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Bioengineering

Aplysia Ganglien-Vorbereitung für elektrophysiologische und molekulare Analysen einzelner Neuronen

Published: January 13, 2014 doi: 10.3791/51075
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute, Florida

Summary

Meeresschnecke Aplysia californica wurde weithin als neurobiologisches Modell für die Studien auf zellulärer und molekularer Basis des Verhaltens verwendet. Hier wird eine Methodik zur Erforschung des Nervensystems von Aplysia für die elektrophysiologischen und molekularen Analysen einzelner Neuronen identifizierter neuronischer Schaltkreise beschrieben.

Abstract

Eine große Herausforderung in der Neurobiologie besteht darin, die molekularen Grundlagen neuronaler Schaltkreise zu verstehen, die ein bestimmtes Verhalten steuern. Sobald die spezifischen molekularen Mechanismen identifiziert sind, können neue therapeutische Strategien entwickelt werden, um Anomalien in bestimmten Verhaltensweisen zu behandeln, die durch degenerative Erkrankungen oder Alterung des Nervensystems verursacht werden. Die Meeresschnecke Aplysia californica eignet sich gut für die Untersuchungen der zellulären und molekularen Verhaltensgrundlagen, da neuronale Schaltkreise, die einem bestimmten Verhalten zugrunde liegen, leicht bestimmt und die einzelnen Komponenten der Schaltung leicht manipuliert werden könnten. Diese Vorteile der Aplysie haben zu mehreren grundlegenden Entdeckungen der Neurobiologie des Lernens und Gedächtnisses geführt. Hier beschreiben wir eine Vorbereitung des Aplysia-Nervensystems für die elektrophysiologischen und molekularen Analysen einzelner Neuronen. Kurz gesagt, Ganglien aus dem Nervensystem seziert wird Protease ausgesetzt, um die Ganglienscheide so zu entfernen, dass Neuronen exponiert sind, aber neuronale Aktivität wie bei dem intakten Tier behalten. Dieses Präparat wird verwendet, um elektrophysiologische Messungen von einzelnen oder mehreren Neuronen durchzuführen. Wichtig ist, dass die Neuronen nach der Aufzeichnung mit einer einfachen Methodik direkt aus den Ganglien für die Genexpressionsanalyse isoliert werden könnten. Diese Protokolle wurden verwendet, um gleichzeitige elektrophysiologische Aufnahmen von L7- und R15-Neuronen durchzuführen, ihre Reaktion auf Acetylcholin zu untersuchen und die Expression des CREB1-Gens in isolierten Einzel-L7-, L11-, R15- und R2-Neuronen von Aplysienzu quantisieren.

Introduction

Das menschliche Gehirn ist außerordentlich komplex mit fast 100 Milliarden Neuronen und Billionen synaptischer Verbindungen. Es gibt fast eine gleiche Anzahl von nicht-neuronalen Zellen, die mit Neuronen interagieren und ihre Funktion im Gehirn regulieren. Neuronen sind in Schaltkreise organisiert, die bestimmte Verhaltensweisen regulieren. Trotz der Fortschritte in unserem Verständnis von Gehirnfunktionen und neuronalen Schaltkreisen ist wenig über die Identität von Schaltkreiskomponenten bekannt, die ein bestimmtes Verhalten steuern. Das Wissen um die Identitäten verschiedener Komponenten einer Schaltanlage wird unser Verständnis sowohl der zellulären als auch der molekularen Verhaltensgrundlagen und der Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien für neuropsychiatrische Störungen erheblich erleichtern.

Die Meeresschnecke Aplysia californica war ein Arbeitspferd zur Bestimmung neuronaler Schaltkreise, die spezifischen Verhaltensweisen zugrunde liegen1-14. Das Aplysia Nervensystem enthält etwa 20.000 Neuronen, die in 9 verschiedene Ganglien organisiert sind. Die Neuronen von Aplysia sind groß und können leicht anhand ihrer Größe, elektrischen Eigenschaften und Position in den Ganglien identifiziert werden. Aplysia hat ein reiches Repertoire an Verhaltensweisen, die studiert werden können. Eines der gut untersuchten Verhaltensweisen ist der Kiemen-Entzugsreflex (GWR). Die zentralen Bestandteile dieses Reflexes befinden sich in Bauchganglien. Komponenten der GWR-Schaltung wurden kartiert und Beiträge verschiedener Komponenten ermittelt. Wichtig ist, dass GWR-Schaltungen assoziatives und nichtassoziatives Lernen durchlaufen5,6,15-19. Jahrzehntelange Studie über diesen Reflex haben auch mehrere Signalwege identifiziert, die eine Schlüsselrolle beim Lernen und Gedächtnis20-24haben.

Mehrere verschiedene Präparate von Aplysia wurden verwendet, um zelluläre und molekulare Grundlagen der Speicherspeicherung zu studieren. Dazu gehören das intakte Tier2,3, halbintakte Zubereitung1,7,13,14,16 und Rekonstitution von Hauptkomponenten der neuronalen Schaltung25-29. Hier wird eine reduzierte Vorbereitung auf die Erforschung von Aplysia-Ganglien für die elektrophysiologischen und molekularen Analysen identifizierter neuronaler Schaltkreise beschrieben. Die folgenden vier identifizierten Neuronen wurden untersucht. R15, ein platzendes Neuron, L7 und L11, zwei verschiedene motorische Neuronen und R2, ein cholinerge Neuron wurden untersucht. R2 ist das größte Neuron, das im wirbellosen Nervensystem beschrieben wird. Kurz gesagt, beinhaltet diese Methode protease Behandlung von Ganglien, elektrophysiologische Messungen vor und nach pharmakologischen Behandlungen, und Isolierung von einzelnen Neuronen für die quantitative Analyse der Genexpression. Diese Methode ermöglicht es uns, molekulare Analysen mit gleichzeitiger Aufzeichnung von mehreren Neuronen zu kombinieren. Diese Methode wurde erfolgreich verwendet, um Reaktionen von R15 und L7 Neuronen auf Acetylcholin (Ach) durch gepaarte intrazelluläre Aufnahmen zu studieren. Nach elektrophysiologischen Messungen wurden R15 und L7 und andere identifizierte Neuronen wie L11 und R2 für die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) der Expression von CREB1 isoliert, einem Transkriptionsfaktor, der für die Speicherspeicherung wichtig ist.

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Protocol

1. Vorbereitung von Abdominal Ganglia, elektrophysiologische Messungen und Isolierung von Single Identified Neurons from Abdominal Ganglion of Aplysia californica

  1. Aplysie im Laboraquarium mit zirkulierendem künstlichem Meerwasser (ASW) bei 16 °C unter 12:12 Licht:dunkel halten.
  2. Isolierung von Bauchganglien.
    1. Anästhesisieren Sie Tiere durch Injektion von 380 mM MgCl2 Lösung für 5-10 min (entspricht 30-35% des Körpergewichts des Tieres).
    2. Identifizieren Sie das Bauchganglien basierend auf seiner Position im zentralen Nervensystem24,28.
    3. Entfernen Sie die Ganglien durch chirurgische Operation und lagern Sie sofort in künstlichem Meerwasser bestehend aus 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2, 55 mM MgCl2, 2,5 mM NaHCO3und 10 mM HEPES (pH 7.4).
  3. Protease-Behandlung.
    1. Inkubieren Bauchganglien für 30 min bei 34 °C±0,5 in einer Petrischale mit 0,1% Protease (Dispase) in ASW beschrieben oben beschrieben.
      HINWEIS: Die Menge der verwendeten Protease muss mit dem Alter und Gewicht der Tiere standardisiert werden. Im Allgemeinen würden ältere und größere Tiere mehr Protease benötigen.
  4. Entfernung von Ganglienscheide.
    1. Nach der Enzymbehandlung die Ganglien auf die Sylgard-Silikonbasis einer Zellkammer (= 1 cm; Vol. = 0,3 ml) festsetzen und mit ASW (Durchflussrate: 150 l/min) bei Raumtemperatur (18 °C±2 ) durchdringen.
      HINWEIS: Um die Sichtbarkeit der identifizierten Neuronen zu erhöhen, legen Sie das Ganglien auf die Oberseite eines Polycarbonat-Glaszylinders (Abbildung 1) (Durchmesser = 2 mm modifizierte Zellkammer), die mit einem binokularen Stereomikroskop mit 20-facher und 40-facher Vergrößerung leicht von unten beleuchtet werden kann.
    2. Entfernen Sie vorsichtig den Mantel aus dem Ganglion mit Zangen und Mikroschere.
  5. Gleichzeitige elektrophysiologische Aufzeichnung von zwei Neuronen.
    1. Identifizieren Sie Neuron von Interesse.
    2. Impale das Neuron mit einer einzigen intrazellulären scharfen Mikroelektrode mit Widerstand 10-15 M, gefüllt mit 3 M KCl-Lösung.
    3. Aufzeichnen der neuronalen Aktivität (10 kHz Bandpass) mit einem intrazellulären Aufzeichnungssystem.
    4. Verarbeiten Sie die Aufzeichnungsdaten mit einer elektrophysiologischen Software wie Axograph.
      HINWEIS: Man kann leicht Aufnahmen von mehreren Neuronen durchführen. Die Neuronen L7, L11 oder R15 und R2 lassen sich anhand ihrer Position leicht identifizieren. Für die gleichzeitige Aufnahme von zwei L7- und R15-Neuronen werden zwei Verstärker und zwei Mikromanipulatoren benötigt (Abbildung 2).
  6. Drogenanwendung.
    1. Tragen Sie ein Medikament der Wahl durch sanftePipettierung oder direkte Injektion in Neuronen in die Zellkammer auf.
    2. Führen Sie elektrophysiologische Messungen durch.
      HINWEIS: Je nach versuchsweisem Ziel könnte man verschiedene elektrophysiologische Parameter von Neuronen messen, wie z. B. die Veränderungen des Membranpotenzials (MP) oder des Aktionspotentials (AP) vor, während und nach der Anwendung des Arzneimittels.
  7. Isolierung einzelner Neuronen.
    1. Am Ende der elektrophysiologischen Experimente, stoppen Sie die Perfusion von ASW und waschen Sie das Ganglien mit 100% Ethanol.  Die Exposition gegenüber Ethanol versteinert die Neuronen und macht es mit feinen Zangen einfach, einzelne Neuronen zu entfernen, ohne andere Neuronen aus dem Ganglion zu beschädigen.
    2. Entfernen Sie einzelne Neuronen unter einem Stereomikroskop und übertragen Sie sie in eine kleine Eppendorf-Röhre, die eiskaltes 500-l-RNA-Extraktionsreagenz enthält. Isolierte Einzelneuronen können für zukünftige Analysen in RNA-Extraktionsreagenz bei -80 °C gespeichert werden.

2. RNA-Isolation aus Einzelnen Neuronen und Genexpressionsanalyse durch quantitative Real Time PCR (qPCR)

  1. Vorsichtsmaßnahmen zur Minimierung des RNA-Abbaus:
    Ribonukleasen (RNasen) abbauen die RNA und sind sehr stabile und aktive Enzyme. Führen Sie die folgenden Schritte bei der Behandlung von RNAs aus.
    1. Reinigen Sie den Arbeitsbereich und die Instrumente mit RNase-Deaktivierungsmitteln.
    2. Tragen Sie beim Umgang mit RNA jederzeit Handschuhe und wechseln Sie oft handschuhe.
    3. Verwenden Sie nur RNase-freie Kunststoffe, um RNAs zu handhaben.
  2. Isolierung der Total-RNA aus einzelnen Neuronen:
    1. Standard-Trizol-Protokoll für RNA-Isolierung kann verwendet werden, um RNAs aus einzelnen Neuronen zu isolieren. Kurz 20% v/v Chloroform zu Trizol hinzufügen, durch kurzes Wirbeln gut vermischen.
    2. Legen Sie die Rohre 10 min bei 4 °C auf den Rotator. Die Trizol-Chloroform-Mischung bei 12.000 x g 15 min bei 4 °C drehen.
    3. Sammeln Sie die wässrige Phase und übertragen Sie in ein frisches Rohr.
    4. Natriumacetatlösung (pH 5.5) zu einer Endkonzentration von 0,3 M, 100 ng/ml des Coprecipitantglycos GlycoBlue und 2,5 Volumen von 100% Ethanol hinzufügen, um DIE RNA auszufällen.
    5. Mischen Sie die Proben gut und brüten Sie bei -80 °C über Nacht.
    6. Drehen Sie die Proben bei 12.000 x g für 20 min bei 4 °C und ein kleines blaues Pellet wird an der Unterseite des Rohres sichtbar sein.
    7. Den Überstand entfernen und das Pellet mit 850 l 75% eiskaltem Ethanol bei 12.000 x g 10 min bei 4 °C waschen.
    8. Entfernen Sie den Überstand sorgfältig und trocknen Sie das RNA-Pellet für maximal 7-10 min.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die RNA nicht lange zum Trocknen als über- dasTrocknen des RNA-Pellets macht die Löslichkeit sehr schwierig.
    9. Nach dem Trocknen setzen Sie das RNA-Pellet in 10 l RNAs freies Wasser wieder auf und bestimmen die RNA-Konzentration.
      HINWEIS: Bestimmen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer. Wenn Sie die RNA nicht sofort verwenden, lagern Sie die RNA bei -80 °C.
  3. aRNA-Synthese aus einzelnen Neuronen:
    1. Amplizieren Sie die RNA (eine oder zwei Runden je nach experimentellem Ziel) mit dem handelsüblichen linearen RNA-Verstärkungssystem.
      HINWEIS: Die gesamte RNA aus einzelnen Neuronen reichte von 10-60 ng. Die erwartete Ausbeute der ersten Amplifikationsrunde beträgt 100-300 ng und die zweite Verstärkerrunde beträgt 0,8-1,5 g RNA.
  4. Reverse Transkription der RNA:
    1. Um cDNA aus aRNA zu erzeugen, verwenden Sie 1,0 g aRNA in 20 l einer umgekehrten Transkriptionsreaktion. Mehrere Kits sind für diesen Zweck im Handel erhältlich.

      HINWEIS: cDNA wurde gemäß dem Herstellerprotokoll unter Verwendung der folgenden Einstellungen auf Thermocycler synthetisiert.
      5 min bei 25 °C
      30 min bei 42 °C
      5 Min. bei 85 °C
      Halten bei 4 °C
    2. Nach dem umgekehrten Transkriptionsschritt die cDNA bei -20 °C für eine Langzeitlagerung aufbewahren.
  5. Primer-Design und Standardisierung:
    Für die Entwicklung von Primern für Echtzeitverstärkungen stehen ihnen kostenlos mehrere hervorragende Softwareprogramme zur Verfügung.
    1. Wählen Sie 18-24 mer Oligonukleotide, die 70-110 bp Amplicons produzieren und die Primer mit kommerziellen Quellen synthetisieren.
      HINWEIS: Für jedes Gen von Interesse sollten zwei bis drei Primerpaare entworfen werden. Jeder Primer-Satz muss durch qPCR standardisiert werden. Die Vorwärts- und Reverse-Primer-Paare, die für das Gen CREB1 (Abbildung 4) verwendet wurden, sind unten:

      Primer-Set 1
      Vorwärts: 5'-TGATTCTGACGCAAAGAAAAAGA-3'
      Rückseite: 5'-ACCGTGAGCAGTCAGTTGTAGA-3'
      Primer Set 2
      Vorwärts: 5'-AGGGAATGTCGATGAAAGAAGA-3'

      Umgekehrt: 5'-GACACACAGGAAGTATGCCAAA-3'
    2. Um den besten Primer auszuwählen, der für die nachgeschalteten Analysen verwendet werden soll, überwachen Sie den Ct-Wert und die Form der Amplifikationskurve in qPCR.
      HINWEIS: Primer, die Ct-Werte (Zyklusschwelle) zwischen 10-35 in der 40-Runden-Verstärkung und glatte Kurven während der exponentiellen Phase der PCR geben, gefolgt von einem glatten Plateau, sind optimal für Genexpressionsanalysen.
  6. Quantitative Real Time PCR (qPCR):
    Hinweis: Verwenden Sie geeignete Rohre oder Platten, die mit der qPCR-Maschine kompatibel sind.
    1. CDNA mit nukleasefreiem Wasser auf 5x verdünnen.
    2. Fügen Sie auf 2 l verdünnte cDNA 8 l eines qPCR-Master-Mix hinzu, der 2 lH 2O, 5 l 2x SYBR Green Master-Mix und 1,0 l von 10 m (jeweils) vorwärts und rückwärts grundiert.
    3. Schließen Sie die Rohre und versiegeln Sie die Platte nach dem Pipetieren cDNA und Master-Mix. Mischen Sie den Inhalt durch sanftes Antippen und Abdrehen bei 1.500 U/min für 30 Sek.
    4. Fahren Sie mit der Einrichtung des qPCR-Computers fort.

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Representative Results

Die Gewichte der Tiere, die in dieser Studie verwendet wurden, reichten von 100-200 g. Nach den beschriebenen Protokollen führten wir elektrophysiologische Messungen und molekulare Analysen von Neuronen von Bauchganglien durch, die von Tieren im Bereich von 2-5 g bis 200-300 g isoliert wurden.

Die Standardisierung der Proteasebehandlung ist wichtig für erfolgreiche elektrophysiologische Messungen von Neuronen in den Ganglien. Zunächst wurden mehrere Protease-Konzentrationen (Dispase) und -dauern verwendet und platzende Wirkungspotentiale aus R15-Neuronen wurden26,31registriert. Diese Messungen wurden mit direkten (ohne Proteasebehandlung) Aufnahme von den intakten Ganglien verglichen. In den folgenden Experimenten wurden die Konzentration der Protease (0,1% Protease, siehe Schritt 1.3) verwendet, die Berstpotentiale erzeugte, die mit denen vergleichbar waren, die aus exponiertem Ganglion ohne Protease gewonnen wurden.

Mit dem beschriebenen Protokoll wurden Aktionspotentiale (AP) als Reaktion auf die Ach-Exposition gegenüber R15, einem cholinergen Neuron und L7, einem motorischen Neuron, das nicht auf Ach reagiert, aufgezeichnet. Wie erwartet zeigen simultane elektrophysiologische Aufnahmen, dass Ach eine Depolarisation in R15 induziert, während sich beim Brennen von L7 nichts änderte. Abbildung 2 zeigt die Anwendung von Acetylcholin (Ach) direkt in die Zellkammer. 1 M Ach (Volumen 0,3 l) wurde direkt mit Mikropipette in die Kammer aufgetragen, um eine endgültige Konzentration von 1 mM innerhalb der Kammer zu erhalten.

Ach wurde durch Perfusion aus dem Bad abgewaschen und von R15-Neuronen wieder aufgenommen. Abbildung 3 zeigt Wellenformen, die darauf hindeuten, dass der Ach-Effekt reversibel ist. Die Analyse der Parameter AP in der Steuerung, während der Depolarisation und nach dem Waschen wird gezeigt. Während der Depolarisation wird die Amplitude verringert und die Dauer des AP deutlich erhöht.

Nach elektrophysiologischen Messungen wurden R15- und L7-Neuronen isoliert und RNAs für qPCR-Analysen vorbereitet. Eine lineare T7-RNA-Polymerase-gesteuerte Transkription mit MessageAmp II aRNA Amplification Kit von Ambion wurde zur Verstärkung von RNAs aus einzelnen Neuronen verwendet. Zum Vergleich wurden auch die identifizierten Neuronen R2 und L11 sowie die gesamte Bauchganglien von Erwachsenen (6-9 Monate alt) und Jungtieren (1-2 Monate alt) untersucht. qPCR-Verstärkung wurde in einem 7900HT Fast Real-Time PCR System unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 95 °C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen von 95 °C für 15 Sek., 60 °C für 1 min. Es gab vier biologische Repliken in dem Experiment. Jede biologische Replikation hatte vier technische Replikationen im qPCR eingerichtet. Ct-Werte aus vier Replikationen wurden gemittelt und 1/Ct wurde berechnet, um den absoluten Ausdrucksgrad von CREB1 in jeder Stichprobe zu finden (Abbildung 4). Eine Schätzung der absoluten Expressionswerte des CREB1-Gens bei jungen und erwachsenen Aplysia-Ganglien und in vier identifizierten Einzelneuronen wurde durch den Ct-Wert überwacht, der aus qPCR-Messungen gewonnen wurde.

Die beginnende mRNA-Konzentration war bei jungen und erwachsenen Bauchganglien gleich. Das gleiche vorwärts und umgekehrte CREB1 Primer-Set wurden in allen qPCRs verwendet, sowohl in Studien mit Ganglien als auch in einzelnen Neuronen. Die Ct-Werte sind zwischen jungen und erwachsenen Bauchganglien sehr ähnlich. In ähnlicher Weise wurden Ct-Werte bei einzelnen Neuronen gemessen, bei denen die Anfangsgesamt-mRNA-Konzentrationen niedrig waren und zwei Verstärkerrunden eine gute Menge an RNAs für die cDNA-Synthese ergaben. Die Ct-Werte der CREB1-Verstärkung legten nahe, dass die CREB1-Expression in R15- und L7-Neuronen vergleichbar ist, während R2 und L11 signifikante Unterschiede in der Expression im Vergleich zu L7 oder R15 aufwiesen (Student es T test, p<0.05) (Abbildung 4).

Figure 1
Abbildung 1. Mikroskopstadium und Perfusionssystem für Ganglienelektrophysiologie. Perfusionssystem und -stufe wurden mit Plexiglas hergestellt und sind transparent. Dieses Setup ist auf einem Metallblock (nicht gezeigt) montiert, um Position zu halten. Der Metallblock ist so ausgelegt, dass Proben von unten beleuchtet werden können. Es wird ein elektrophysiologisches Berstmuster der Probe aus R15-Neuron gezeigt.

Figure 2
Abbildung 2. Gleichzeitige Aufnahme von L7 und R15 Neuron von Bauchganglien. (A) Karikatur von Bauchganglien, die die Position von L7- und R15-Neuronen zeigen (modifiziert von Kandel 2001, mit Genehmigung von AAAS nachgedruckt). Gezeigt werden auch die Positionen von R2 und L11 in den Bauchganglien. (B) Repräsentative intrazelluläre Aufzeichnungen aus L7 und R15. Pfeil gibt die Zeit der Ach-Anwendung an. Man könnte diese Messungen für 8-10 Stunden fortsetzen.

Figure 3
Abbildung 3. Ach induzierte Veränderungen des Aktionspotenzials (AP) von R15. AP-Wellenformen wurden vor, während und nach der Ach-Exposition analysiert. Repräsentative Wellenformen werden angezeigt. ms: Millisekunde, mV: Millivolt.

Figure 4

Abbildung 4. qPCR-Analyse der Expression von CREB1 in Abdominalganglien und einzelnen identifizierten Neuronen. (A) Absolute Quantifizierung der CREB1-Transkription in der jungen und erwachsenen Bauchganglien von Aplysia. Total RNA wurde mit dem Standard-Trizol-Protokoll isoliert, wie in den Methoden beschrieben. Zur Synthese von cDNA wurde 1 g der gesamten RNA verwendet, gefolgt von der Echtzeit-PCR-Verstärkung mit CREB1-Primern. (B) Absolute Quantifizierung der CREB1-Transkription in identifizierten Einzelneuronen der alten Aplysie. Die gesamte RNA wurde vor der cDNA-Synthese zwei Runden in vitro-Amplifikation unterzogen. Zur Synthese von cDNA wurde 1 g aRNA verwendet, gefolgt von der Echtzeit-PCR-Verstärkung mit CREB1-Primern.

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Discussion

Das Neuron R15 ist an der Regulierung von Herz-Kreislauf-, Verdauungs-, Atem- und Fortpflanzungssystemenbeteiligt 30. Eine regelmäßig rhythmische Berstaktivität des AP ist ein Merkmal von R15. Wie im Ergebnisbereich gezeigt, zeigen gepaarte Aufnahmen von R15 und L7, dass das Ganglienpräparat die Aktivität von R15-Neuronen erhalten hat. R15 und L7 Neuronen reagierten angemessen auf Ach. Diese Ganglienpräparation konnte bis zu 8-10 Stunden aufrechterhalten werden und die elektrophysiologische Aktivität konnte kontinuierlich überwacht werden. So könnte man die elektrophysiologischen Wirkungen einer kurzen Neurotransmitter-Exposition (lokal einem bestimmten Neuron oder dem Bad ausgesetzt) über einen längeren Zeitraum untersuchen. Darüber hinaus könnte man die Auswirkungen der Exposition gegenüber mehreren Neurotransmittern (gleichzeitig oder im Tandem) auf das gleiche Neuron auf die Feuereigenschaften von sich selbst oder dem Follower-Neuron oder beidem untersuchen.

Ein Beispiel für Genexpressionsmessungen durch qPCR ist in Abbildung 4dargestellt. Da der RNA-Gehalt eines einzelnen Neurons gering ist, ist eine In-vitro-Verstärkung notwendig, um eine ausreichende Menge an RNA für die Quantifizierung der Expression mehrerer Gene zu erhalten. Kommerzielle Kits sind für den In-vitro-Transkriptionsprozess verfügbar. Die Verstärkung des CREB1-Transkripts wurde direkt durch die Anzahl der Zyklen quantifiziert, die erforderlich sind, um ein standardisiertes Fluoreszenzsignal, die Ct-Methode31,zu erhalten. Die verstärkte RNA aus einem einzelnen Neuron reicht aus, um Genexpressionsänderungen in einer großen Anzahl von Genen mit Mikroarray32 und für das gesamte Transkriptom durch RNAseq-Analysen33zu bestimmen.

Eine Einschränkung dieser Technik ist, dass diese Vorbereitung nicht alle synaptischen Verbindungen der Neuronen der Bauchganglien bewahren kann. Mehrere der Neuronen bilden Synapsen mit Neuronen in anderen Ganglien und in der Ganglienvorbereitung werden diese Fernverbindungen verpasst. Die hier beschriebene Methodik könnte jedoch leicht an das gesamte ZNS angepasst werden oder leicht in die halbintakte Zubereitung13,14,16 integriert werden, die beschrieben wurde, um zelluläre und elektrophysiologische Veränderungen des Kiemen- und Siphon-Entzugsreflexes zu untersuchen.

Jüngste Fortschritte in den Genomik-Techniken ermöglichen es uns nun, einen tiefen Einblick in die Dynamik der Expression von codierungs- und nicht kodierenden RNAs34zu erhalten. Die hier beschriebene reduzierte Präparation ist ideal für die Untersuchung zeitlicher Veränderungen der Genexpression in Verbindung mit elektrophysiologischen Messungen. Zum Beispiel könnte man pharmakologische Wirkstoffe anwenden und ihre Auswirkungen auf die elektrischen Eigenschaften einzelner Neuronen oder mehrerer Neuronen messen, die Teil derselben neuronalen Schaltkreise sind, und einzelne Neuronen zu unterschiedlichen Zeiten für die RNA-Isolierung isolieren. Die Wirkung der Manipulation eines einzelnen Neurons (z. B. elektrische Stimulation oder Exposition gegenüber pharmakologischen Wirkstoffen) auf die gesamte identifizierte Schaltung könnte auf der Ebene von Veränderungen in der Expression bestimmter Gene in einzelnen Neuronen untersucht werden. So erleichtert diese Methode die erfolgreiche Integration elektrophysiologischer und genomischer Methoden zur Untersuchung neuronaler Schaltkreise in Aplysien.

Dieser Ansatz könnte leicht auf die Untersuchung anderer wirbelloser Modelle wie Nacktschnecken-Tritonia, Teichschnecke Lymnaea und terrestrische Schnecke Helix ausgedehnt werden, deren Nervensystem mehrere identifizierte Neuronenenthält 35-57. Diese Modelle werden auch ausgiebig für die Untersuchung der neuronalen Steuerung von Verhaltensweisen wie Fluchtschwimmen, Magnetfeldorientierung, Synapsenbildung, Lernen und Speicherverwendet. Die von uns beschriebene Methodik ist eine einfache Integration der Genomanalyse mit physiologischen Messungen der neuronalen Aktivität auf Einzelzellebene. Aus solchen Studien konnte ein tieferer Einblick in die molekularen und physiologischen Grundlagen der neuronalen Verhaltenskontrolle gewonnen werden.

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Disclosures

Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgments

Wir danken der Whitehall Foundation aufrichtig für ihre finanzielle Unterstützung und Start-up-Mittel vom Scripps Research Institute für die Durchführung dieser Arbeit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aplysia National Aplysia Resource Facility, University of Miami
NaCl SIGMA S 3014-1KG
KCl SIGMA P 9333-500G
CaCl2•2H2O SIGMA C5080- 500G
MgCl2•6H2O Fisher Scientific BP 214-501
NaHCO4 SIGMA S 6297-250G
HEPES SIGMA H 3375-500G
Protease GIBCO 17105-042
Trizol Ambion 15596-026
Chloroform MP Biomedicals 2194002
100% Ethanol ACROS 64-17-5
GlycoBlue Ambion AM9515
3 M NaOAc, pH 5.5 Ambion AM9740
Nuclease free water Ambion AM9737
MessageAmp II aRNA Amplification Kit Ambion AM1751
qScript cDNA SuperMix Quanta Biosciences 95048-100
Power SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems 4367659
Forceps Fine Science Tools 11252-20
Scissors Fine Science Tools 15000-08
Stainless Steel Minutien Pins  Fine Science Tools 26002-10 or
26002-20
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler
5430R Centrifuge Eppendorf 5430R Centrifuge
7900HT Fast Real-Time PCR Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR
Amplifier BRAMP-01R NPI Electronics
Digidata Converter Instrutech ITC-18 HEKA ELEKTRONIK
Micro Manipulator Patch Star Scientifica

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cleary, L. J., Byrne, J. H., Frost, W. N. Role of interneurons in defensive withdrawal reflexes in Aplysia. Learn. Mem. 2, 133-151 (1995).
  2. Elliott, C. J., Susswein, A. J. Comparative neuroethology of feeding control in molluscs. The J. Exp. Biol. 205, 877-896 (2002).
  3. Nargeot, R., Simmers, J. Functional organization and adaptability of a decision-making network in Aplysia. Front. Neurosci. 6, 113 (2012).
  4. Baxter, D. A., Byrne, J. H. Feeding behavior of Aplysia: a model system for comparing cellular mechanisms of classical and operant conditioning. Learn. Mem. 13, 669-680 (2006).
  5. Castellucci, V., Pinsker, H., Kupfermann, I., Kandel, E. R. Neuronal mechanisms of habituation and dishabituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167, 1745-1748 (1970).
  6. Castellucci, V. F., Carew, T. J., Kandel, E. R. Cellular analysis of long-term habituation of the gill-withdrawal reflex of Aplysia californica. Science. 202, 1306-1308 (1978).
  7. Dembrow, N. C., et al. A newly identified buccal interneuron initiates and modulates feeding motor programs in Aplysia. J. Neurophysiol. 90, 2190-2204 (2003).
  8. Fredman, S. M., Jahan-Parwar, B. Command neurons for locomotion in Aplysia. J. Neurophysiol. 49, 1092-1117 (1983).
  9. Jing, J., Vilim, F. S., Cropper, E. C., Weiss, K. R. Neural analog of arousal: persistent conditional activation of a feeding modulator by serotonergic initiators of locomotion. J. Neurosci. 28, 12349-12361 (2008).
  10. McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An in vitro preparation for eliciting and recording feeding motor programs with physiological movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (4320), (2012).
  11. McPherson, D. R., Blankenship, J. E. Neuronal modulation of foot and body-wall contractions in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 67, 23-28 (1992).
  12. Miller, N., Saada, R., Fishman, S., Hurwitz, I., Susswein, A. J. Neurons controlling Aplysia feeding inhibit themselves by continuous NO production. PloS one. 6, (2011).
  13. Perrins, R., Weiss, K. R. A cerebral central pattern generator in Aplysia and its connections with buccal feeding circuitry. J. Neurosci. 16, 7030-7045 (1996).
  14. Xin, Y., Weiss, K. R., Kupfermann, I. An identified interneuron contributes to aspects of six different behaviors in Aplysia. J. Neurosci. 16, 5266-5279 (1996).
  15. Carew, T. J., Castellucci, V. F., Byrne, J. H., Kandel, E. R. Quantitative analysis of relative contribution of central and peripheral neurons to gill-withdrawal reflex in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 42, 497-509 (1979).
  16. Cohen, T. E., Kaplan, S. W., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: mechanisms contributing to habituation, dishabituation, and sensitization of the Aplysia gill-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2886-2899 (1997).
  17. Frost, L., et al. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: contribution of LE and unidentified siphon sensory neurons to mediation and habituation of the Aplysia gill- and siphon-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2900-2913 (1997).
  18. Frost, W. N., Castellucci, V. F., Hawkins, R. D., Kandel, E. R. Monosynaptic connections made by the sensory neurons of the gill- and siphon-withdrawal reflex in Aplysia participate in the storage of long-term memory for sensitization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8266-8269 (1985).
  19. Hawkins, R. D., Greene, W., Kandel, E. R. Classical conditioning, differential conditioning, and second-order conditioning of the Aplysia gill-withdrawal reflex in a simplified mantle organ preparation. Behav. Neurosci. 112, 636-645 (1998).
  20. Hawkins, R. D., Clark, G. A., Kandel, E. R. Operant conditioning of gill withdrawal in Aplysia. J. Neurosci. 26, 2443-2448 (2006).
  21. Cai, D., Chen, S., Glanzman, D. L. Postsynaptic regulation of long-term facilitation in Aplysia. Curr. Biol. 18, 920-925 (2008).
  22. Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
  23. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294, 1030-1038 (2001).
  24. Wan, Q., Abrams, T. W. Trans-synaptic plasticity: presynaptic initiation, postsynaptic memory. Curr. Biol. 18, 220-223 (2008).
  25. Bao, J. X., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Involvement of presynaptic and postsynaptic mechanisms in a cellular analog of classical conditioning at Aplysia sensory-motor neuron synapses in isolated cell culture. J. Neurosci. 18, 458-466 (1998).
  26. Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Classical conditioning analog enhanced acetylcholine responses but reduced excitability of an identified neuron. J. Neurosci. 31, 14789-14793 (2011).
  27. Martin, K. C., et al. Synapse-Specific, Long-Term Facilitation of Aplysia Sensory to Motor Synapses: A Function for Local Protein Synthesis in Memory Storage. Cell. 91, 927-938 (1997).
  28. Montarolo, P. G., et al. A critical period for macromolecular synthesis in long-term heterosynaptic facilitation in Aplysia. Science. 234, 1249-1254 (1986).
  29. Mozzachiodi, R., Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Changes in neuronal excitability serve as a mechanism of long-term memory for operant conditioning. Nat. Neurosci. 11, 1146-1148 (2008).
  30. Alevizos, A., Weiss, K. R., Koester, J. Synaptic actions of identified peptidergic neuron R15 in Aplysia. I. Activation of respiratory pumping. J. Neurosci. 11, 1263-1274 (1991).
  31. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome. Res. 6, 986-994 (1996).
  32. Moroz, L. L., et al. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
  33. Moroz, L. L., Kohn, A. B. Do different neurons age differently? Direct genome-wide analysis of aging in single identified cholinergic neurons. Front. Aging Neurosci. 2, (2010).
  34. Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Genomics and proteomics in solving brain complexity. Mol. BioSyst. , (2013).
  35. Clemens, S., Katz, P. S. Identified serotonergic neurons in the Tritonia swim CPG activate both ionotropic and metabotropic receptors. J. Neurophysiol. 85, 476-479 (2001).
  36. Murray, J. A., Hewes, R. S., Willows, A. O. Water-flow sensitive pedal neurons in Tritonia: role in rheotaxis. J. Comp. Physiol. 171, 373-385 (1992).
  37. Katz, P. S., Frost, W. N. Intrinsic neuromodulation in the Tritonia swim CPG: the serotonergic dorsal swim interneurons act presynaptically to enhance transmitter release from interneuron C2. J. Neurosci. 15, 6035-6045 (1995).
  38. Brown, G. D., Frost, W. N., Getting, P. A. Habituation and iterative enhancement of multiple components of the Tritonia swim response. Behav. Neurosci. 110, 478-485 (1996).
  39. Popescu, I. R., Frost, W. N. Highly dissimilar behaviors mediated by a multifunctional network in the marine mollusk Tritonia diomedea. J. Neurosci. 22, 1985-1993 (2002).
  40. Megalou, E. V., Brandon, C. J., Frost, W. N. Evidence that the swim afferent neurons of tritonia diomedea are glutamatergic. Biol. Bull. 216, 103-112 (2009).
  41. Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Bruno, A. M., Wang, J., Frost, W. N. Variable neuronal participation in stereotypic motor programs. PloS one. 7, (2012).
  42. Yeoman, M. S., Patel, B. A., Arundell, M., Parker, K., O'Hare, D. Synapse-specific changes in serotonin signalling contribute to age-related changes in the feeding behaviour of the pond snail. Lymnaea. J. Neurochem. 106, 1699-1709 (2008).
  43. Moroz, L. L., Dahlgren, R. L., Boudko, D., Sweedler, J. V., Lovell, P. Direct single cell determination of nitric oxide synthase related metabolites in identified nitrergic neurons. J. Inorg. Biochem. 99, 929-939 (2005).
  44. Alania, M., Sakharov, D. A., Elliott, C. J. Multilevel inhibition of feeding by a peptidergic pleural interneuron in the mollusc Lymnaea stagnalis. J. Comp. Physiol. 190, 379-390 (2004).
  45. Straub, V. A., Benjamin, P. R. Extrinsic modulation and motor pattern generation in a feeding network: a cellular study. J. Neurosci. 21, 1767-1778 (2001).
  46. Vehovszky, A., Elliott, C. J. The octopamine-containing buccal neurons are a new group of feeding interneurons in the pond snail Lymnaea stagnalis. Acta Biol. Hungarica. 51, 165-176 (2000).
  47. Jansen, R. F., Pieneman, A. W., ter Maat, A. Spontaneous switching between ortho- and antidromic spiking as the normal mode of firing in the cerebral giant neurons of freely behaving Lymnaea stagnalis. J. Neurophysiol. 76, 4206-4209 (1996).
  48. McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
  49. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Buccal neurons activate ciliary beating in the foregut of the pteropod mollusk Clione limacina. J. Exp. Biol. 212, 2969-2976 (2009).
  50. Ierusalimsky, V. N., Balaban, P. M. Primary sensory neurons containing command neuron peptide constitute a morphologically distinct class of sensory neurons in the terrestrial snail. Cell Tissue Res. 330, 169-177 (2007).
  51. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Identification of mechanoafferent neurons in terrestrial snail: response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 87, 2364-2371 (2002).
  52. Balaban, P. M., et al. A single serotonergic modulatory cell can mediate reinforcement in the withdrawal network of the terrestrial snail. Neurobiol. Learn. Mem. 75, 30-50 (2001).
  53. Ierusalimsky, V. N., Zakharov, I. S., Palikhova, T. A., Balaban, P. M. Nervous system and neural maps in gastropod Helix lucorum. 24, 13-22 (1994).
  54. Kharchenko, O. A., Grinkevich, V. V., Vorobiova, O. V., Grinkevich, L. N. Learning-induced lateralized activation of the MAPK/ERK cascade in identified neurons of the food-aversion network in the mollusk Helix lucorum. Neurobiol. Learn. Mem. 94, 158-166 (2010).
  55. Ivanova, J. L., et al. Intracellular localization of the HCS2 gene products in identified snail neurons in vivo and in vitro. Cell. Mol. Neurobiol.. 26, 127-144 (2006).
  56. Kiss, T. Evidence for a persistent Na-conductance in identified command neurones of the snail, Helix pomatia. Brain Res. 989, 16-25 (2003).
  57. Balaban, P. M. Cellular mechanisms of behavioral plasticity in terrestrial snail. Neurosci. Biobehav. Rev. 26, 597-630 (2002).

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Neurobiologie Ausgabe 83 intrazelluläre Aufzeichnung identifiziertes Neuron neuronale Schaltkreise Genexpression Wirkungspotenzial CREB Aplysia californica Genomik
<em>Aplysia</em> Ganglien-Vorbereitung für elektrophysiologische und molekulare Analysen einzelner Neuronen
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Akhmedov, K., Kadakkuzha, B. M.,… More

Akhmedov, K., Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons. J. Vis. Exp. (83), e51075, doi:10.3791/51075 (2014).

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