروسة جيدا هو رد الفعل الخياشيم الانسحابي (GWR). وتقع المكونات المركزية لهذا رد الفعل في العقد البطن. وقد تم رسم خرائط لمكونات دوائر الموارد العالمية وتحديد مساهمات مختلف المكونات. الأهم من ذلك، تخضع دوائر GWR لتعلم ترابطي وغير مرتبط5,6,15-19. عقود من الدراسة على هذا المنعكس كما حددت العديد من مسارات الإشارات التي لها دور رئيسي في التعلم والذاكرة20-24.

تم استخدام العديد من الاستعدادات المختلفة من Aplysia لدراسة الأساس الخلوي والجزيئي لتخزين الذاكرة. وتشمل هذه الحيوان سليمة2,3,إعداد شبهسليمة 1,7,13,14,16 وإعادة تشكيل المكونات الرئيسية للدوائر العصبية25-29. ويرد هنا إعداد مخفض لاستكشاف العقدة Aplysia للتحليلات الكهربية والجزيئية من الدوائر العصبية المحددة. تمت دراسة الخلايا العصبية الأربعة التالية المحددة. R15, انفجار الخلايا العصبية, L7 و L11, تمت دراسة اثنين من الخلايا العصبية الحركية المختلفة وR2, الخلايا العصبية الكوليني. R2 هو أكبر خلية عصبية وصفها في الجهاز العصبي اللافقاريات. باختصار، تتضمن هذه المنهجية علاج البروتيز للجانجليا، والقياسات الكهربية قبل وبعد العلاجات الدوائية، وعزل الخلايا العصبية المفردة للتحليل الكمي للتعبير الجيني. هذه المنهجية تمكننا من الجمع بين التحليلات الجزيئية مع تسجيل متزامن من خلايا عصبية متعددة. وقد استخدمت هذه المنهجية بنجاح لدراسة استجابات الخلايا العصبية R15 و L7 إلى أستيل (أش) عن طريق تسجيلات داخل الخلايا المقترنة. بعد القياسات الكهربية R15 و L7 وغيرها من الخلايا العصبية المحددة مثل L11 و R2 تم عزلها لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) للتعبير عن CREB1 ، وهو عامل نسخ مهم لتخزين الذاكرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد العقد البطني، القياسات الكهربية، وعزل الخلايا العصبية المحددة واحدة من العقدة البطنية من كاليفورنيكا Aplysia

  1. الحفاظ على Aplysia في الحوض المختبر مع تعميم مياه البحر الاصطناعية (ASW) في 16 درجة مئوية تحت 12:12 ضوء: ظروف مظلمة.
  2. عزل العقدة البطنية.
    1. تخدير الحيوانات عن طريق حقن 380 mM MgCl2 حل لمدة 5-10 دقيقة (أي ما يعادل 30-35٪ من وزن جسم الحيوان).
    2. تحديد العقدة البطنية بناء على موقعها في الجهاز العصبي المركزي24,28.
    3. إزالة ganglia عن طريق العملية الجراحية وتخزينها على الفور في مياه البحر الاصطناعية التي تتكون من 450 mM NaCl، 10 MM KCl، 10 mM CaCl2،55 mM MgCl2،2.5 mM NaHCO3،و 10 M HEPES (pH 7.4).
  3. علاج بروتياز.
    1. احتضان العقدة البطن لمدة 30 دقيقة في 34 درجة مئوية±0.5 في طبق بيتري مع 0.1٪ بروتياز (ديسباس) المخفف في ASW المذكورة أعلاه.
      ملاحظة: كمية البروتياز المستخدمة تحتاج إلى أن تكون موحدة مع عمر ووزن الحيوانات. بشكل عام ، فإن الحيوانات الأكبر سنا والأكبر تتطلب المزيد من البروتيز.
  4. إزالة غمد الجانجليا.
    1. بعد معالجة الإنزيم، قم بإلصاق العقدة بقاعدة سيلغارد السيليكون في غرفة الخلية (Ø= 1 سم؛ vol. = 0.3 مل) والتشويش مع ASW (معدل التدفق: 150 ميكرولتر/دقيقة) في درجة حرارة الغرفة (18 درجة مئوية±2).
      ملاحظة: من أجل زيادة رؤية الخلايا العصبية المحددة، ضع العقدة على الجزء العلوي من اسطوانة زجاجية متعددة الكربونات(الشكل 1)(قطر Ø = 2 مم غرفة الخلية المعدلة) التي يمكن أن تضيء بسهولة من أسفل باستخدام مجسم مناظير مع تكبير 20X و 40X.
    2. إزالة بعناية غمد من العقدة باستخدام ملقط وmicroscisors.
  5. تسجيل كهربي في وقت واحد من اثنين من الخلايا العصبية.
    1. تحديد الخلايا العصبية ذات الاهتمام.
    2. إمبالا الخلايا العصبية مع microelectrode حادة واحدة داخل الخلايا مع المقاومة 10-15 MΩ مليئة 3 M KCl الحل.
    3. سجل نشاط الخلايا العصبية (تمرير النطاق 10 كيلوهرتز) باستخدام نظام تسجيل داخل الخلايا.
    4. معالجة بيانات التسجيل باستخدام برامج الفيزيولوجيا الكهربية مثل أكسوغراف.
      ملاحظة: يمكن للمرء بسهولة تنفيذ تسجيل من الخلايا العصبية متعددة. الخلايا العصبية L7, L11 أو R15 و R2 يتم التعرف بسهولة على أساس موقفهم. مطلوب اثنين من مكبرات الصوت واثنين من micromanipulators لتسجيل في وقت واحد من اثنين من الخلايا العصبية L7 و R15 (الشكل 2).
  6. تطبيق المخدرات.
    1. تطبيق المخدرات من اختيار في غرفة الخلية عن طريق الأنابيب لطيف أو حقن مباشرة في الخلايا العصبية.
    2. إجراء القياسات الكهربية.
      ملاحظة: اعتمادا على الهدف التجريبي، يمكن للمرء قياس المعلمات الكهربية المختلفة للخلايا العصبية مثل التغيرات في إمكانات الأغشية (MP) أو إمكانات العمل (AP) قبل وأثناء وبعد تطبيق الدواء.
  7. عزل الخلايا العصبية واحدة.
    1. في ختام التجارب الكهربية، وقف التغلغل ASW وغسل العقدة مع الإيثانول 100٪.  التعرض للإيثانول سوف تحجر الخلايا العصبية و, باستخدام ملقط غرامة, تجعل من السهل لإزالة الخلايا العصبية الفردية دون إتلاف الخلايا العصبية الأخرى من العقدة.
    2. إزالة الخلايا العصبية واحدة تحت مجسم ونقل إلى أنبوب Eppendorf الصغيرة التي تحتوي على الجليد الباردة 500 ميكرولتر الحمض النووي الريبي استخراج كاشف. يمكن تخزين الخلايا العصبية المعزولة في كاشف استخراج الحمض النووي الريبي عند -80 درجة مئوية للتحليل المستقبلي.

