Summary
El caracol marino Aplysia californica ha sido ampliamente utilizado como modelo neurobiológico para los estudios sobre bases celulares y moleculares del comportamiento. Aquí se describe una metodología para explorar el sistema nervioso de Aplysia para los análisis electrofisiológicos y moleculares de neuronas individuales de circuitos neuronales identificados.
Abstract
Un desafío importante en neurobiología es entender los fundamentos moleculares de los circuitos neuronales que gobiernan un comportamiento específico. Una vez identificados los mecanismos moleculares específicos, se pueden desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para tratar anomalías en comportamientos específicos causadas por enfermedades degenerativas o envejecimiento del sistema nervioso. El caracol marino Aplysia californica es muy adecuado para las investigaciones de las bases celulares y moleculares del comportamiento porque los circuitos neuronales subyacentes a un comportamiento específico podrían determinarse fácilmente y los componentes individuales de los circuitos podrían ser fácilmente manipulados. Estas ventajas de Aplysia han llevado a varios descubrimientos fundamentales de la neurobiología del aprendizaje y de la memoria. Aquí se describe una preparación del sistema nervioso Aplysia para los análisis electrofisiológicos y moleculares de las neuronas individuales. Brevemente, el ganglio diseccionado del sistema nervioso se expone a la proteasa para eliminar la vaina ganglionar de tal manera que las neuronas están expuestas pero conservan la actividad neuronal como en el animal intacto. Esta preparación se utiliza para llevar a cabo mediciones electrofisiológicas de neuronas únicas o múltiples. Es importante destacar que, después de la grabación utilizando una metodología simple, las neuronas podrían aislarse directamente de los ganglios para el análisis de expresión génica. Estos protocolos se utilizaron para llevar a cabo grabaciones electrofisiológicas simultáneas de las neuronas L7 y R15, estudiar su respuesta a la acetilcolina y la cuantificación de la expresión del gen CREB1 en aislados de las neuronas L7, L11, R15 y R2 de Aplysia.
Introduction
El cerebro humano es extraordinariamente complejo con casi 100 mil millones de neuronas y billones de conexiones sinápticas. Hay casi un número igual de células no neuronales que interactúan con las neuronas y regulan su función en el cerebro. Las neuronas se organizan en circuitos que regulan comportamientos específicos. A pesar de los avances en nuestra comprensión de las funciones cerebrales y los circuitos neuronales, poco se sabe sobre la identidad de los componentes de los circuitos que controlan un comportamiento específico. El conocimiento de las identidades de varios componentes de un circuito facilitará grandemente nuestra comprensión de la base celular y molecular del comportamiento y ayuda en el desarrollo de las estrategias terapéuticas nuevas para los desordenes neuropsiquiátricos.
El caracol marino Aplysia californica ha sido un caballo de batalla para determinar los circuitos neuronales subyacentes a comportamientos específicos1-14. El sistema nervioso de Aplysia contiene aproximadamente 20.000 neuronas que se organizan en 9 ganglios diferentes. Las neuronas de Aplysia son grandes y se pueden identificar fácilmente en función de su tamaño, propiedades eléctricas y posición en los ganglios. Aplysia tiene un rico repertorio de comportamientos que pueden ser estudiados. Uno de los comportamientos bien estudiados es el reflejo branquial-abstinencia (GWR). Los componentes centrales de este reflejo están situados en los ganglios abdominales. Se han mapeado componentes de los circuitos GWR y se han determinado las contribuciones de varios componentes. Es importante destacar que los circuitos GWR se someten a aprendizaje asociativo y no asociativo5,6,15-19. Décadas de estudio sobre este reflejo también han identificado varias vías de señalización que tienen un papel clave en el aprendizaje y la memoria20-24.
