Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Aplysia Ganglia Forberedelse til elektrofysiologiske og molekylære analyser af enkeltneuroner

Published: January 13, 2014 doi: 10.3791/51075
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute, Florida

Summary

Marine snegl Aplysia californica har været meget anvendt som en neurobiologi model for undersøgelser på cellulære og molekylære grundlag af adfærd. Her beskrives en metode til at udforske nervesystemet i Aplysia til de elektrofysiologiske og molekylære analyser af enkeltneuroner af identificerede neurale kredsløb.

Abstract

En stor udfordring i neurobiologi er at forstå det molekylære fundament af neurale kredsløb, der styrer en bestemt adfærd. Når de specifikke molekylære mekanismer er identificeret, kan der udvikles nye terapeutiske strategier til behandling af abnormiteter i specifik adfærd forårsaget af degenerative sygdomme eller aldring af nervesystemet. Den marine snegl Aplysia californica er velegnet til undersøgelser af cellulære og molekylære grundlag for adfærd, fordi neurale kredsløb, der ligger til grund for en bestemt adfærd let kunne bestemmes, og de enkelte komponenter i kredsløbet let kunne manipuleres. Disse fordele ved Aplysia har ført til flere grundlæggende opdagelser af neurobiologi af læring og hukommelse. Her beskriver vi et præparat af aplysiens nervesystem til de elektrofysiologiske og molekylære analyser af individuelle neuroner. Kort, ganglion dissekeret fra nervesystemet er udsat for protease at fjerne ganglion kappen sådan, at neuroner er udsat, men bevarer neuronal aktivitet som i intakt dyr. Dette præparat bruges til at udføre elektrofysiologiske målinger af enkelt- eller flere neuroner. Det er vigtigt, at neuronerne efter optagelsen ved hjælp af en simpel metode kan isoleres direkte fra ganglier til genekspressionsanalyse. Disse protokoller blev brugt til at udføre samtidige elektrofysiologiske optagelser fra L7 og R15 neuroner, studere deres reaktion på acetylkolin og quantiterende udtryk for CREB1-genet i isoleret enkelt L7, L11, R15 og R2 neuroner fra Aplysia.

Introduction

Den menneskelige hjerne er ekstraordinært kompleks med næsten 100 milliarder neuroner og billioner af synaptiske forbindelser. Der er næsten et lige antal nonneuronale celler, der interagerer med neuroner og regulerer deres funktion i hjernen. Neuroner er organiseret i kredsløb, der regulerer specifik adfærd. På trods af fremskridtene i vores forståelse af hjernefunktioner og neurale kredsløb vides lidt om identiteten af kredsløbskomponenter, der styrer en bestemt adfærd. Kendskab til identiteten af forskellige komponenter i et kredsløb vil i høj grad lette vores forståelse af både cellulære og molekylære grundlag for adfærd og støtte til udvikling af nye terapeutiske strategier for neuropsykiatriske lidelser.

Den marine snegl Aplysia californica har været en arbejdshest til bestemmelse af neuronale kredsløb, der ligger til grund for specifik adfærd1-14. Aplysia nervesystemet indeholder ca 20.000 neuroner, der er organiseret i 9 forskellige ganglier. De neuroner af Aplysia er store og kan let identificeres baseret på deres størrelse, elektriske egenskaber, og position i ganglier. Aplysia har et rigt repertoire af adfærd, der kan studeres. En af de velundersøgte adfærd er gill-tilbagetrækning refleks (GWR). De centrale komponenter i denne refleks er beliggende i abdominal ganglier. Komponenterne i GWR-kredsløbet er blevet kortlagt, og bidrag fra forskellige komponenter er bestemt. Det er vigtigt, GWR kredsløb gennemgår associative og nonassociative læring5,6,15-19. Årtiers undersøgelse af denne refleks har også identificeret flere signalveje, der har en central rolle i læring og hukommelse20-24.

Flere forskellige præparater af Aplysia blev brugt til at studere cellulære og molekylære grundlag for hukommelse opbevaring. Disse omfatter intakt dyr2,3, semi-intakt forberedelse1,7,13,14,16 og rekonstituering af større komponenter af neurale kredsløb25-29. En reduceret forberedelse til at udforske Aplysia ganglier til de elektrofysiologiske og molekylære analyser af identificerede neuronale kredsløb er beskrevet her. De følgende fire identificerede neuroner blev undersøgt. R15, en sprængning neuron, L7 og L11, to forskellige motoriske neuroner og R2, en cholinrgic neuron blev undersøgt. R2 er den største neuron beskrevet i hvirvelløse nervesystem. Kort sagt, denne metode indebærer protease behandling af ganglier, elektrofysiologiske målinger før og efter farmakologiske behandlinger, og isolering af enkelt neuroner til kvantitativ analyse af genekspression. Denne metode gør det muligt for os at kombinere molekylære analyser med samtidig optagelse fra flere neuroner. Denne metode blev med succes brugt til at studere responser af R15 og L7 neuroner til acetylkolin (Ach) ved parret intracellulære optagelser. Efter elektrofysiologiske målinger blev R15 og L7 og andre identificerede neuroner som L11 og R2 isoleret for kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) analyse af udtryk for CREB1, en transskriberingsfaktor, der er vigtig for hukommelseslagring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse af Abdominal Ganglia, elektrofysiologiske målinger, og isolering af enkelt identificerede neuroner fra Abdominal Ganglion af Aplysia californica