2. عزل الحمض النووي الريبي من الخلايا العصبية واحدة وتحليل التعبير الجيني من قبل PCR الوقت الحقيقي الكمي (qPCR)

  1. الاحتياطات اللازمة لتقليل تدهور الحمض النووي الريبي:
    ريبونوكلياس (RNases) تتحلل الحمض النووي الريبي وهي إنزيمات مستقرة ونشطة جدا. اتخاذ الخطوات التالية أثناء معالجة RNAs.
    1. تنظيف منطقة العمل والأدوات مع RNase تعطيل وكلاء.
    2. ارتداء قفازات في جميع الأوقات أثناء التعامل مع الجيش الملكي النيبالي وتغيير القفازات في كثير من الأحيان.
    3. استخدم فقط البلاستيك الحر RNase للتعامل مع RNAs.
  2. عزل إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا العصبية واحدة:
    1. يمكن استخدام بروتوكول تريزول القياسي لعزل الحمض النووي الريبي لعزل الحمض النووي الريبي من الخلايا العصبية المفردة. إضافة لفترة وجيزة 20٪ v/v من الكلوروفورم إلى تريزول، مزيج جيدا عن طريق دوامة وجيزة.
    2. ضع الأنابيب على الدوار لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تدور مزيج تريزول-الكلوروفورم في 12،000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    3. جمع المرحلة المائية ونقل إلى أنبوب جديد.
    4. إضافة محلول خلات الصوديوم (pH 5.5) إلى تركيز نهائي من 0.3 M، 100 نانوغرام / مل من جليكوبلو coprecipitant، و 2.5 مجلدات من الإيثانول 100٪ لتسريع الحمض النووي الريبي.
    5. اخلطي العينات جيدا واحتضنيها عند -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    6. تدور العينات في 12000 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية ، وسوف بيليه زرقاء صغيرة تكون مرئية في الجزء السفلي من الأنبوب.
    7. إزالة supernatant وغسل بيليه مع 850 ميكرولتر من الإيثانول الجليد الباردة 75٪ في 12000 س ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    8. إزالة supernatant بعناية والهواء الجاف بيليه الجيش الملكي النيبالي لمدة 7-10 دقيقة، كحد أقصى.
      ملاحظة: تأكد من أن لا يترك الجيش الملكي النيبالي لفترة طويلة لتجف كما أكثر-تجفيف بيليه الجيش الملكي النيبالي يجعل التشحيم صعبة للغاية.
    9. مرة واحدة المجففة، resuspend بيليه الجيش الملكي النيبالي في 10 ميكرولتر من المياه الحرة RNAse وتحديد تركيز الحمض النووي الريبي.
      ملاحظة: تحديد تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مطياف. عند عدم استخدام على الفور، تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية.
  3. تخليق أرنا من الخلايا العصبية واحدة:
    1. تضخيم الحمض النووي الريبي (جولة أو جولتين اعتمادا على الهدف التجريبي) باستخدام نظام تضخيم الحمض النووي الريبي الخطي المتاح تجاريا.
      ملاحظة: تراوح إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا العصبية واحدة من ~ 10-60 نانوغرام. العائد المتوقع من الجولة الأولى من التضخيم هو ~ 100-300 نانوغرام والجولة الثانية من التضخيم هو ~ 0.8-1.5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي.
  4. النسخ العكسي من الحمض النووي الريبي:
    1. لتوليد cDNA من ARNA، استخدم 1.0 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي في 20 ميكرولتر من رد فعل النسخ العكسي. وتتوفر عدة مجموعات من اللوازم تجاريا لهذا الغرض.