Varias preparaciones diferentes de Aplysia se utilizaron para estudiar las bases celulares y moleculares del almacenamiento de la memoria. Estos incluyen el animal intacto2,3,la preparación semi-intacta1,7,13,14,16 y la reconstitución de los principales componentes de los circuitos neuronales25-29. Una preparación reducida para explorar los ganglios de Aplysia para los análisis electrofisiológicos y moleculares de circuitos neuronales identificados se describe aquí. Las cuatro neuronas identificadas siguientes fueron estudiadas. R15, una neurona que estallaba, L7 y L11, dos diversas neuronas de motor y R2, una neurona colinérgica fueron estudiados. R2 es la neurona más grande descrita en el sistema nervioso de los invertebrados. Brevemente, esta metodología implica el tratamiento proteasa de ganglios, mediciones electrofisiológicas antes y después de los tratamientos farmacológicos, y el aislamiento de neuronas individuales para el análisis cuantitativo de la expresión génica. Esta metodología nos permite combinar análisis moleculares con el registro simultáneo de múltiples neuronas. Esta metodología se utilizó con éxito para estudiar las respuestas de las neuronas R15 y L7 a la acetilcolina (Ach) por grabaciones intracelulares emparejadas. Después de mediciones electrofisiológicas R15 y L7 y otras neuronas identificadas como L11 y R2 se aislaron para el análisis cuantitativo de reacción en cadena de la polimerasa (qPCR) de la expresión de CREB1, un factor de transcripción importante para el almacenamiento de memoria.
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Protocol
1. Preparación De Ganglios Abdominales, Mediciones Electrofisiológicas, Y El Aislamiento De Las Neuronas Individuales Identificadas Del Ganglio Abdominal De Aplysia californica
- Mantenga Aplysia en el acuario de laboratorio con agua de mar artificial circulante (ASW) a 16 ° C bajo condiciones de luz: oscuras de 12:12.
- Aislamiento del ganglio abdominal.
- Anestesiar a los animales inyectando 380 mM mgCl2 solución durante 5-10 min (equivalente al 30-35% del peso corporal del animal).
- Identificar el ganglio abdominal en función de su posición en el sistema nervioso central24,28.
- Retirar los ganglios mediante operación quirúrgica y almacenarlos inmediatamente en agua de mar artificial consistente en 450 mM de NaCl, 10 mM de KCl, 10 mM de CaCl2,55 mM de MgCl2,2,5 mM de NaHCO3,y 10 mM de HEPES (pH 7,4).
- Tratamiento con proteasas.
- Incubar ganglio abdominal durante 30 min a 34 °C±0,5 en una placa de Petri con proteasa (dispase) al 0,1% diluida en ASW descrita anteriormente.
NOTA: La cantidad de la proteasa utilizada debe estandarizarse con la edad y el peso de los animales. En general, los animales más viejos y más grandes requerirían más proteasa.
- Incubar ganglio abdominal durante 30 min a 34 °C±0,5 en una placa de Petri con proteasa (dispase) al 0,1% diluida en ASW descrita anteriormente.
- Retiro de la envaesda de los ganglios.
- Después del tratamiento enzimático, fije los ganglios a la base de silicona de Sylgard de una cámara celular (Ø = 1 cm; vol. = 0,3 ml) y perfunda con ASW (caudal: 150 μl/min) a temperatura ambiente (18 °C±2).
NOTA: Con el fin de aumentar la visibilidad de las neuronas identificadas, coloque el ganglio en la parte superior de un cilindro de vidrio de policarbonato(Figura 1)(diámetro Ø = 2 mm de cámara celular modificada) que se puede iluminar fácilmente desde la parte inferior utilizando un estereomicroscopio binocular con aumento de 20X y 40X. - Retire cuidadosamente la vainquia del ganglio mediante el uso de tórceps y microscisores.
- Después del tratamiento enzimático, fije los ganglios a la base de silicona de Sylgard de una cámara celular (Ø = 1 cm; vol. = 0,3 ml) y perfunda con ASW (caudal: 150 μl/min) a temperatura ambiente (18 °C±2).
- Grabación electrofisiológica simultánea de dos neuronas.
- Identificar la neurona de interés.
- Empalar la neurona con un solo microelectrodo agudo intracelular con resistencia 10-15 MΩ lleno de 3 M KCl solución.
- Registre la actividad neuronal (paso de banda de 10 kHz) utilizando un sistema de grabación intracelular.
- Procese los datos de registro utilizando software de electrofisiología como Axograph.
NOTA: Uno puede llevar a cabo fácilmente la grabación de múltiples neuronas. Las neuronas L7, L11 o R15 y R2 se identifican fácilmente en función de su posición. Se requieren dos amplificadores y dos micromanipuladores para grabar simultáneamente desde dos neuronas L7 y R15 (Figura 2).
- Aplicación de fármacos.
- Aplicar el fármaco de elección en la cámara celular por pipeteo suave o inyectar directamente en las neuronas.
- Realizar mediciones electrofisiológicas.
NOTA: Dependiendo del objetivo experimental, se podrían medir diferentes parámetros electrofisiológicos de las neuronas como los cambios en el potencial de membrana (MP) o el potencial de acción (AP) antes, durante y después de la aplicación del fármaco.
- Aislamiento de neuronas individuales.
- Al concluir los experimentos electrofisiológicos, detenga la perfusión de ASW y lave el ganglio con etanol al 100%. La exposición al etanol petrificará las neuronas y, usando los pórceps finos, hará que sea fácil quitar las neuronas individuales sin dañar otras neuronas del ganglio.
- Retire las neuronas individuales debajo de un estereomicroscopio y transfiérelo a un pequeño tubo de Eppendorf que contenga un reactivo de extracción de ARN de 500 μl helado. Las neuronas individuales aisladas se pueden almacenar en reactivos de extracción de ARN a -80 °C para futuros análisis.
2. Aislamiento de ARN de neuronas individuales y análisis de expresión génica por PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR)
- Precauciones para minimizar la degradación del ARN:
Las ribonucleasas (RNasas) degradan el ARN y son enzimas muy estables y activas. Siga estos pasos durante el manejo de los ENR.- Limpie el área de trabajo y los instrumentos con agentes desactivadores de RNase.
- Use guantes en todo momento mientras manipula el ARN y cámbiese los guantes con frecuencia.
- Use solo plásticos libres de ARNsa para manejar los ARNs.
- Aislar el ARN total de las neuronas individuales:
- El protocolo trizol estándar para el aislamiento de ARN se puede utilizar para aislar LOS ARN de neuronas individuales. Añadir brevemente 20% v/v de cloroformo a Trizol, mezclar bien por breve vórtice.
- Coloque los tubos en el rotador durante 10 min a 4 °C. Haga girar la mezcla Trizol-Cloroformo a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C.
- Recoger la fase acuosa y transferir a un tubo fresco.
- Añadir solución de acetato de sodio (pH 5,5) a una concentración final de 0,3 M, 100 ng/ml del coprecipitante GlycoBlue, y 2,5 volúmenes de etanol al 100% para precipitar el ARN.
- Mezcle bien las muestras e incube a -80 °C durante la noche.
- Gire las muestras a 12.000 x g durante 20 min a 4 °C y un pequeño pellet azul será visible en la parte inferior del tubo.
- Retire el sobrenadante y lave el pellet con 850 μl de etanol helado al 75% a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C.
- Retire el sobrenadante con cuidado y seque al aire el pellet de ARN durante 7-10 min, máximo.
NOTA: Asegúrese de que el ARN no se deja secar durante mucho tiempo como encima-secar el pellet de ARN hace que la solubilización sea muy difícil. - Una vez secado, resuspend el pellet de ARN en 10 μl de agua libre de RNAse y determinar la concentración de ARN.
NOTA: Determine la concentración de ARN utilizando un espectrofotómetro. Cuando no se use de inmediato, guarde el ARN a -80 °C.
- Síntesis de aRNA a partir de neuronas individuales:
- Amplificar el ARN (una o dos rondas dependiendo del objetivo experimental) utilizando el sistema de amplificación de ARN lineal disponible en el comercio.
NOTA: El ARN total de neuronas individuales varió de ~10-60 ng. El rendimiento esperado de la primera ronda de amplificación es de ~ 100-300 ng y la segunda ronda de amplificación es de ~ 0.8-1.5 μg de ARN.
- Amplificar el ARN (una o dos rondas dependiendo del objetivo experimental) utilizando el sistema de amplificación de ARN lineal disponible en el comercio.
- Transcripción inversa del ARN:
- Para generar ADNc a partir de aRNA, utilice 1,0 μg de ARN en 20 μl de una reacción de transcripción inversa. Varios kits están disponibles comercialmente para este propósito.
NOTA: El ADNc se sintetizó de acuerdo con el protocolo del fabricante utilizando los siguientes ajustes en el ciclador térmico.
5 min a 25 °C
30 min a 42 °C
5 min a 85 °C
Mantener a 4 °C - Después del paso de transcripción inversa, almacene el ADNc a -20 °C para el almacenamiento a largo plazo.
- Para generar ADNc a partir de aRNA, utilice 1,0 μg de ARN en 20 μl de una reacción de transcripción inversa. Varios kits están disponibles comercialmente para este propósito.
- Diseño y estandarización de cebadores:
Varios programas de software excelentes están disponibles, de forma gratuita, para el diseño de cebadores para amplificaciones en tiempo real.- Seleccione 18-24 oligonucleótidos de mer que produzcan amplicones de 70-110 pb y sintetice los cebadores utilizando fuentes comerciales.
NOTA: Se deben diseñar de dos a tres pares de cebadores para cada gen de interés. Cada conjunto de cebadores debe ser estandarizado por qPCR. Los pares de cebadores delanteros e inversos que se utilizaron para el gen CREB1(Figura 4)son los siguientes:
Juego de cebadores 1
Adelante: 5'-TGATTCTGACGCAAAGAAAAGA-3'
Reverso: 5'-ACCGTGAGCAGTCAGTTGTAGA-3'
Juego de cebadores 2
Delantero: 5'-AGGGAATGTCGATGAAAGAAGA-3'
Reverso: 5'-GACACACAGGAAGTATGCCAAA-3' - Para seleccionar el mejor cebador que se utilizará para los análisis aguas abajo, monitoree el valor de Ct y la forma de la curva de amplificación en qPCR.
NOTA: Los cebadores que dan valores de Ct (Umbral de ciclo) entre 10-35 en la amplificación de 40 rondas y curvas suaves durante la fase exponencial de la PCR seguida de una meseta suave son óptimos para los análisis de expresión génica.
- Seleccione 18-24 oligonucleótidos de mer que produzcan amplicones de 70-110 pb y sintetice los cebadores utilizando fuentes comerciales.
- PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR):
Nota: Utilice tubos o placas apropiados que sean compatibles con la máquina qPCR.- Diluya el ADNc a 5x con agua libre de nucleasa.
- A 2 μl de ADNc diluido, agregue 8 μl de una mezcla maestra qPCR que contenga 2 μl deH2O, 5 μl de 2x mezcla maestra verde SYBR y 1,0 μl de imprimación directa e inversa de 10 μM (cada una).
- Cierre los tubos y selle la placa después de pipetear el ADNc y la mezcla maestra. Mezcle el contenido tocando suavemente y girando hacia abajo a 1.500 rpm durante 30 segundos.
- Proceda a configurar la máquina qPCR.
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Representative Results
Los pesos de los animales que fueron utilizados en este estudio se extendieron a partir del 100-200 g. Siguiendo los protocolos descritos, se realizaron mediciones electrofisiológicas y análisis moleculares de neuronas de ganglios abdominales aislados de animales que oscilaban entre 2-5 g y 200-300 g.
La estandarización del tratamiento con proteasa es importante para el éxito de las mediciones electrofisiológicas de las neuronas en los ganglios. Inicialmente, se utilizaron concentraciones y duraciones múltiples de proteasa (Dispase) y se registraron potenciales de acción de explosión de la neurona R1526,31. Estas medidas fueron comparadas para dirigir (sin el tratamiento de la proteasa) la grabación de los ganglios intactos. En los experimentos posteriores se utilizó la concentración de la proteasa (proteasa al 0,1%, ver paso 1.3) que produjo potenciales de explosión comparables a los obtenidos del ganglio expuesto sin proteasa.
Utilizando el protocolo descrito, se registraron potenciales de acción (AP) en respuesta a la exposición de Ach a R15, una neurona colinérgica y L7, una neurona motora que no responde a Ach. Como era de esperar, las grabaciones electrofisiológicas simultáneas muestran que Ach induce la despolarización en R15 mientras que no hubo ningún cambio en la cocción de L7. La Figura 2 muestra la aplicación de acetilcolina (Ach) directamente en la cámara celular. 1 M Ach (volumen 0,3 μl) se aplicó directamente en la cámara utilizando micropipeta con el fin de obtener una concentración final de 1 mM dentro de la cámara.
Ach fue lavado del baño por la perfusión y registrado otra vez de las neuronas R15. La Figura 3 muestra formas de onda que sugieren que el efecto Ach es reversible. Análisis de los parámetros AP en control, durante la despolarización y después del lavado se muestra. Durante la despolarización la amplitud se disminuye y la duración del AP aumenta significativamente.
Después de medidas electrofisiológicas, las neuronas R15 y L7 fueron aisladas y los RNAs fueron preparados para los análisis del qPCR. Una transcripción lineal de la ARN polimerasa T7 impulsada por el uso de MessageAmp II aRNA Amplification Kit de Ambion se utilizó para amplificar los ARN de neuronas individuales. Para la comparación, las neuronas identificadas R2 y L11 y los ganglios abdominales enteros de los animales adultos (6-9 meses) y jovenes (1-2 meses) también fueron estudiados. La amplificación de qPCR se llevó a cabo en un sistema de PCR rápida en tiempo real 7900HT bajo las siguientes condiciones: 95 °C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 15 seg, 60 °C durante 1 min. Hubo cuatro réplicas biológicas en el experimento. Cada réplica biológica tenía cuatro réplicas técnicas en el qPCR establecido. Se promediaron los valores de CT de cuatro réplicas y se calculó 1/Ct para encontrar el nivel de expresión absoluta de CREB1 en cada muestra (Figura 4). Una estimación de los niveles absolutos de la expresión del gene CREB1 en ganglios jovenes y adultos de Aplysia, y en cuatro solas neuronas identificadas fue supervisada por el valor del Ct obtenido de medidas de qPCR.
La concentración inicial del mRNA era lo mismo en ganglios abdominales jovenes y adultos. El mismo conjunto de cebadores CREB1 hacia adelante y hacia atrás se utilizaron en todos los qPCRs, tanto en estudios con ganglios como en neuronas individuales. Los valores de Tc son muy similares entre los ganglios abdominales jóvenes y adultos. Semejantemente, los valores del Ct fueron medidos en el caso de solas neuronas donde las concentraciones totales de mRNA que comenzaban eran bajas y dos redondos de amplificación rindieron una buena cantidad de RNAs para la síntesis del cDNA. Los valores de Ct de la amplificación de CREB1 sugirieron que la expresión de CREB1 en las neuronas R15 y L7 son comparables, mientras que R2 y L11 mostraron diferencias significativas en la expresión en comparación con L7 o R15 (prueba T de Student, p<0,05)(Figura 4).
Figura 1. Etapa del microscopio y sistema de la perfusión para la electrofisiología de los ganglios. El sistema de perfusión y la etapa se realizaron utilizando plexiglás y son transparentes. Esta configuración se monta en un bloque de metal (no se muestra) para mantener la posición. El bloque de metal está diseñado de tal manera que las muestras se pueden iluminar desde la parte inferior. Se muestra un patrón de estallido electrofisiológico de muestra registrado a partir de la neurona R15.
Figura 2. Grabación simultánea de la neurona L7 y R15 de ganglios abdominales. (A)Caricatura de ganglios abdominales que muestran la posición de las neuronas L7 y R15 (modificada de Kandel 2001, reimpresa con permiso de AAAS). También se muestran las posiciones de R2 y L11 en los ganglios abdominales. (B) Grabaciones intracelulares representativas de L7 y R15. La flecha indica la hora de aplicación de Ach. Uno podría continuar estas medidas para 8-10 horas.
Figura 3. Ach indujo cambios en el potencial de acción (AP) de R15. Las formas de onda del AP eran analizadas antes, durante y después de la exposición de Ach. Se muestran formas de onda representativas. ms: milisegundo, mV: milivoltio.
Figura 4. Análisis de qPCR de la expresión de CREB1 en ganglios abdominales y neuronas solas identificadas. (A)Cuantificación absoluta de la transcripción de CREB1 en los ganglios abdominales jóvenes y adultos de Aplysia. El ARN total fue aislado usando el protocolo estándar de Trizol según lo descrito en los métodos. Se utilizó 1 μg de ARN total para sintetizar ADNc, seguido de la amplificación por PCR en tiempo real utilizando cebadores CREB1. (B)Cuantificación absoluta de la transcripción de CREB1 en neuronas individuales identificadas de aplysiavieja. El ARN total fue sujetado a dos redondos de amplificación in vitro antes de síntesis del cDNA. Se utilizó 1 μg de aRNA para sintetizar ADNc, seguido de la amplificación por PCR en tiempo real utilizando cebadores CREB1.
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Discussion
La neurona R15 participa en la regulación de los sistemas cardiovascular, digestivo, respiratorio y reproductivo30. Una actividad que estalla regularmente rítmica del AP es una característica de R15. Como se muestra en la sección de resultados, el registro emparejado de R15 y L7 muestran que la preparación de los ganglios ha preservado la actividad de las neuronas R15. Las neuronas R15 y L7 respondieron apropiadamente a Ach. Esta preparación de los ganglios se podía mantener hasta 8-10 horas y la actividad electrofisiológica se podía supervisar continuamente. Así, uno podría estudiar los efectos electrofisiológicos de la exposición breve del neurotransmisor (expuesta localmente a una neurona específica o al baño) por un largo período de tiempo. Además, uno podría estudiar los efectos de la exposición a múltiples neurotransmisores (simultáneamente o en tándem) en la misma neurona sobre las propiedades de disparo de sí mismo o la neurona seguidora o ambos.
Un ejemplo de mediciones de expresión génica por qPCR se muestra en la Figura 4. Dado que el contenido de ARN de una sola neurona es bajo, la amplificación in vitro es necesaria para obtener una cantidad suficiente de ARN para cuantificar la expresión de múltiples genes. Hay kits comerciales disponibles para el proceso de transcripción in vitro. La amplificación de la transcripción CREB1 se cuantificó directamente por el número de ciclos requeridos para obtener una señal de fluorescencia estandarizada, el método Ct31. El ARN amplificado de una sola neurona es suficiente para que los estudios determinen cambios en la expresión génica en un gran número de genes utilizando el microarray32 y para todo el transcriptoma mediante los análisis RNAseq33.
Una limitación de esta técnica es que esta preparación puede no preservar todas las conexiones sinápticas de las neuronas de los ganglios abdominales. Varias de las neuronas forman sinapsis con neuronas en otros ganglios y en la preparación de los ganglios se perderán estas conexiones a larga distancia. Sin embargo, la metodología aquí descrita podría modificarse fácilmente para incluir todo el SNC o podría integrarse fácilmente a la preparación semi-intacta13,14,16 que se describió para estudiar los cambios celulares y electrofisiológicos en el reflejo de retirada de branquias y sifones.
Los avances recientes en las técnicas genómicas nos permiten ahora obtener una visión profunda de la dinámica de expresión de los RNAs codificantes y no codificantes34. La preparación reducida que se describe aquí es ideal para estudiar los cambios temporales de la expresión génica junto con las mediciones electrofisiológicas. Por ejemplo, uno podría aplicar agentes farmacológicos y medir sus efectos sobre las propiedades eléctricas de neuronas individuales o múltiples neuronas que forman parte de los mismos circuitos neuronales y aislar neuronas individuales en diferentes momentos para el aislamiento de ARN. El efecto de la manipulación de una sola neurona (como la estimulación eléctrica o las exposiciones a agentes farmacológicos) en todo el circuito identificado podría estudiarse a nivel de cambios en la expresión de genes específicos en neuronas individuales. Por lo tanto, esta metodología facilita la integración exitosa de metodologías electrofisiológicas y genómicas para estudiar los circuitos neuronales en Aplysia.
Este enfoque podría extenderse fácilmente al estudio de otros modelos de invertebrados como el molusco nudibranquio Tritonia, el caracol estanque Lymnaea y el caracol terrestre Hélice, cuyos sistemas nerviosos contienen varias neuronas identificadas35-57. Estos modelos también se utilizan ampliamente para el estudio del control neuronal de comportamientos como la natación de escape, la orientación del campo magnético, la formación de sinapsis, el aprendizaje y el almacenamiento de memoria. La metodología que describimos es una simple integración del análisis genómico con mediciones fisiológicas de la actividad neuronal a nivel unicelular. Una penetración más profunda en la base molecular y fisiológica del control de los nervios del comportamiento se podía obtener de tales estudios.
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Disclosures
Los autores no tienen ningún interés financiero en competencia.
Acknowledgments
Agradecemos sinceramente a la Fundación Whitehall por su apoyo financiero y fondos de inicio del Scripps Research Institute por llevar a cabo este trabajo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aplysia | National Aplysia Resource Facility, University of Miami | ||
| NaCl | SIGMA | S 3014-1KG | |
| KCl | SIGMA | P 9333-500G | |
| CaCl2•2H2O | SIGMA | C5080- 500G | |
| MgCl2•6H2O | Fisher Scientific | BP 214-501 | |
| NaHCO4 | SIGMA | S 6297-250G | |
| HEPES | SIGMA | H 3375-500G | |
| Protease | GIBCO | 17105-042 | |
| Trizol | Ambion | 15596-026 | |
| Chloroform | MP Biomedicals | 2194002 | |
| 100% Ethanol | ACROS | 64-17-5 | |
| GlycoBlue | Ambion | AM9515 | |
| 3 M NaOAc, pH 5.5 | Ambion | AM9740 | |
| Nuclease free water | Ambion | AM9737 | |
| MessageAmp II aRNA Amplification Kit | Ambion | AM1751 | |
| qScript cDNA SuperMix | Quanta Biosciences | 95048-100 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Stainless Steel Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 or | |
| 26002-20 | |||
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | Veriti Thermal Cycler | |
| 5430R Centrifuge | Eppendorf | 5430R Centrifuge | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | 7900HT Fast Real-Time PCR | |
| Amplifier | BRAMP-01R | NPI Electronics | |
| Digidata Converter | Instrutech ITC-18 | HEKA ELEKTRONIK | |
| Micro Manipulator | Patch Star | Scientifica |
References
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