  1. Hold Aplysia i laboratoriet akvarium med cirkulerende kunstigt havvand (ASW) ved 16 °C under 12:12 lys:mørke forhold.
  2. Isolation af abdominal ganglion.
    1. Bedøve dyr ved at injicere 380 mM MgCl2 opløsning i 5-10 min (svarende til 30-35% af dyrets kropsvægt).
    2. Identificer abdominal ganglion baseret på dens position i centralnervesystemet24,28.
    3. Fjern ganglier ved kirurgisk operation og opbevar straks i kunstigt havvand bestående af 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2,55 mM MgCl2, 2,5 mM NaHCO3og 10 mM HEPES (pH 7,4).
  3. Protease behandling.
    1. Abdominal ganglion inkuberes i 30 minutter ved 34 °C±0,5 i en petriskål med 0,1% protease (dispase) fortyndet i ASW beskrevet ovenfor.
      BEMÆRK: Mængden af den anvendte protease skal standardiseres med dyrenes alder og vægt. Generelt ville ældre og større dyr kræve mere protease.
  4. Fjernelse af ganglier kappe.
    1. Efter enzymbehandlingen fastgøres ganglieren til Sylgard Silicone-basen i et cellekammer (Ø= 1 cm; vol. = 0,3 ml) og perfuses med ASW (strømningshastighed: 150 μl/min. ved stuetemperatur (18 °C±2 ).
      BEMÆRK: For at øge synligheden af identificerede neuroner skal du placere ganglionen på toppen af en polycarbonatglascylinder (figur 1) (diameter Ø= 2 mm modificeret cellekammer), der let kan belyses fra bunden ved hjælp af et kikkert stereomikroskop med 20X og 40X forstørrelse.
    2. Fjern forsigtigt kappen fra ganglionen ved hjælp af pincet og mikroscissorer.
  5. Samtidig elektrofysiologisk optagelse fra to neuroner.
    1. Identificer neuron af interesse.
    2. Spidde neuronen med et enkelt intracellulært skarpt mikroelektronisk med modstand 10-15 MΩ fyldt med 3 M KCl opløsning.
    3. Optag neuronal aktivitet (10 kHz båndpas) ved hjælp af et intracellulært optagelsessystem.
    4. Behandl registreringsdataene ved hjælp af elektrofysiologisoftware som f.eks.
      BEMÆRK: Man kan nemt udføre optagelse fra flere neuroner. Neuroner L7, L11 eller R15 og R2 er let identificeres baseret på deres position. Der kræves to forstærkere og to mikromanipulatorer til samtidig optagelse fra to L7- og R15-neuroner (figur 2).
  6. Stof ansøgning.
    1. Påfør stof valg i cellekammeret ved blid pipettering eller injicere direkte i neuroner.
    2. Udføre elektrofysiologiske målinger.
      BEMÆRK: Afhængigt af det eksperimentelle mål kan man måle forskellige elektrofysiologiske parametre for neuroner, såsom ændringer i membranpotentiale (MP) eller handlingspotentiale (AP) før, under og efter lægemiddelapplikationen.
  7. Isolation af enlige neuroner.
    1. Ved afslutningen af de elektrofysiologiske eksperimenter skal du stoppe perfusionen af ASW og vaske ganglionen med 100% ethanol.  Udsættelse for ethanol vil forstene neuronerne og ved hjælp af fine pincet gøre det nemt at fjerne individuelle neuroner uden at beskadige andre neuroner fra ganglion.
    2. Fjern enkelte neuroner under et stereomikroskop og overfør til et lille Eppendorf rør indeholdende iskold 500 μl RNA ekstraktion reagens. Isolerede enkeltneuroner kan opbevares i RNA-ekstraktionsreagens ved -80 °C til fremtidig analyse.