      ملاحظة: تم تصنيعها cDNA وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة باستخدام الإعدادات التالية على دورة الحرارية.
      5 دقائق عند 25 درجة مئوية
      30 دقيقة عند 42 درجة مئوية
      5 دقائق عند 85 درجة مئوية
      اضغط على درجة حرارة 4 °C
    2. بعد خطوة النسخ العكسي، قم بتخزين cDNA عند -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
  5. تصميم التمهيدي وتوحيد:
    تتوفر العديد من البرامج الممتازة مجانا لتصميم التهيئة للتضخيم في الوقت الحقيقي.
    1. حدد 18-24 مير أوليغونوكليوتيدات التي تنتج 70-110 bp amplicons وتوليف التمهيديات باستخدام مصادر تجارية.
      ملاحظة: يجب تصميم أزواج التمهيدي اثنين إلى ثلاثة لكل جين من الفائدة. كل مجموعة التمهيدي يحتاج إلى توحيدها من قبل qPCR. أزواج التمهيدي الأمامية والعكسية التي تم استخدامها للجين CREB1 (الشكل 4) هي أدناه:

      مجموعة التمهيدي 1
      إلى الأمام: 5'-تاتكتغاكغاغاغاغا-3'
      عكس: 5'-ACCGTGAGAGTCAGTTGTAGA-3'
      مجموعة التمهيدي 2
      خط الهجوم: 5'-أغغااتغاتغاغاغا-3'

      عكس: 5'-GACACACAGAAGTATGCCAAA-3'
    2. لتحديد أفضل التمهيدي ليتم استخدامه لتحليلات المصب، مراقبة قيمة Ct وشكل منحنى التضخيم في qPCR.
      ملاحظة: تعد المبرمجينات التي تعطي قيم Ct (عتبة الدورة) بين 10-35 في التضخيم المستدير الأربعين والمنحنيات السلسة خلال المرحلة الأسية من PCR متبوعة بهضبة ناعمة مثالية لتحليلات التعبير الجيني.
  6. الكمى في الوقت الحقيقي PCR (qPCR):
    ملاحظة: استخدم الأنابيب المناسبة أو اللوحات المتوافقة مع جهاز qPCR.
    1. تمييع cDNA إلى 5x مع ماء خال من النيوكليز.
    2. إلى 2 ميكرولتر من cDNA المخفف، أضف 8 ميكرولتر من مزيج رئيسي qPCR يحتوي على 2 ميكرولتر من H2O، و 5 ميكرولتر من مزيج رئيسي أخضر 2x SYBR، و 1.0 ميكرولتر من 10 ميكرومتر (لكل منهما) إلى الأمام وعكس التمهيدي.
    3. إغلاق الأنابيب وختم لوحة بعد الأنابيب cDNA ومزيج رئيسي. امزج المحتويات عن طريق النقر اللطيف والغزل عند 1500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
    4. انتقل إلى إعداد جهاز qPCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تراوحت أوزان الحيوانات التي استخدمت في هذه الدراسة من 100-200 غرام. بعد البروتوكولات الموصوفة، أجرينا قياسات كهربية وتحليل جزيئي للخلايا العصبية من العقد البطنية المعزولة عن الحيوانات التي تتراوح بين 2-5 غرام إلى 200-300 غرام.

توحيد العلاج بروتياز مهم للقياسات الكهربية الناجحة من الخلايا العصبية في العقدة. في البداية، تم استخدام تركيزات متعددة protease (Dispase) والمدد وانفجار إمكانات العمل من الخلايا العصبية R15 سجلت26،31. تمت مقارنة هذه القياسات إلى تسجيل مباشر (دون علاج البروتيز) من العقدة سليمة. تم استخدام تركيز البروتيز (0.1٪ بروتياز، انظر الخطوة 1.3) التي أنتجت إمكانات انفجار مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها من العقدة المكشوفة دون البروتيز في التجارب اللاحقة.

باستخدام البروتوكول الموصوف ، تم تسجيل إمكانات العمل (AP) ردا على تعرض Ach ل R15 ، وهي خلية عصبية choية وL7 ، وهي خلية عصبية حركية لا تستجيب ل Ach. كما هو متوقع، تظهر التسجيلات الكهربية المتزامنة أن أش تحفز على إزالة الاستقطاب في R15 في حين لم يكن هناك أي تغيير في إطلاق النار من L7. الشكل 2 يظهر تطبيق أستيل (أش) مباشرة في غرفة الخلية. 1 M Ach (المجلد 0.3 ميكرولتر) تم تطبيقه مباشرة في الغرفة باستخدام ميكروبايت من أجل الحصول على تركيز نهائي 1 mM داخل الغرفة.

تم غسلها أش قبالة من الحمام عن طريق التخبط وسجلت مرة أخرى من الخلايا العصبية R15. يظهر الشكل 3 أشكالا موجية تشير إلى أن تأثير Ach قابل للعكس. تحليل المعلمات AP في السيطرة، أثناء إزالة الاستقطاب وبعد غسل يظهر. خلال خفض السعة إزالة الاستقطاب ومدة AP زادت بشكل ملحوظ.

بعد القياسات الكهربية، تم عزل الخلايا العصبية R15 و L7 وتم إعداد الرنانات لتحليلات qPCR. تم استخدام نسخ خطي T7 RNA Polymerase - مدفوع باستخدام MessageAmp II ARNA Amplification Kit من أمبيون لتضخيم الحمض النووي الريبي من الخلايا العصبية المفردة. للمقارنة، تم أيضا دراسة الخلايا العصبية المحددة R2 و L11 وعصابة البطن بأكملها من البالغين (6-9 أشهر من العمر) والحيوانات الصغيرة (1-2 أشهر من العمر). تم إجراء تضخيم qPCR في نظام PCR سريع في الوقت الحقيقي 7900HT في ظل الظروف التالية: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، تليها 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. كان هناك أربع نسخ بيولوجية في التجربة. وكان لكل تكرار بيولوجي أربع نسخ تقنية متماثلة في إعداد qPCR. قيم Ct من أربع نسخ متماثلة تم متوسطها وتم حساب 1/Ct للعثور على مستوى التعبير المطلق ل CREB1 في كل عينة(الشكل 4). تم رصد تقدير لمستويات التعبير المطلق لجين CREB1 في العقدة Aplysia الشباب والكبار ، وفي أربع خلايا عصبية واحدة محددة من خلال قيمة Ct التي تم الحصول عليها من قياسات qPCR.

وكان تركيز ميرنا البداية هو نفسه في كل من العقد البطنية الشباب والكبار. تم استخدام نفس مجموعة التمهيدي CREB1 إلى الأمام والعكس في جميع qPCRs ، سواء في الدراسات التي تستخدم ganglia والخلايا العصبية الفردية. قيم Ct متشابهة جدا بين العقد البطنية للصغار والبالغين. وبالمثل، تم قياس قيم Ct في حالة الخلايا العصبية المفردة حيث كانت تركيزات الحمض النووي الريبي الكلية منخفضة وأسفرت جولتان من التضخيم عن كمية لا بأس بها من الحمض النووي الريبي لتركيب cDNA. القيم Ct من التضخيم CREB1 اقترح أن التعبير CREB1 في الخلايا العصبية R15 و L7 قابلة للمقارنة في حين أظهرت R2 و L11 اختلافات كبيرة في التعبير بالمقارنة مع L7 أو R15 (اختبار T الطالب، p<0.05) (الشكل 4).

Figure 1
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 مرحلة المجهر ونظام التشوه لعلم الفيزيولوجيا الكهربية العقدية. تم إجراء نظام Perfusion والمرحلة باستخدام Plexiglas وشفافة. يتم تحميل هذا الإعداد على كتلة معدنية (غير مبين) لعقد الموقف. تم تصميم كتلة معدنية بحيث يمكن أن تكون مضيئة العينات من القاع. يظهر نموذج انفجار كهربي مسجل من الخلايا العصبية R15.

Figure 2
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم تسجيل متزامن من L7 و R15 العصبية من العقد البطن. (أ)الرسوم المتحركة من العقد البطني تبين موقف الخلايا العصبية L7 و R15 (تعديل من كاندل 2001، طبع بإذن من AAAS). كما تظهر مواقف R2 و L11 في العقدة البطنية. (ب) تسجيلات تمثيلية داخل الخلايا من L7 و R15. يشير السهم إلى وقت تطبيق Ach. يمكن للمرء أن يستمر في هذه القياسات لمدة 8-10 ساعة.

Figure 3
الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن Ach التغييرات المستحثة في إمكانات العمل (AP) من R15. تم تحليل الأشكال الموجية AP قبل وأثناء وبعد التعرض Ach. تظهر أشكال الموجات التمثيلية. مللي ثانية، mV: ميليفولت.

Figure 4

الشكل 4 - الأرقام 4- الأرقام التي تم ال qPCR تحليل التعبير عن CREB1 في العقد البطن والخلايا العصبية واحدة محددة. (أ)التحديد الكمي المطلق للنسخة CREB1 في العقد البطن الشباب والكبار من Aplysia. تم عزل إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام بروتوكول تريزول القياسي كما هو موضح في الأساليب. 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي كان يستخدم لتجميع cDNA، تليها تضخيم PCR في الوقت الحقيقي باستخدام التمهيديات CREB1. (ب) التحديد الكمي المطلق للنسخ CREB1 في الخلايا العصبية واحدة محددة من Aplysiaالقديمة . تعرض إجمالي الحمض النووي الريبي لجولتين من التضخيم في المختبر قبل تخليق cDNA. 1 ميكروغرام من أرنا كان يستخدم لتجميع cDNA، تليها تضخيم PCR في الوقت الحقيقي باستخدام التمهيديات CREB1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وتشارك الخلايا العصبية R15 في تنظيم القلب والأوعية الدموية, الجهاز الهضمي, الجهاز التنفسي, والجهاز التناسلي30. نشاط الانفجار الإيقاعي بانتظام من وكالة أسوشيتد برس هو سمة من سمات R15. كما هو مبين في قسم النتائج، تسجيل مقترن من R15 و L7 تظهر أن إعداد ganglia حافظت على نشاط الخلايا العصبية R15. استجابت الخلايا العصبية R15 و L7 بشكل مناسب ل Ach. ويمكن الحفاظ على إعداد هذه العقدة تصل إلى 8-10 ساعة ويمكن رصد النشاط الكهربي باستمرار. وهكذا، يمكن للمرء أن دراسة الآثار الكهربية للتعرض الناقل العصبي وجيزة (تتعرض محليا لخلية عصبية معينة أو إلى الحمام) لفترة طويلة من الزمن. وعلاوة على ذلك, يمكن للمرء أن دراسة آثار التعرض لأجهزة الإرسال العصبية متعددة (في وقت واحد أو جنبا إلى جنب) على نفس الخلايا العصبية على خصائص اطلاق النار من نفسها أو الخلايا العصبية تابع أو كليهما.

يظهر مثال لقياسات التعبير الجيني بواسطة qPCR في الشكل 4. منذ محتوى الحمض النووي الريبي من خلية عصبية واحدة منخفضة، في التضخيم في المختبر ضروري للحصول على كمية كافية من الحمض النووي الريبي للتعبير كميا من جينات متعددة. مجموعات تجارية متاحة لعملية النسخ في المختبر. تم قياس تضخيم نسخة CREB1 بشكل مباشر من خلال عدد الدورات المطلوبة للحصول على إشارة مضان موحدة ، طريقةCt-31. الجيش الملكي النيبالي تضخيمها من خلية عصبية واحدة كافية للدراسات لتحديد التغيرات التعبير الجيني في عدد كبير من الجينات باستخدام microarray32 والنسخ الكامل من قبل RNASEQ يحلل33.

وهناك قيود على هذه التقنية هو أن هذا الإعداد قد لا يحافظ على جميع الاتصالات متشابك من الخلايا العصبية في العقدة البطنية. العديد من الخلايا العصبية تشكل نقاط الاشتباك العصبي مع الخلايا العصبية في العقدة الأخرى وفي إعداد ganglia هذه الاتصالات لمسافات طويلة سوف تفوت. ومع ذلك ، يمكن تعديل المنهجية الموصوفة هنا بسهولة لتشمل الجهاز العصبي المركزي بأكمله أو يمكن دمجها بسهولة في إعداد شبه سليم13،14،16 التي وصفت لدراسة التغيرات الخلوية والكهربائية في منعكس انسحاب الخيشوم والسيفون.

التطورات الأخيرة في تقنيات الجينوم تسمح لنا الآن للحصول على نظرة عميقة في ديناميات التعبير عن الترميز وعدم ترميز RNAs34. يعد الإعداد المنخفض الموصوف هنا مثاليا لدراسة التغيرات الزمنية للتعبير الجيني بالتزامن مع القياسات الكهربية. على سبيل المثال، يمكن للمرء تطبيق العوامل الدوائية وقياس آثارها على الخصائص الكهربائية للخلايا العصبية الفردية أو الخلايا العصبية المتعددة التي هي جزء من نفس الدوائر العصبية وعزل الخلايا العصبية الفردية في أوقات مختلفة لعزل الحمض النووي الريبي. يمكن دراسة تأثير التلاعب في خلية عصبية واحدة (مثل التحفيز الكهربائي ، أو التعرض للعوامل الدوائية) على الدوائر التي تم تحديدها بالكامل على مستوى التغيرات في التعبير عن جينات محددة في الخلايا العصبية الفردية. وهكذا تسهل هذه المنهجية التكامل الناجح للمنهجيات الكهربية والجينومية لدراسة الدوائر العصبية في أبلسيا.

ويمكن توسيع هذا النهج بسهولة لدراسة نماذج اللافقاريات الأخرى مثل تريتونيا الرخويات nudibranch، حلزون بركة Lymnaea، والحلزون الأرضي الحلزون الذي يحتوي على عدة خلايا عصبية محددة35-57. وتستخدم هذه النماذج أيضا على نطاق واسع لدراسة السيطرة العصبية من السلوكيات مثل السباحة الهروب, اتجاه المجال المغناطيسي, تشكيل المشبك, التعلم وتخزين الذاكرة. المنهجية التي وصفناها هي تكامل بسيط لتحليل الجينوم مع القياسات الفسيولوجية لنشاط الخلايا العصبية على مستوى الخلية الواحدة. ويمكن الحصول على نظرة أعمق في الأساس الجزيئي والفسيولوجي للسيطرة العصبية على السلوك من هذه الدراسات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس للمؤلفين أي مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

نشكر بصدق مؤسسة وايتهول على دعمها التمويلي وصناديق الشركات الناشئة من معهد سكريبس للأبحاث على تنفيذ هذا العمل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aplysia National Aplysia Resource Facility, University of Miami
NaCl SIGMA S 3014-1KG
KCl SIGMA P 9333-500G
CaCl2•2H2O SIGMA C5080- 500G
MgCl2•6H2O Fisher Scientific BP 214-501
NaHCO4 SIGMA S 6297-250G
HEPES SIGMA H 3375-500G
Protease GIBCO 17105-042
Trizol Ambion 15596-026
Chloroform MP Biomedicals 2194002
100% Ethanol ACROS 64-17-5
GlycoBlue Ambion AM9515
3 M NaOAc, pH 5.5 Ambion AM9740
Nuclease free water Ambion AM9737
MessageAmp II aRNA Amplification Kit Ambion AM1751
qScript cDNA SuperMix Quanta Biosciences 95048-100
Power SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems 4367659
Forceps Fine Science Tools 11252-20
Scissors Fine Science Tools 15000-08
Stainless Steel Minutien Pins  Fine Science Tools 26002-10 or
26002-20
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler
5430R Centrifuge Eppendorf 5430R Centrifuge
7900HT Fast Real-Time PCR Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR
Amplifier BRAMP-01R NPI Electronics
Digidata Converter Instrutech ITC-18 HEKA ELEKTRONIK
Micro Manipulator Patch Star Scientifica

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cleary, L. J., Byrne, J. H., Frost, W. N. Role of interneurons in defensive withdrawal reflexes in Aplysia. Learn. Mem. 2, 133-151 (1995).
  2. Elliott, C. J., Susswein, A. J. Comparative neuroethology of feeding control in molluscs. The J. Exp. Biol. 205, 877-896 (2002).
  3. Nargeot, R., Simmers, J. Functional organization and adaptability of a decision-making network in Aplysia. Front. Neurosci. 6, 113 (2012).
  4. Baxter, D. A., Byrne, J. H. Feeding behavior of Aplysia: a model system for comparing cellular mechanisms of classical and operant conditioning. Learn. Mem. 13, 669-680 (2006).
  5. Castellucci, V., Pinsker, H., Kupfermann, I., Kandel, E. R. Neuronal mechanisms of habituation and dishabituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167, 1745-1748 (1970).
  6. Castellucci, V. F., Carew, T. J., Kandel, E. R. Cellular analysis of long-term habituation of the gill-withdrawal reflex of Aplysia californica. Science. 202, 1306-1308 (1978).
  7. Dembrow, N. C., et al. A newly identified buccal interneuron initiates and modulates feeding motor programs in Aplysia. J. Neurophysiol. 90, 2190-2204 (2003).
  8. Fredman, S. M., Jahan-Parwar, B. Command neurons for locomotion in Aplysia. J. Neurophysiol. 49, 1092-1117 (1983).
  9. Jing, J., Vilim, F. S., Cropper, E. C., Weiss, K. R. Neural analog of arousal: persistent conditional activation of a feeding modulator by serotonergic initiators of locomotion. J. Neurosci. 28, 12349-12361 (2008).
  10. McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An in vitro preparation for eliciting and recording feeding motor programs with physiological movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (4320), (2012).
  11. McPherson, D. R., Blankenship, J. E. Neuronal modulation of foot and body-wall contractions in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 67, 23-28 (1992).
  12. Miller, N., Saada, R., Fishman, S., Hurwitz, I., Susswein, A. J. Neurons controlling Aplysia feeding inhibit themselves by continuous NO production. PloS one. 6, (2011).
  13. Perrins, R., Weiss, K. R. A cerebral central pattern generator in Aplysia and its connections with buccal feeding circuitry. J. Neurosci. 16, 7030-7045 (1996).
  14. Xin, Y., Weiss, K. R., Kupfermann, I. An identified interneuron contributes to aspects of six different behaviors in Aplysia. J. Neurosci. 16, 5266-5279 (1996).
  15. Carew, T. J., Castellucci, V. F., Byrne, J. H., Kandel, E. R. Quantitative analysis of relative contribution of central and peripheral neurons to gill-withdrawal reflex in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 42, 497-509 (1979).
  16. Cohen, T. E., Kaplan, S. W., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: mechanisms contributing to habituation, dishabituation, and sensitization of the Aplysia gill-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2886-2899 (1997).
  17. Frost, L., et al. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: contribution of LE and unidentified siphon sensory neurons to mediation and habituation of the Aplysia gill- and siphon-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2900-2913 (1997).
  18. Frost, W. N., Castellucci, V. F., Hawkins, R. D., Kandel, E. R. Monosynaptic connections made by the sensory neurons of the gill- and siphon-withdrawal reflex in Aplysia participate in the storage of long-term memory for sensitization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8266-8269 (1985).
  19. Hawkins, R. D., Greene, W., Kandel, E. R. Classical conditioning, differential conditioning, and second-order conditioning of the Aplysia gill-withdrawal reflex in a simplified mantle organ preparation. Behav. Neurosci. 112, 636-645 (1998).
  20. Hawkins, R. D., Clark, G. A., Kandel, E. R. Operant conditioning of gill withdrawal in Aplysia. J. Neurosci. 26, 2443-2448 (2006).
  21. Cai, D., Chen, S., Glanzman, D. L. Postsynaptic regulation of long-term facilitation in Aplysia. Curr. Biol. 18, 920-925 (2008).
  22. Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
  23. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294, 1030-1038 (2001).
  24. Wan, Q., Abrams, T. W. Trans-synaptic plasticity: presynaptic initiation, postsynaptic memory. Curr. Biol. 18, 220-223 (2008).
  25. Bao, J. X., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Involvement of presynaptic and postsynaptic mechanisms in a cellular analog of classical conditioning at Aplysia sensory-motor neuron synapses in isolated cell culture. J. Neurosci. 18, 458-466 (1998).
  26. Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Classical conditioning analog enhanced acetylcholine responses but reduced excitability of an identified neuron. J. Neurosci. 31, 14789-14793 (2011).
  27. Martin, K. C., et al. Synapse-Specific, Long-Term Facilitation of Aplysia Sensory to Motor Synapses: A Function for Local Protein Synthesis in Memory Storage. Cell. 91, 927-938 (1997).
  28. Montarolo, P. G., et al. A critical period for macromolecular synthesis in long-term heterosynaptic facilitation in Aplysia. Science. 234, 1249-1254 (1986).
  29. Mozzachiodi, R., Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Changes in neuronal excitability serve as a mechanism of long-term memory for operant conditioning. Nat. Neurosci. 11, 1146-1148 (2008).
  30. Alevizos, A., Weiss, K. R., Koester, J. Synaptic actions of identified peptidergic neuron R15 in Aplysia. I. Activation of respiratory pumping. J. Neurosci. 11, 1263-1274 (1991).
  31. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome. Res. 6, 986-994 (1996).
  32. Moroz, L. L., et al. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
  33. Moroz, L. L., Kohn, A. B. Do different neurons age differently? Direct genome-wide analysis of aging in single identified cholinergic neurons. Front. Aging Neurosci. 2, (2010).
  34. Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Genomics and proteomics in solving brain complexity. Mol. BioSyst. , (2013).
  35. Clemens, S., Katz, P. S. Identified serotonergic neurons in the Tritonia swim CPG activate both ionotropic and metabotropic receptors. J. Neurophysiol. 85, 476-479 (2001).
  36. Murray, J. A., Hewes, R. S., Willows, A. O. Water-flow sensitive pedal neurons in Tritonia: role in rheotaxis. J. Comp. Physiol. 171, 373-385 (1992).
  37. Katz, P. S., Frost, W. N. Intrinsic neuromodulation in the Tritonia swim CPG: the serotonergic dorsal swim interneurons act presynaptically to enhance transmitter release from interneuron C2. J. Neurosci. 15, 6035-6045 (1995).
  38. Brown, G. D., Frost, W. N., Getting, P. A. Habituation and iterative enhancement of multiple components of the Tritonia swim response. Behav. Neurosci. 110, 478-485 (1996).
  39. Popescu, I. R., Frost, W. N. Highly dissimilar behaviors mediated by a multifunctional network in the marine mollusk Tritonia diomedea. J. Neurosci. 22, 1985-1993 (2002).
  40. Megalou, E. V., Brandon, C. J., Frost, W. N. Evidence that the swim afferent neurons of tritonia diomedea are glutamatergic. Biol. Bull. 216, 103-112 (2009).
  41. Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Bruno, A. M., Wang, J., Frost, W. N. Variable neuronal participation in stereotypic motor programs. PloS one. 7, (2012).
  42. Yeoman, M. S., Patel, B. A., Arundell, M., Parker, K., O'Hare, D. Synapse-specific changes in serotonin signalling contribute to age-related changes in the feeding behaviour of the pond snail. Lymnaea. J. Neurochem. 106, 1699-1709 (2008).
  43. Moroz, L. L., Dahlgren, R. L., Boudko, D., Sweedler, J. V., Lovell, P. Direct single cell determination of nitric oxide synthase related metabolites in identified nitrergic neurons. J. Inorg. Biochem. 99, 929-939 (2005).
  44. Alania, M., Sakharov, D. A., Elliott, C. J. Multilevel inhibition of feeding by a peptidergic pleural interneuron in the mollusc Lymnaea stagnalis. J. Comp. Physiol. 190, 379-390 (2004).
  45. Straub, V. A., Benjamin, P. R. Extrinsic modulation and motor pattern generation in a feeding network: a cellular study. J. Neurosci. 21, 1767-1778 (2001).
  46. Vehovszky, A., Elliott, C. J. The octopamine-containing buccal neurons are a new group of feeding interneurons in the pond snail Lymnaea stagnalis. Acta Biol. Hungarica. 51, 165-176 (2000).
  47. Jansen, R. F., Pieneman, A. W., ter Maat, A. Spontaneous switching between ortho- and antidromic spiking as the normal mode of firing in the cerebral giant neurons of freely behaving Lymnaea stagnalis. J. Neurophysiol. 76, 4206-4209 (1996).
  48. McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
  49. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Buccal neurons activate ciliary beating in the foregut of the pteropod mollusk Clione limacina. J. Exp. Biol. 212, 2969-2976 (2009).
  50. Ierusalimsky, V. N., Balaban, P. M. Primary sensory neurons containing command neuron peptide constitute a morphologically distinct class of sensory neurons in the terrestrial snail. Cell Tissue Res. 330, 169-177 (2007).
  51. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Identification of mechanoafferent neurons in terrestrial snail: response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 87, 2364-2371 (2002).
  52. Balaban, P. M., et al. A single serotonergic modulatory cell can mediate reinforcement in the withdrawal network of the terrestrial snail. Neurobiol. Learn. Mem. 75, 30-50 (2001).
  53. Ierusalimsky, V. N., Zakharov, I. S., Palikhova, T. A., Balaban, P. M. Nervous system and neural maps in gastropod Helix lucorum. 24, 13-22 (1994).
  54. Kharchenko, O. A., Grinkevich, V. V., Vorobiova, O. V., Grinkevich, L. N. Learning-induced lateralized activation of the MAPK/ERK cascade in identified neurons of the food-aversion network in the mollusk Helix lucorum. Neurobiol. Learn. Mem. 94, 158-166 (2010).
  55. Ivanova, J. L., et al. Intracellular localization of the HCS2 gene products in identified snail neurons in vivo and in vitro. Cell. Mol. Neurobiol.. 26, 127-144 (2006).
  56. Kiss, T. Evidence for a persistent Na-conductance in identified command neurones of the snail, Helix pomatia. Brain Res. 989, 16-25 (2003).
  57. Balaban, P. M. Cellular mechanisms of behavioral plasticity in terrestrial snail. Neurosci. Biobehav. Rev. 26, 597-630 (2002).

Tags

علم الأعصاب، العدد 83، تسجيل داخل الخلايا، الخلايا العصبية المحددة، الدوائر العصبية، التعبير الجيني، إمكانات العمل، CREB، Aplysia californica،علم الجينوم
<em>أأليسيا</em> إعداد Ganglia للتحليلات الكهربية والجزيئية للخلايا العصبية المفردة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Akhmedov, K., Kadakkuzha, B. M.,… More

Akhmedov, K., Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons. J. Vis. Exp. (83), e51075, doi:10.3791/51075 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter