Summary
La lumaca marina Aplysia californica è stata ampiamente utilizzata come modello di neurobiologia per gli studi sulle basi cellulari e molecolari del comportamento. Qui viene descritta una metodologia per esplorare il sistema nervoso di Aplysia per le analisi elettrofisiologiche e molecolari di singoli neuroni di circuiti neurali identificati.
Abstract
Una grande sfida in neurobiologia è comprendere le basi molecolari dei circuiti neurali che governano un comportamento specifico. Una volta identificati i meccanismi molecolari specifici, è possibile sviluppare nuove strategie terapeutiche per trattare le anomalie in comportamenti specifici causati da malattie degenerative o invecchiamento del sistema nervoso. La lumaca marina Aplysia californica è adatta per le indagini sulle basi cellulari e molecolari del comportamento perché i circuiti neurali alla base di un comportamento specifico potrebbero essere facilmente determinati e le singole componenti dei circuiti potrebbero essere facilmente manipolate. Questi vantaggi dell'Aplysia hanno portato a diverse scoperte fondamentali della neurobiologia dell'apprendimento e della memoria. Qui descriviamo una preparazione del sistema nervoso di Alysia per le analisi elettrofisiofisioiche e molecolari dei singoli neuroni. In breve, il ganglio sezionato dal sistema nervoso è esposto alla proteasi per rimuovere la tona del ganglio in modo tale che i neuroni siano esposti ma mantengano l'attività neuronale come nell'animale intatto. Questa preparazione viene utilizzata per effettuare misurazioni elettrofisiopatiche di singoli o multipli neuroni. È importante sottolineare che, seguendo la registrazione utilizzando una semplice metodologia, i neuroni potrebbero essere isolati direttamente dai gangli per l'analisi dell'espressione genica. Questi protocolli sono stati utilizzati per effettuare registrazioni elettrofisiofisioiche simultanee dai neuroni L7 e R15, studiare la loro risposta all'acetilcolina e all'espressione quantitante del gene CREB1 in singoli neuroni isolati L7, L11, R15 e R2 di Aplysia.
Introduction
Il cervello umano è straordinariamente complesso con quasi 100 miliardi di neuroni e trilioni di connessioni sinaptiche. Ci sono quasi un numero uguale di cellule nonneuronali che interagiscono con i neuroni e regolano la loro funzione nel cervello. I neuroni sono organizzati in circuiti che regolano comportamenti specifici. Nonostante i progressi nella nostra comprensione delle funzioni cerebrali e dei circuiti neurali, poco si sa dell'identità dei componenti circuitali che controllano un comportamento specifico. La conoscenza delle identità di vari componenti di un circuito faciliterà notevolmente la nostra comprensione delle basi cellulari e molecolari del comportamento e aiuterà nello sviluppo di nuove strategie terapeutiche per i disturbi neuropsichiatrici.
La lumaca marina Aplysia californica è stata un cavallo di battaglia per determinare i circuiti neuronali alla base di comportamentispecifici 1-14. Il sistema nervoso dell'Alisia contiene circa 20.000 neuroni organizzati in 9 diversi gangli. I neuroni dell'Aplysia sono grandi e possono essere facilmente identificati in base alle loro dimensioni, proprietà elettriche e posizione nei gangli. Aplysia ha un ricco repertorio di comportamenti che possono essere studiati. Uno dei comportamenti ben studiati è il riflesso di astinenza branchiale (GWR). I componenti centrali di questo riflesso sono situati in gangli addominali. I componenti dei circuiti GWR sono stati mappati e sono stati determinati contributi di vari componenti. È importante sottolineare che i circuiti GWR subiscono l'apprendimento associativo e nonassociativo 5,6,15-19. Decenni di studio su questo riflesso hanno anche identificato diversi percorsi di segnalazione che hanno un ruolo chiave nell'apprendimento e nellamemoria 20-24.
Diversi preparativi di Aplysia furono usati per studiare le basi cellulari e molecolari della memorizzazione della memoria. Questi includono l'animaleintatto 2,3,la preparazione semi-intatta1,7,13,14,16 e la ricostituzione dei principali componenti dei circuiti neurali25-29. Qui viene descritta una preparazione ridotta per esplorare i gangli di Alisia per le analisi elettrofisiotiche e molecolari dei circuiti neuronali identificati. Sono stati studiati i seguenti quattro neuroni identificati. R15, un neurone che esplode, L7 e L11, due diversi motoneuroni e R2, un neurone colinergico. R2 è il più grande neurone descritto nel sistema nervoso invertebrato. In breve, questa metodologia prevede il trattamento proteasiale dei gangli, misurazioni elettrofisiologiche prima e dopo i trattamenti farmacologici e isolamento di singoli neuroni per l'analisi quantitativa dell'espressione genica. Questa metodologia ci consente di combinare le analisi molecolari con la registrazione simultanea da più neuroni. Questa metodologia è stata utilizzata con successo per studiare le risposte dei neuroni R15 e L7 all'acetilcolina (Ach) accoppiando registrazioni intracellulari. A seguito di misurazioni elettrofisiopatiche R15 e L7 e altri neuroni identificati come L11 e R2 sono stati isolati per l'analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi (qPCR) dell'espressione di CREB1, un fattore di trascrizione importante per la memorizzazione della memoria.
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Protocol
1. Preparazione di gangli addominali, misurazioni elettrofisiopatiche e isolamento di singoli neuroni identificati dal ganglio addominale di Alisia californica
- Mantenere Aplysia nell'acquario di laboratorio con acqua di mare artificiale circolante (ASW) a 16 °C in condizioni di luce:buio 12:12.
- Isolamento del ganglio addominale.
- Anestetizzare gli animali iniettando soluzione mgcl2 da 380 mM per 5-10 minuti (equivalente al 30-35% del peso corporeo dell'animale).
- Identificare il ganglio addominale in base alla sua posizione nel sistema nervosocentrale 24,28.
- Rimuovere i gangli mediante intervento chirurgico e conservare immediatamente in acqua di mare artificiale composta da NaCl da 450 mM, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2,55 mM MgCl2, 2,5 mM NaHCO3e 10 mM HEPES (pH 7.4).
- Trattamento proteasi.
- Incubare il ganglio addominale per 30 minuti a 34 °C±0,5 in una piastra di Petri con proteasi dello 0,1% (dispasi) diluita nell'ASW sopra descritta.
NOTA: La quantità di proteasi utilizzata deve essere standardizzata con l'età e il peso degli animali. In generale, gli animali più vecchi e più grandi richiederebbero più proteasi.
- Incubare il ganglio addominale per 30 minuti a 34 °C±0,5 in una piastra di Petri con proteasi dello 0,1% (dispasi) diluita nell'ASW sopra descritta.
- Rimozione della cannalia ganglia.
- Dopo il trattamento enzimatico, fissare i gangli alla base di Silicone di Sylgard di una camera cellulare (Ø= 1 cm; vol. = 0,3 ml) e per infusione con ASW (portata: 150 μl/min) a temperatura ambiente (18 °C±2 ).
NOTA: Al fine di aumentare la visibilità dei neuroni identificati, posizionare il ganglio sulla parte superiore di un cilindro di vetro in policarbonato (Figura 1) (diametro Ø = camera cellulare modificata da 2 mm) che può essere facilmente illuminato dal basso utilizzando uno stereomicroscopio binoculare con ingrandimento 20X e 40X. - Rimuovere con cura la toraia dal ganglio usando forcep e microscissori.
- Dopo il trattamento enzimatico, fissare i gangli alla base di Silicone di Sylgard di una camera cellulare (Ø= 1 cm; vol. = 0,3 ml) e per infusione con ASW (portata: 150 μl/min) a temperatura ambiente (18 °C±2 ).
- Registrazione elettrofisiologia simultanea da due neuroni.
- Identificare il neurone di interesse.
- Impalare il neurone con un singolo microelettrodo acuto intracellulare con resistenza 10-15 MΩ riempita con soluzione di 3 M KCl.
- Registra l'attività neuronale (passaggio a banda 10 kHz) usando un sistema di registrazione intracellulare.
- Elaborare i dati di registrazione utilizzando software di elettrofisiologia come Axograph.
NOTA: Si può facilmente effettuare la registrazione da più neuroni. I neuroni L7, L11 o R15 e R2 sono facilmente identificabili in base alla loro posizione. Per la registrazione simultanea da due neuroni L7 e R15 (Figura 2) sono necessari due amplificatori e due micromanipolatori.
- Applicazione di farmaci.
- Applicare il farmaco di scelta nella camera cellulare con pipettazione delicata o iniettare direttamente nei neuroni.
- Effettuare misurazioni elettrofisiopatiche.
NOTA: A seconda dell'obiettivo sperimentale, si potrebbero misurare diversi parametri elettrofisiologici dei neuroni come i cambiamenti nel potenziale di membrana (MP) o nel potenziale di azione (AP) prima, durante e dopo l'applicazione del farmaco.
- Isolamento di singoli neuroni.
- Al termine degli esperimenti elettrofisiologici, interrompere la perfusione di ASW e lavare il ganglio con etanolo al 100%. L'esposizione all'etanolo pietrifica i neuroni e, usando forcep fini, rende facile rimuovere i singoli neuroni senza danneggiare altri neuroni dal ganglio.
- Rimuovere singoli neuroni sotto uno stereomicroscopio e trasferirli in un piccolo tubo Eppendorf contenente reagente di estrazione dell'RNA ghiacciato da 500 μl. Singoli neuroni isolati possono essere conservati nel reagente di estrazione dell'RNA a -80 °C per analisi future.
2. Isolamento dell'RNA dai singoli neuroni e analisi dell'espressione genica da parte della PCR quantitativa in tempo reale (qPCR)
- Precauzioni per ridurre al minimo la degradazione dell'RNA:
Le ribonucleasi (RNasi) degradano l'RNA e sono enzimi molto stabili e attivi. Durante la gestione degli RNA, a seguire le procedure seguenti.- Pulire l'area di lavoro e gli strumenti con agenti disattivanti RNasi.
- Indossare i guanti in ogni momento durante la manipolazione dell'RNA e cambiare spesso i guanti.
- Utilizzare solo plastica priva di RNasi per gestire gli RNA.
- Isolare l'RNA totale da singoli neuroni:
- Il protocollo Trizol standard per l'isolamento dell'RNA può essere utilizzato per isolare gli RNA da singoli neuroni. Aggiungere brevemente il 20% v/v di cloroformio al Trizolo, mescolare bene con un breve vortice.
- Posizionare i tubi sul rotatore per 10 min a 4 °C. Ruotare la miscela Trizolo-Cloroformio a 12.000 x g per 15 min a 4 °C.
- Raccogliere la fase acquosa e trasferirlo in un tubo fresco.
- Aggiungere la soluzione di acetato di sodio (pH 5.5) ad una concentrazione finale di 0,3 M, 100 ng/ml del coprecipitante GlycoBlue e 2,5 volumi di etanolo al 100% per far precipitare l'RNA.
- Mescolare bene i campioni e incubare a -80 °C durante la notte.
- Ruotare i campioni a 12.000 x g per 20 min a 4 °C e un piccolo pellet blu sarà visibile nella parte inferiore del tubo.
- Rimuovere il supernatante e lavare il pellet con 850 μl di etanolo ghiacciato al 75% a 12.000 x g per 10 min a 4 °C.
- Rimuovere il supernatante con cura e asciugare all'aria il pellet di RNA per 7-10 minuti, massimo.
NOTA: Assicurarsi che l'RNA non sia lasciato a lungo asciutto come oltre - asciugareil pellet di RNA rende la solubilizzazione molto difficile. - Una volta essiccato, rimescolare il pellet di RNA in 10 μl di acqua libera di RNAse e determinare la concentrazione di RNA.
NOTA: Determinare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro. Quando non si utilizza subito, conservare l'RNA a -80 °C.
- sintesi dell'aRNA da singoli neuroni:
- Amplificare l'RNA (uno o due turni a seconda dell'obiettivo sperimentale) utilizzando il sistema di amplificazione dell'RNA lineare disponibile in commercio.
NOTA: L'RNA totale dei singoli neuroni variava da ~10-60 ng. La resa prevista del primo ciclo di amplificazione è di ~100-300 ng e il secondo ciclo di amplificazione è ~0,8-1,5 μg di RNA.
- Amplificare l'RNA (uno o due turni a seconda dell'obiettivo sperimentale) utilizzando il sistema di amplificazione dell'RNA lineare disponibile in commercio.
- Trascrizione inversa dell'RNA:
- Per generare cDNA dall'aRNA, utilizzare 1,0 μg di aRNA in 20 μl di una reazione di trascrizione inversa. Diversi kit sono disponibili in commercio per questo scopo.
NOTA: cDNA è stato sintetizzato secondo il protocollo del produttore utilizzando le seguenti impostazioni sul ciclore termico.
5 min a 25 °C
30 min a 42 °C
5 min a 85 °C
Tenere premuto a 4 °C - Dopo la fase di trascrizione inversa, conservare il cDNA a -20 °C per la conservazione a lungo termine.
- Per generare cDNA dall'aRNA, utilizzare 1,0 μg di aRNA in 20 μl di una reazione di trascrizione inversa. Diversi kit sono disponibili in commercio per questo scopo.
- Progettazione e standardizzazione primer:
Sono disponibili diversi eccellenti programmi software, gratuiti, per la progettazione di primer per amplificazioni in tempo reale.- Selezionare oligonucleotidi da 18-24 anni che producono ampliconi da 70-110 bp e sintetizzare i primer utilizzando fonti commerciali.
NOTA: Due o tre coppie di primer devono essere progettate per ogni gene di interesse. Ogni set di primer deve essere standardizzato da qPCR. Le coppie primer avanti e indietro utilizzate per il gene CREB1 (Figura 4) sono le seguenti:
Primer set 1
Attaccante: 5'-TGATTCTGACGCAAAGAAAGA-3'
Retromarcia: 5'-ACCGTGAGCAGTCAGTTGTAGA-3'
Primer set 2
Attaccante: 5'-AGGGAATGTCGATGAAAGAAGA-3'
Rovescio: 5'-GACACAGGAAGTATGCCAAA-3' - Per selezionare il primer migliore da utilizzare per le analisi a valle, monitorare il valore Ct e la forma della curva di amplificazione in qPCR.
NOTA: I primer che danno valori Ct (Cycle threshold) tra 10-35 nell'amplificazione rotonda 40 e curve lisce durante la fase esponenziale della PCR seguita da un plateau liscio sono ottimali per le analisi dell'espressione genica.
- Selezionare oligonucleotidi da 18-24 anni che producono ampliconi da 70-110 bp e sintetizzare i primer utilizzando fonti commerciali.
- PCR quantitativo in tempo reale (qPCR):
Nota: utilizzare tubi o piastre appropriati compatibili con la macchina qPCR.- Diluire cDNA a 5x con acqua priva di nucleasi.
- A 2 μl di cDNA diluito, aggiungere 8 μl di una miscela master qPCR contenente 2 μl di H2O, 5 μl di 2x SYBR Green master mix e 1,0 μl di 10 μM (ciascuno) primer avanti e indietro.
- Chiudere i tubi e sigillare la piastra dopo pipettazione cDNA e master mix. Mescolare il contenuto toccando delicatamente e girando verso il basso a 1.500 giri/min per 30 secondi.
- Procedere alla configurazione della macchina qPCR.
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Representative Results
I pesi degli animali utilizzati in questo studio variavano da 100-200 g. Seguendo i protocolli descritti, abbiamo condotto misurazioni elettrofisiotiche e analisi molecolari di neuroni di gangli addominali isolati da animali che vanno da 2-5 g a 200-300 g.
La standardizzazione del trattamento proteasi è importante per misurazioni elettrofisioniche di successo dei neuroni nei gangli. Inizialmente, sono state utilizzate concentrazioni e durate multiple di proteasi (Dispasi) e sono stati registrati potenziali d'azione di scoppio dai neuroni R1526,31. Queste misurazioni sono state confrontate con la registrazione diretta (senza trattamento proteasi) dai gangli intatti. Negli esperimenti successivi è stata utilizzata la concentrazione della proteasi (0,1% proteasi, cfr. fase 1.3) che ha prodotto potenziali di scoppio paragonabili a quelli ottenuti dal ganglio esposto senza proteasi.
Utilizzando il protocollo descritto, sono stati registrati potenziali d'azione (AP) in risposta all'esposizione di Ach a R15, un neurone colinergico e L7, un motoneurone che non risponde ad Ach. Come previsto, registrazioni elettrofisiotiche simultanee mostrano che Ach induce depolarizzazione in R15 mentre non c'è stato alcun cambiamento nella cottura di L7. La figura 2 mostra l'applicazione dell'acetilcolina (Ach) direttamente nella camera cellulare. 1 M Ach (volume 0,3 μl) è stato applicato direttamente nella camera utilizzando micropipette per ottenere una concentrazione finale di 1 mM all'interno della camera.
Ach è stato lavato via dal bagno per perfusione e registrato di nuovo dai neuroni R15. La figura 3 mostra forme d'onda che suggeriscono che l'effetto Ach è reversibile. Viene mostrata l'analisi dei parametri AP in controllo, durante la depolarizzazione e dopo il lavaggio. Durante la depolarizzazione l'ampiezza viene ridotta e la durata dell'AP aumenta in modo significativo.
A seguito di misurazioni elettrofisiopatiche, i neuroni R15 e L7 sono stati isolati e gli RNA sono stati preparati per le analisi qPCR. Una trascrizione lineare guidata da T7 RNA Polimerasi utilizzando MessageAmp II aRNA Amplification Kit di Ambion è stata utilizzata per amplificare gli RNA da singoli neuroni. Per confronto, sono stati studiati anche i neuroni identificati R2 e L11 e tutti i gangli addominali di animali adulti (6-9 mesi) e giovani (1-2 mesi). l'amplificazione qPCR è stata effettuata in un sistema PCR veloce in tempo reale 7900HT alle seguenti condizioni: 95 °C per 10 minuti, seguito da 40 cicli di 95 °C per 15 sec, 60 °C per 1 min. Ci sono state quattro repliche biologiche nell'esperimento. Ogni replica biologica ha avuto quattro repliche tecniche nella configurazione qPCR. I valori Ct di quattro repliche sono stati calcolati in media e 1/Ct è stato calcolato per trovare il livello di espressione assoluta di CREB1 in ogni campione (Figura 4). Una stima dei livelli di espressione assoluta del gene CREB1 nei gangli aplysia giovani e adulti, e in quattro singoli neuroni identificati è stata monitorata dal valore Ct ottenuto dalle misurazioni qPCR.
La concentrazione iniziale di mRNA era la stessa sia nei gangli addominali giovani che in quello adulti. Lo stesso set di primer CREB1 in avanti e in retromarcia è stato utilizzato in tutti i qPCR, sia negli studi che utilizzano gangli e singoli neuroni. I valori del Ct sono molto simili tra gangli addominali giovani e adulti. Allo stesso modo, i valori ct sono stati misurati nel caso di singoli neuroni in cui le concentrazioni totali di mRNA iniziale erano basse e due cicli di amplificazione hanno prodotto una buona quantità di RNA per la sintesi cDNA. I valori Ct dell'amplificazione CREB1 hanno suggerito che l'espressione CREB1 nei neuroni R15 e L7 è comparabile, mentre R2 e L11 hanno mostrato differenze significative nell'espressione rispetto a L7 o R15 (test T dello studente, p<0,05) (Figura 4).
Figura 1. Stadio microscopio e sistema di perfusione per elettrofisiologia gangli. Il sistema e lo stadio di perfusione sono stati realizzati utilizzando plexiglas e sono trasparenti. Questa configurazione è montata su un blocco metallico (non mostrato) per mantenere la posizione. Il blocco metallico è progettato in modo tale che i campioni possano essere illuminati dal basso. Viene mostrato un modello di scoppio elettrofisiologico campione registrato dal neurone R15.
Figura 2. Registrazione simultanea da L7 e R15 neurone di gangli addominali. (A) Cartone animato di gangli addominali che mostra la posizione dei neuroni L7 e R15 (modificati da Kandel 2001, ristampati con il permesso di AAAS). Sono mostrate anche le posizioni di R2 e L11 nei gangli addominali. (B) Registrazioni intracellulari rappresentative da L7 e R15. Freccia indica il tempo dell'applicazione Ach. Si potrebbero continuare queste misurazioni per 8-10 ore.
Figura 3. Ach ha indotto cambiamenti nel potenziale d'azione (AP) di R15. Le forme d'onda AP sono state analizzate prima, durante e dopo l'esposizione ad Ach. Vengono mostrate forme d'onda rappresentative. ms: millisecondo, mV: millivolt.
Figura 4. analisi qPCR dell'espressione di CREB1 nei gangli addominali e nei singoli neuroni identificati. (A) Quantificazione assoluta della trascrizione CREB1 nei gangli addominali giovani e adulti di Aplysia. L'RNA totale è stato isolato usando il protocollo Trizol standard come descritto nei metodi. 1 μg di RNA totale è stato utilizzato per sintetizzare cDNA, seguito dall'amplificazione PCR in tempo reale usando primer CREB1. (B) Quantificazione assoluta della trascrizione CREB1 nei singoli neuroni identificati della vecchia Aplysia. L'RNA totale è stato sottoposto a due cicli di amplificazione in vitro prima della sintesi del cDNA. 1 μg di aRNA è stato usato per sintetizzare cDNA, seguito dall'amplificazione PCR in tempo reale usando primer CREB1.
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Discussion
Il neurone R15 è coinvolto nella regolazione dei sistemi cardiovascolare, digestivo, respiratorio e riproduttivo30. Un'attività di bursting regolarmente ritmica dell'AP è una caratteristica di R15. Come mostrato nella sezione dei risultati, la registrazione accoppiata di R15 e L7 mostra che la preparazione dei gangli ha preservato l'attività dei neuroni R15. I neuroni R15 e L7 hanno risposto in modo appropriato ad Ach. Questa preparazione dei gangli potrebbe essere mantenuta fino a 8-10 ore e l'attività elettrofisiologia potrebbe essere continuamente monitorata. Così, si potrebbero studiare gli effetti elettrofisiologici di una breve esposizione al neurotrasmettitore (esposta localmente a uno specifico neurone o al bagno) per un lungo periodo di tempo. Inoltre, si potrebbero studiare gli effetti dell'esposizione a più neurotrasmettitori (contemporaneamente o in tandem) sullo stesso neurone sulle proprietà di fuoco di se stesso o del neurone seguace o di entrambi.
Un esempio di misurazioni dell'espressione genica da parte di qPCR è mostrato nella figura 4. Poiché il contenuto di RNA di un singolo neurone è basso, l'amplificazione in vitro è necessaria per ottenere una quantità sufficiente di RNA per quantificare l'espressione di più geni. Sono disponibili kit commerciali per il processo di trascrizione in vitro. L'amplificazione della trascrizione CREB1 è stata quantificata direttamente dal numero di cicli necessari per ottenere un segnale di fluorescenza standardizzato, il metodo Ct31. L'RNA amplificato di un singolo neurone è sufficiente per gli studi per determinare i cambiamenti di espressione genica in un gran numero di geni usando il microarray32 e per l'intero trascrittoma da analisi RNAseq33.
Una limitazione di questa tecnica è che questa preparazione potrebbe non preservare tutte le connessioni sinaptiche dei neuroni dei gangli addominali. Molti dei neuroni formano sinapsi con neuroni in altri gangli e nella preparazione dei gangli queste connessioni a lunga distanza saranno perse. Tuttavia, la metodologia qui descritta potrebbe essere facilmente modificata per includere l'intero SNC o potrebbe essere facilmente integrata nella preparazione semi-intatta13,14,16 che è stata descritta per studiare i cambiamenti cellulari ed elettrofisiologici nel riflesso di astinenza branchiale e sifone.
I recenti progressi nelle tecniche genomiche ci consentono ora di ottenere una visione approfondita delle dinamiche di espressione della codifica e della non codifica RNA34. La preparazione ridotta qui descritta è ideale per studiare i cambiamenti temporali dell'espressione genica in combinazione con misurazioni elettrofisiopatiche. Ad esempio, si potrebbero applicare agenti farmacologici e misurare i loro effetti sulle proprietà elettriche dei singoli neuroni o di più neuroni che fanno parte dello stesso circuito neurale e isolare i singoli neuroni in momenti diversi per l'isolamento dell'RNA. L'effetto della manipolazione di un singolo neurone (come la stimolazione elettrica o le esposizioni ad agenti farmacologici) sull'intero circuito identificato potrebbe essere studiato a livello di cambiamenti nell'espressione di specifici geni in singoli neuroni. Pertanto questa metodologia facilita l'integrazione di successo delle metodologie elettrofisiologiche e genomiche per studiare i circuiti neurali in Aplysia.
Questo approccio potrebbe essere facilmente esteso allo studio di altri modelli di invertebrati come il molluschico nudibranchi Tritonia, la lumaca di stagno Lymnaea e la lumaca terrestre Helix il cui sistema nervoso contiene diversi neuroniidentificati 35-57. Questi modelli sono anche ampiamente utilizzati per lo studio del controllo neurale di comportamenti come il nuoto di fuga, l'orientamento del campo magnetico, la formazione di sinapsi, l'apprendimento e la memorizzazione della memoria. La metodologia che abbiamo descritto è una semplice integrazione dell'analisi genomica con misurazioni fisiologiche dell'attività neuronale a livello di singola cellula. Una visione più approfondita delle basi molecolari e fisiologiche del controllo neurale del comportamento potrebbe essere ottenuta da tali studi.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo sinceramente la Whitehall Foundation per il supporto finanziario e i fondi di avvio dello Scripps Research Institute per aver svolto questo lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aplysia | National Aplysia Resource Facility, University of Miami | ||
| NaCl | SIGMA | S 3014-1KG | |
| KCl | SIGMA | P 9333-500G | |
| CaCl2•2H2O | SIGMA | C5080- 500G | |
| MgCl2•6H2O | Fisher Scientific | BP 214-501 | |
| NaHCO4 | SIGMA | S 6297-250G | |
| HEPES | SIGMA | H 3375-500G | |
| Protease | GIBCO | 17105-042 | |
| Trizol | Ambion | 15596-026 | |
| Chloroform | MP Biomedicals | 2194002 | |
| 100% Ethanol | ACROS | 64-17-5 | |
| GlycoBlue | Ambion | AM9515 | |
| 3 M NaOAc, pH 5.5 | Ambion | AM9740 | |
| Nuclease free water | Ambion | AM9737 | |
| MessageAmp II aRNA Amplification Kit | Ambion | AM1751 | |
| qScript cDNA SuperMix | Quanta Biosciences | 95048-100 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Stainless Steel Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 or | |
| 26002-20 | |||
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | Veriti Thermal Cycler | |
| 5430R Centrifuge | Eppendorf | 5430R Centrifuge | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | 7900HT Fast Real-Time PCR | |
| Amplifier | BRAMP-01R | NPI Electronics | |
| Digidata Converter | Instrutech ITC-18 | HEKA ELEKTRONIK | |
| Micro Manipulator | Patch Star | Scientifica |
References
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