2. RNA Isolation fra enkelt neuroner og genekspression analyse af kvantitative Real Time PCR (qPCR)

  1. Forholdsregler for at minimere RNA-nedbrydning:
    Ribonukleaser (RNases) nedbryder RNA og er meget stabile og aktive enzymer. Tag følgende trin under håndtering af RNA'er.
    1. Rengør arbejdsområdet og instrumenterne med RNase-deaktiveringsmidler.
    2. Brug handsker til enhver tid, mens du håndterer RNA og skifter handsker ofte.
    3. Brug kun RNase gratis plast til at håndtere RNA'er.
  2. Isolering af totalt RNA fra enkelte neuroner:
    1. Standard Trizol protokol for RNA isolation kan bruges til at isolere RNA'er fra enkelt neuroner. Kort tilføje 20% v / v af kloroform til Trizol, blandes godt ved kort hvirvelstrømning.
    2. Rørene anbringes på rotator i 10 minutter ved 4 °C. Trizol-Chloroform-blandingen drejes ved 12.000 x g i 15 minutter ved 4 °C.
    3. Saml den vandige fase og overfør til et frisk rør.
    4. Natriumacetatopløsningen (pH 5.5) tilsættes en endelig koncentration på 0,3 M, 100 ng/ml af coprecipitanten GlycoBlue og 2,5 volumener 100% ethanol for at udfælde RNA.
    5. Prøverne blandes godt og inkuberes ved -80 °C natten over.
    6. Prøverne drejes ved 12.000 x g i 20 min ved 4 °C, og en lille blå pellet vil være synlig i bunden af røret.
    7. Supernatanten fjernes, og pelletlen vaskes med 850 μl 75% iskold ethanol ved 12.000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
    8. Fjern supernatanten forsigtigt og lufttørre RNA-pellet i 7-10 min. maksimum.
      BEMÆRK: Sørg for, at RNA ikke efterlades længe til at tørre som over-tørring af RNA pellet gør opløselighed meget vanskeligt.
    9. Når RNA-pellet'en er tørret, opbruges den i 10 μl RNAse-frit vand, og RNA-koncentrationen bestemmes.
      BEMÆRK: Bestem RNA-koncentrationen ved hjælp af et spektrofotometer. Når du ikke bruger med det samme, skal du opbevare RNA ved -80 °C.
  3. aRNA syntese fra enkelte neuroner:
    1. Forstærk RNA'et (en eller to runder afhængigt af eksperimentelt mål) ved hjælp af kommercielt tilgængeligt lineært RNA-forstærkningssystem.
      BEMÆRK: Det samlede RNA fra enkelt neuroner varierede fra ~ 10-60 ng. Det forventede udbytte af første forstærkningsrunde er ~100-300 ng, og anden forstærkningsrunde er ~0,8-1,5 μg RNA.
  4. Omvendt transskribering af RNA:
    1. For at generere cDNA fra aRNA skal du bruge 1,0 μg aRNA i 20 μl af en omvendt transskriptionsreaktion. Flere kits er kommercielt tilgængelige til dette formål.

      BEMÆRK: cDNA blev syntetiseret i henhold til producentens protokol ved hjælp af følgende indstillinger på termisk cycler.
      5 min ved 25 °C
      30 min ved 42 °C
      5 min ved 85 °C
      Hold ved 4 °C
    2. Efter det omvendte transskriberingstrin skal cDNA opbevares ved -20 °C til langtidsopbevaring.
  5. Primer design og standardisering:
    Flere fremragende software-programmer er tilgængelige, gratis, for at designe primere til realtid forstærkninger.
    1. Vælg 18-24 mer oligonukleotider, der producerer 70-110 bp ampliconer og syntetisere primere ved hjælp af kommercielle kilder.
      BEMÆRK: To til tre primerpar skal designes for hvert gen af interesse. Hvert primersæt skal standardiseres af qPCR. De fremad- og omvendte primerpar, der blev brugt til genet CREB1 (Figur 4), er nedenfor:

      Primer sæt 1
      Angriber: 5'-TGATTCTGACGCAAAGAAAAGA-3'
      Omvendt: 5'-ACCGTGAGCAGTCAGTTGTAGA-3'
      Primer sæt 2
      Angriber: 5'-AGGGAATGTCGATGAAAGAAGA-3'

      Bagside: 5'-GACACACAGGAAGTATGCCAAA-3'
    2. Hvis du vil vælge den bedste primer, der skal bruges til downstream-analyserne, skal du overvåge Ct-værdien og formen på forstærkningskurven i qPCR.
      BEMÆRK: Primere, der giver Ct(Cycle threshold) værdier mellem 10-35 i de 40 runde forstærkninger og glatte kurver i pcr'ens eksponentielle fase efterfulgt af et glat plateau, er optimale til genudtryksanalyser.
  6. Kvantitativ PCR i realtid (qPCR):
    Bemærk: Brug passende rør eller plader, der er kompatible med qPCR-maskinen.
    1. CDNA fortyndes til 5x med kernefrit vand.
    2. Til 2 μl fortyndet cDNA tilsættes 8 μl af en qPCR masterblanding, der indeholder 2 μl H2O, 5 μl af 2x SYBR Grøn masterblanding og 1,0 μl 10 μM (hver) fremad- og omvendt primer.
    3. Luk rørene og forsegle pladen efter pipetter cDNA og master mix. Bland indholdet ved blid at trykke og spinde ned ved 1.500 omdrejninger i minuttet i 30 sek.
    4. Fortsæt med at konfigurere qPCR-computeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vægtene af dyr, der blev brugt i denne undersøgelse, varierede fra 100-200 g. Efter de beskrevne protokoller gennemførte vi elektrofysiologiske målinger og molekylær analyse af neuroner af abdominal ganglier isoleret fra dyr fra 2-5 g til 200-300 g.

Standardisering af protease behandling er vigtig for vellykkede elektrofysiologiske målinger af neuroner i ganglier. I første omgang blev der anvendt flere protease (Dispase) koncentrationer og varigheder, og sprængningsvirkningspotentialer fra R15 neuron blev registreret26,31. Disse målinger blev sammenlignet med direkte (uden protease behandling) optagelse fra den intakte ganglier. Koncentrationen af protease (0,1% protease, se trin 1.3), der producerede sprængningspotentialer, der kunne sammenlignes med dem, der var opnået fra eksponeret ganglion uden protease, blev anvendt i de efterfølgende eksperimenter.

Ved hjælp af den beskrevne protokol blev der registreret handlingspotentialer (AP) som reaktion på Ach-eksponering for R15, en cholinrgisk neuron og L7, en motorneurn, der ikke reagerer på Ach. Som forventet viser samtidige elektrofysiologiske optagelser, at Ach fremkalder depolarisering i R15, mens der ikke var nogen ændring i affyringen af L7. Figur 2 viser anvendelsen af acetylkolin (Ach) direkte i cellekammeret. 1 M Ach (volumen 0,3 μl) blev direkte anvendt i kammeret ved hjælp af mikropipette for at opnå en endelig koncentration på 1 mM inde i kammeret.

Ach blev vasket ud fra badet ved perfusion og registreres igen fra R15 neuroner. Figur 3 viser bølgeformer, der antyder, at Ach-effekten er reversibel. Analyse af parametrene AP i kontrol, under depolarisering og efter vask er vist. Under depolarisering er amplitude faldet, og varigheden af AP steg betydeligt.

Efter elektrofysiologiske målinger blev R15 og L7 neuroner isoleret, og RNA'er blev forberedt til qPCR-analyser. En lineær T7 RNA Polymerase-drevet transskription ved hjælp af MessageAmp II aRNA Amplification Kit fra Ambion blev brugt til at forstærke RNA'er fra enkelte neuroner. Til sammenligning blev identificerede neuroner R2 og L11 og hele abdominal ganglier fra voksne (6-9 måneder gamle) og unge dyr (1-2 måneder gamle) også undersøgt. QPCR-forstærkningen blev udført i et 7900HT fast REAL-TIME PCR-system under følgende betingelser: 95 °C i 10 min. efterfulgt af 40 cyklusser på 95 °C i 15 sek., 60 °C i 1 min. Der var fire biologiske replikater i eksperimentet. Hver biologisk replikat havde fire tekniske replikater i qPCR oprettet. Ct-værdier fra fire replikater blev gennemsnit, og 1/Ct blev beregnet for at finde det absolutte udtryksniveau for CREB1 i hver stikprøve (figur 4). Et skøn over creb1-genets absolutte ekspressionsniveauer hos unge og voksne Aplysia-ganglier, og i fire identificerede enkeltneuroner blev overvåget af Ct-værdien opnået fra qPCR-målinger.

Den begyndende mRNA-koncentration var den samme hos både unge og voksne abdominale ganglier. Det samme frem- og baksæt CREB1 primer blev brugt i alle qPCR'er, både i undersøgelser ved hjælp af ganglier og enkeltneuroner. Ct-værdierne er meget ens mellem unge og voksne abdominale ganglier. Tilsvarende blev Ct-værdier målt i tilfælde af enkelte neuroner, hvor de oprindelige samlede mRNA-koncentrationer var lave, og to runder forstærkning gav en god mængde RNA'er til cDNA-syntese. Ct-værdierne for CREB1-forstærkning antydede, at CREB1-udtrykket i R15- og L7-neuroner er sammenlignelige, mens R2 og L11 viste betydelige forskelle i udtryk sammenlignet med L7 eller R15 (Student's T-test, s<0.05) (Figur 4).

Figure 1
Figur 1. Mikroskop fase og perfusion system til ganglia elektrofysiologi. Gennemførselssystem og scene blev lavet ved hjælp af Plexiglas og er gennemsigtige. Denne opsætning er monteret på en metalblok (ikke vist) for at holde position. Metalblokken er designet således, at prøverne kan belyses fra bunden. Der vises et prøveelektrofysiologisk sprængningsmønster registreret fra R15 neuron.

Figure 2
Figur 2. Samtidig optagelse fra L7 og R15 neuron af abdominal ganglier. (A) Tegneserie af abdominal ganglier viser placeringen af L7 og R15 neuroner (ændret fra Kandel 2001, genoptrykt med tilladelse fra AAAS). Også vist er placeringen af R2 og L11 i abdominal ganglier. (B) Repræsentative intracellulære optagelser fra L7 og R15. Pil angiver tidspunktet for Ach-programmet. Man kunne fortsætte disse målinger i 8-10 timer.

Figure 3
Figur 3. Ach inducerede ændringer i aktionspotentialet (AP) af R15. AP bølgeformer blev analyseret før, under og efter Ach eksponering. Repræsentative bølgeformer vises. ms: millisekund, mV: millivolt.

Figure 4

Figur 4. qPCR analyse af udtryk for CREB1 i abdominal ganglier og enkelt identificerede neuroner. (A)Absolut kvantificering af CREB1 udskrift i den unge og voksne abdominal ganglier i Aplysia. Total RNA blev isoleret ved hjælp af standard Trizol-protokollen som beskrevet i metoderne. 1 μg af det samlede RNA blev brugt til at syntetisere cDNA, efterfulgt af realtid PCR forstærkning ved hjælp af CREB1 primere. (B) Absolut kvantificering af CREB1 udskrift i identificerede enkelt neuroner af gamle Aplysia. Total RNA blev udsat for to runder in vitro forstærkning før cDNA syntese. 1 μg aRNA blev brugt til at syntetisere cDNA, efterfulgt af realtid PCR forstærkning ved hjælp af CREB1 primere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Neuron R15 er involveret i regulering af hjerte-kar-, fordøjelses-, åndedræts- og reproduktive systemer30. En regelmæssigt rytmisk sprængning aktivitet AP er et træk ved R15. Som vist i resultatafsnittet viser parret optagelse af R15 og L7, at gangliapræparatet har bevaret aktiviteten af R15 neuroner. R15 og L7 neuroner reagerede hensigtsmæssigt på Ach. Denne ganglia forberedelse kunne opretholdes op til 8-10 timer og elektrofysiologisk aktivitet kan løbende overvåges. Således kunne man studere de elektrofysiologiske virkninger af kort neurotransmittereksponering (udsat lokalt for en bestemt neuron eller til badet) i lang tid. Desuden kunne man studere virkningerne af eksponering for flere neurotransmittere (samtidig eller i tandem) på den samme neuron på fyring egenskaber af sig selv eller follower neuron eller begge dele.

Et eksempel på målinger af genekspression ved qPCR er vist i figur 4. Da RNA-indholdet i en enkelt neuron er lavt, er in vitro-forstærkning nødvendig for at opnå en tilstrækkelig mængde RNA til kvantantiterende ekspression af flere gener. Kommercielle kits er tilgængelige for in vitro transskriberingsprocessen. Forstærkningen af CREB1-udskriften blev kvantificeret direkte af antallet af cyklusser, der kræves for at opnå et standardiseret fluorescenssignal, Ct-metode31. Det forstærkede RNA fra en enkelt neuron er tilstrækkeligt til, at undersøgelserne kan bestemme ændringer i genekspression i et stort antal gener ved hjælp af microarray32, og for hele transskriptionen ved RNAseq analyseres33.

En begrænsning af denne teknik er, at dette præparat ikke kan bevare alle de synaptiske forbindelser af neuronerne i abdominal ganglier. Flere af neuronerne danner synapser med neuroner i andre ganglier, og i gangliaforberedelsen vil disse langdistanceforbindelser blive savnet. Den metode, der er beskrevet her, kan dog let ændres til at omfatte hele CNS eller let integreres i semi-intakt præparat13,14,16, der blev beskrevet for at studere cellulære og elektrofysiologiske ændringer i gill og sifon tilbagetrækning refleks.

De seneste fremskridt inden for genomiske teknikker giver os nu mulighed for at få et dybt indblik i dynamikken i udtryk for kodning og noncoding RNA'er34. Det reducerede præparat, der er beskrevet her, er ideelt til at studere tidsmæssige ændringer i genekspression i forbindelse med elektrofysiologiske målinger. For eksempel kunne man anvende farmakologiske midler og måle deres virkninger på elektriske egenskaber af individuelle neuroner eller flere neuroner, der er en del af det samme neurale kredsløb og isolere individuelle neuroner på forskellige tidspunkter for RNA-isolation. Virkningen af manipulation af en enkelt neuron (såsom elektrisk stimulation eller eksponering for farmakologiske agenser) på hele det identificerede kredsløb kunne undersøges på niveau med ændringer i ekspressionen af specifikke gener i enkelte neuroner. Således letter denne metode vellykket integration af elektrofysiologiske og genomiske metoder til at studere neurale kredsløb i Aplysia.

Denne tilgang kunne let udvides til undersøgelse af andre hvirvelløse modeller som nudibranch mollusc Tritonia, dam snegl Lymnaea og jordsnegl Helix, hvis nervesystemer indeholder flere identificerede neuroner35-57. Disse modeller bruges også i vid udstrækning til undersøgelse af neural kontrol af adfærd såsom flugt svømning, magnetfelt orientering, synapse dannelse, læring og hukommelse opbevaring. Den metode, vi beskrev, er en simpel integration af genomanalyse med fysiologiske målinger af neuronal aktivitet på enkeltcelleniveau. En dybere indsigt i molekylær og fysiologisk grundlag for neural kontrol af adfærd kunne opnås fra sådanne undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ophavsmændene har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker oprigtigt Whitehall Foundation for deres finansieringsstøtte og opstartsmidler fra The Scripps Research Institute for at udføre dette arbejde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aplysia National Aplysia Resource Facility, University of Miami
NaCl SIGMA S 3014-1KG
KCl SIGMA P 9333-500G
CaCl2•2H2O SIGMA C5080- 500G
MgCl2•6H2O Fisher Scientific BP 214-501
NaHCO4 SIGMA S 6297-250G
HEPES SIGMA H 3375-500G
Protease GIBCO 17105-042
Trizol Ambion 15596-026
Chloroform MP Biomedicals 2194002
100% Ethanol ACROS 64-17-5
GlycoBlue Ambion AM9515
3 M NaOAc, pH 5.5 Ambion AM9740
Nuclease free water Ambion AM9737
MessageAmp II aRNA Amplification Kit Ambion AM1751
qScript cDNA SuperMix Quanta Biosciences 95048-100
Power SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems 4367659
Forceps Fine Science Tools 11252-20
Scissors Fine Science Tools 15000-08
Stainless Steel Minutien Pins  Fine Science Tools 26002-10 or
26002-20
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler
5430R Centrifuge Eppendorf 5430R Centrifuge
7900HT Fast Real-Time PCR Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR
Amplifier BRAMP-01R NPI Electronics
Digidata Converter Instrutech ITC-18 HEKA ELEKTRONIK
Micro Manipulator Patch Star Scientifica

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cleary, L. J., Byrne, J. H., Frost, W. N. Role of interneurons in defensive withdrawal reflexes in Aplysia. Learn. Mem. 2, 133-151 (1995).
  2. Elliott, C. J., Susswein, A. J. Comparative neuroethology of feeding control in molluscs. The J. Exp. Biol. 205, 877-896 (2002).
  3. Nargeot, R., Simmers, J. Functional organization and adaptability of a decision-making network in Aplysia. Front. Neurosci. 6, 113 (2012).
  4. Baxter, D. A., Byrne, J. H. Feeding behavior of Aplysia: a model system for comparing cellular mechanisms of classical and operant conditioning. Learn. Mem. 13, 669-680 (2006).
  5. Castellucci, V., Pinsker, H., Kupfermann, I., Kandel, E. R. Neuronal mechanisms of habituation and dishabituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167, 1745-1748 (1970).
  6. Castellucci, V. F., Carew, T. J., Kandel, E. R. Cellular analysis of long-term habituation of the gill-withdrawal reflex of Aplysia californica. Science. 202, 1306-1308 (1978).
  7. Dembrow, N. C., et al. A newly identified buccal interneuron initiates and modulates feeding motor programs in Aplysia. J. Neurophysiol. 90, 2190-2204 (2003).
  8. Fredman, S. M., Jahan-Parwar, B. Command neurons for locomotion in Aplysia. J. Neurophysiol. 49, 1092-1117 (1983).
  9. Jing, J., Vilim, F. S., Cropper, E. C., Weiss, K. R. Neural analog of arousal: persistent conditional activation of a feeding modulator by serotonergic initiators of locomotion. J. Neurosci. 28, 12349-12361 (2008).
  10. McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An in vitro preparation for eliciting and recording feeding motor programs with physiological movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (4320), (2012).
  11. McPherson, D. R., Blankenship, J. E. Neuronal modulation of foot and body-wall contractions in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 67, 23-28 (1992).
  12. Miller, N., Saada, R., Fishman, S., Hurwitz, I., Susswein, A. J. Neurons controlling Aplysia feeding inhibit themselves by continuous NO production. PloS one. 6, (2011).
  13. Perrins, R., Weiss, K. R. A cerebral central pattern generator in Aplysia and its connections with buccal feeding circuitry. J. Neurosci. 16, 7030-7045 (1996).
  14. Xin, Y., Weiss, K. R., Kupfermann, I. An identified interneuron contributes to aspects of six different behaviors in Aplysia. J. Neurosci. 16, 5266-5279 (1996).
  15. Carew, T. J., Castellucci, V. F., Byrne, J. H., Kandel, E. R. Quantitative analysis of relative contribution of central and peripheral neurons to gill-withdrawal reflex in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 42, 497-509 (1979).
  16. Cohen, T. E., Kaplan, S. W., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: mechanisms contributing to habituation, dishabituation, and sensitization of the Aplysia gill-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2886-2899 (1997).
  17. Frost, L., et al. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: contribution of LE and unidentified siphon sensory neurons to mediation and habituation of the Aplysia gill- and siphon-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2900-2913 (1997).
  18. Frost, W. N., Castellucci, V. F., Hawkins, R. D., Kandel, E. R. Monosynaptic connections made by the sensory neurons of the gill- and siphon-withdrawal reflex in Aplysia participate in the storage of long-term memory for sensitization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8266-8269 (1985).
  19. Hawkins, R. D., Greene, W., Kandel, E. R. Classical conditioning, differential conditioning, and second-order conditioning of the Aplysia gill-withdrawal reflex in a simplified mantle organ preparation. Behav. Neurosci. 112, 636-645 (1998).
  20. Hawkins, R. D., Clark, G. A., Kandel, E. R. Operant conditioning of gill withdrawal in Aplysia. J. Neurosci. 26, 2443-2448 (2006).
  21. Cai, D., Chen, S., Glanzman, D. L. Postsynaptic regulation of long-term facilitation in Aplysia. Curr. Biol. 18, 920-925 (2008).
  22. Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
  23. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294, 1030-1038 (2001).
  24. Wan, Q., Abrams, T. W. Trans-synaptic plasticity: presynaptic initiation, postsynaptic memory. Curr. Biol. 18, 220-223 (2008).
  25. Bao, J. X., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Involvement of presynaptic and postsynaptic mechanisms in a cellular analog of classical conditioning at Aplysia sensory-motor neuron synapses in isolated cell culture. J. Neurosci. 18, 458-466 (1998).
  26. Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Classical conditioning analog enhanced acetylcholine responses but reduced excitability of an identified neuron. J. Neurosci. 31, 14789-14793 (2011).
  27. Martin, K. C., et al. Synapse-Specific, Long-Term Facilitation of Aplysia Sensory to Motor Synapses: A Function for Local Protein Synthesis in Memory Storage. Cell. 91, 927-938 (1997).
  28. Montarolo, P. G., et al. A critical period for macromolecular synthesis in long-term heterosynaptic facilitation in Aplysia. Science. 234, 1249-1254 (1986).
  29. Mozzachiodi, R., Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Changes in neuronal excitability serve as a mechanism of long-term memory for operant conditioning. Nat. Neurosci. 11, 1146-1148 (2008).
  30. Alevizos, A., Weiss, K. R., Koester, J. Synaptic actions of identified peptidergic neuron R15 in Aplysia. I. Activation of respiratory pumping. J. Neurosci. 11, 1263-1274 (1991).
  31. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome. Res. 6, 986-994 (1996).
  32. Moroz, L. L., et al. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
  33. Moroz, L. L., Kohn, A. B. Do different neurons age differently? Direct genome-wide analysis of aging in single identified cholinergic neurons. Front. Aging Neurosci. 2, (2010).
  34. Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Genomics and proteomics in solving brain complexity. Mol. BioSyst. , (2013).
  35. Clemens, S., Katz, P. S. Identified serotonergic neurons in the Tritonia swim CPG activate both ionotropic and metabotropic receptors. J. Neurophysiol. 85, 476-479 (2001).
  36. Murray, J. A., Hewes, R. S., Willows, A. O. Water-flow sensitive pedal neurons in Tritonia: role in rheotaxis. J. Comp. Physiol. 171, 373-385 (1992).
  37. Katz, P. S., Frost, W. N. Intrinsic neuromodulation in the Tritonia swim CPG: the serotonergic dorsal swim interneurons act presynaptically to enhance transmitter release from interneuron C2. J. Neurosci. 15, 6035-6045 (1995).
  38. Brown, G. D., Frost, W. N., Getting, P. A. Habituation and iterative enhancement of multiple components of the Tritonia swim response. Behav. Neurosci. 110, 478-485 (1996).
  39. Popescu, I. R., Frost, W. N. Highly dissimilar behaviors mediated by a multifunctional network in the marine mollusk Tritonia diomedea. J. Neurosci. 22, 1985-1993 (2002).
  40. Megalou, E. V., Brandon, C. J., Frost, W. N. Evidence that the swim afferent neurons of tritonia diomedea are glutamatergic. Biol. Bull. 216, 103-112 (2009).
  41. Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Bruno, A. M., Wang, J., Frost, W. N. Variable neuronal participation in stereotypic motor programs. PloS one. 7, (2012).
  42. Yeoman, M. S., Patel, B. A., Arundell, M., Parker, K., O'Hare, D. Synapse-specific changes in serotonin signalling contribute to age-related changes in the feeding behaviour of the pond snail. Lymnaea. J. Neurochem. 106, 1699-1709 (2008).
  43. Moroz, L. L., Dahlgren, R. L., Boudko, D., Sweedler, J. V., Lovell, P. Direct single cell determination of nitric oxide synthase related metabolites in identified nitrergic neurons. J. Inorg. Biochem. 99, 929-939 (2005).
  44. Alania, M., Sakharov, D. A., Elliott, C. J. Multilevel inhibition of feeding by a peptidergic pleural interneuron in the mollusc Lymnaea stagnalis. J. Comp. Physiol. 190, 379-390 (2004).
  45. Straub, V. A., Benjamin, P. R. Extrinsic modulation and motor pattern generation in a feeding network: a cellular study. J. Neurosci. 21, 1767-1778 (2001).
  46. Vehovszky, A., Elliott, C. J. The octopamine-containing buccal neurons are a new group of feeding interneurons in the pond snail Lymnaea stagnalis. Acta Biol. Hungarica. 51, 165-176 (2000).
  47. Jansen, R. F., Pieneman, A. W., ter Maat, A. Spontaneous switching between ortho- and antidromic spiking as the normal mode of firing in the cerebral giant neurons of freely behaving Lymnaea stagnalis. J. Neurophysiol. 76, 4206-4209 (1996).
  48. McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
  49. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Buccal neurons activate ciliary beating in the foregut of the pteropod mollusk Clione limacina. J. Exp. Biol. 212, 2969-2976 (2009).
  50. Ierusalimsky, V. N., Balaban, P. M. Primary sensory neurons containing command neuron peptide constitute a morphologically distinct class of sensory neurons in the terrestrial snail. Cell Tissue Res. 330, 169-177 (2007).
  51. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Identification of mechanoafferent neurons in terrestrial snail: response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 87, 2364-2371 (2002).
  52. Balaban, P. M., et al. A single serotonergic modulatory cell can mediate reinforcement in the withdrawal network of the terrestrial snail. Neurobiol. Learn. Mem. 75, 30-50 (2001).
  53. Ierusalimsky, V. N., Zakharov, I. S., Palikhova, T. A., Balaban, P. M. Nervous system and neural maps in gastropod Helix lucorum. 24, 13-22 (1994).
  54. Kharchenko, O. A., Grinkevich, V. V., Vorobiova, O. V., Grinkevich, L. N. Learning-induced lateralized activation of the MAPK/ERK cascade in identified neurons of the food-aversion network in the mollusk Helix lucorum. Neurobiol. Learn. Mem. 94, 158-166 (2010).
  55. Ivanova, J. L., et al. Intracellular localization of the HCS2 gene products in identified snail neurons in vivo and in vitro. Cell. Mol. Neurobiol.. 26, 127-144 (2006).
  56. Kiss, T. Evidence for a persistent Na-conductance in identified command neurones of the snail, Helix pomatia. Brain Res. 989, 16-25 (2003).
  57. Balaban, P. M. Cellular mechanisms of behavioral plasticity in terrestrial snail. Neurosci. Biobehav. Rev. 26, 597-630 (2002).

Tags

Neurobiologi intracellulær optagelse identificeret neuron neurale kredsløb genekspression handlingspotentiale CREB Aplysia californica genomik
<em>Aplysia</em> Ganglia Forberedelse til elektrofysiologiske og molekylære analyser af enkeltneuroner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Akhmedov, K., Kadakkuzha, B. M.,… More

Akhmedov, K., Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons. J. Vis. Exp. (83), e51075, doi:10.3791/51075 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter