Summary

Zergliedern Angeborene Immunsystem Signaling in Viral Evasion von Zytokin-Produktion

Published: March 02, 2014
doi:

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll, um die antivirale Zytokin-Produktion in Mäusen mit einem Modell-Herpesvirus, murinen Gammaherpesvirus-68 HV68) infiziert, die für die menschliche Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus (KSHV) und Epstein-Barr-Virus (EBV) eng verwandt ist, zu messen. Mit Hilfe genetisch veränderter Mausstämme und embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF), untersuchten wir die antivirale Zytokin-Produktion in vivo und ex vivo. "Reconstituting" den Ausdruck der angeborenen Immunkomponenten in Knockout embryonale Fibroblasten von lentiviralen Transduktion, weiter wir spezifische angeborene Immunmoleküle erkennen und sezieren die wichtigsten Signalwege, die unterschiedlich regeln die antivirale Zytokin-Produktion.

Abstract

In Reaktion auf eine virale Infektion ist der Host angeborenen Immunantwort zu hoch zu regulieren die Genexpression und die Produktion antiviraler Cytokine aktiviert. Umgekehrt haben Viren komplizierte Strategien, um für das Überleben und die Fortpflanzung zu entziehen und zu nutzen Immun Signalisierung entwickelt. Viral Immunevasion und beinhaltet Abwehr und virale Steuerhinterziehung, bietet eine der faszinierendsten und dynamischen Schnittstellen, um die Wirt-Virus-Interaktion zu erkennen. Diese Studien unser Verständnis der angeborenen Immunregulation und ebnen den Weg zu neuen antiviralen Therapien zu entwickeln.

Murine γHV68 ist eine natürliche Erreger der murinen Nagetiere. γHV68 Infektion von Mäusen eine gefügig Kleintiermodell, um die antivirale Antwort auf menschliche KSHV und EBV, von denen Störung der in-vivo-Virus-Wirt-Wechselwirkungen ist nicht anwendbar zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die antivirale Zytokin-Produktion zu bestimmen. Dieses Protokoll kann auch auf andere vir angepasst werdenverwendet und Signalwege.

Vor kurzem haben wir entdeckt, dass γHV68 entführt MAVS und IKK, Schlüssel angeborenen Immunsignalkomponenten hinter der cytosolischen RIG-I und MDA5, um NFkB-Aktivierung und antivirale Zytokin-Produktion aufzuheben. Insbesondere γHV68 Infektion aktiviert IKK und die IKK phosphoryliert aktiviert RelA zu RelA Abbau beschleunigen. Als solche γ HV68 effizient entkoppelt NFkB-Aktivierung bei den vorgelagerten aktiviert IKK, negiert antivirale Zytokin-Genexpression. Diese Studie verdeutlicht eine komplizierte Strategie, bei der die vorgeschaltete angeborenen Immunaktivierung wird durch eine virale Erreger abgefangen, die unmittelbar nachgeschalteten Transkriptionsaktivierung zunichte machen und entziehen antivirale Zytokin-Produktion.

Introduction

Jüngste Studien haben die gesamten Signalkaskaden bei der Montage Host angeborenen Immunantwort beschrieben. Wohnen in unterschiedlichen Fächern, pattern recognition receptors (PRR) erkennen pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) unterschiedlicher Herkunft zu angeborenen Immunsignal 1 auslösen. Die Retinsäure-induzierte Gen I (RIG-I) und Melanom-Differenzierungsantigen 5 (MDA5) cytosolische Proteine ​​sind Sensoren, die RNA-Spezies mit spezifischen Strukturmerkmale 2 zu erkennen. Nach der Aktivierung, RIG-I interagiert mit seinem stromabwärts gelegenen MAVS Adapter, der wiederum aktiviert die IKK (IKKαβγ) und IKK-verwandten Kinase (TBK1 und IKKε, auch IKKi bekannt (auch als IPS-1, VISA, und CARDIF bekannt) )-Komplexe 3-6. Aktiviert angeborenen Immun Kinasen phosphoryliert Schlüsselregulatoren der Genexpression, darunter Transkriptionsfaktoren und deren Inhibitoren und aktivieren Transkriptionsaktivierung von Host-antivirale Gene (z. B. IL-6, TNF & #945;, CCL5 und IFN &bgr;). Diese Signalkaskaden bilden starke intrinsische angeborenen Immunantwort, die eine anti-mikrobielle Staat zu errichten, um Krankheitserreger Ausbreitung während der frühen Stadien der Infektion zu beschränken.

Murine γHV68 ist eng mit der menschlichen onkogenen KSHV und EBV zusammen. Somit γHV68 Infektion von Mäusen eine lenkbar Kleintiermodell, um die Immunantwort des Wirts gegenüber Gammaherpesvirus-Infektion in vivo 7 zu prüfen. Mit γHV68 hat unser Labor eine komplizierte Strategie aufgedeckt, wobei γHV68 entführt Gastgeber angeborenen Immun Signalisierung an Virusinfektion zu ermöglichen. Auf der einen Seite aktiviert γHV68 die Mavs-IKK Weg zum viralen Transkriptionsaktivierung über die Leitung aktiviert IKK Replikation Transaktivator (RTA), die virale Transkriptionsfaktor Schlüssel für γHV68 Replikation 8 phosphorylieren fördern. Auf der anderen Seite, Primzahlen die IKK-vermittelte Phosphorylierung RelA für Abbau-und Zeitinates NFkB-Aktivierung 9. Als solche γHV68 Infektion vermeidet effektiv antivirale Zytokin-Produktion. Interessant ist, dass ein Screening unter Verwendung einer Expressionsbibliothek von γHV68 identifiziert RTA als E3-Ligase RelA Abbau zu induzieren, und hebt NFkB-Aktivierung 10. Diese Ergebnisse enthüllen ein kompliziertes Immunevasion Strategie, bei der die vor-Immunsignalereignisse werden durch γHV68 genutzt, um den ultimativen antivirale Zytokin-Produktion zu negieren.

Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die antivirale Zytokin-Produktion in Mäusen mit γHV68 sowohl in vivo und ex viv o infiziert zu messen. In dem Protokoll weiter wir die "wiederhergestellten" Ausdruck der angeborenen Immunkomponenten in der Ko-embryonale Fibroblasten erkunden lentiviralen Transduktion, die die Funktion der spezifischen angeborenen Immunmoleküle in der Regulation des antivirale Zytokin-Produktion lokalisiert. Dieses Protokoll kann leicht auf andere Viru angepasst werdenses und Signalwege.

Protocol

Ethikerklärung: Alle Tier Arbeit wurde unter strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen in der Bedienungsanleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) der Universität von Süd-Kalifornien genehmigt. 1. Zytokin-Genexpression durch quantitative Echtzeit-PCR und Sekretion mittels ELISA in γHV68-infizierte Mäuse Anes…

Representative Results

Drei repräsentative Zahlen werden hier gezeigt, darunter Zytokin-Produktion in der Lunge von γHV68-infizierten Mavs + / + und Mavs-/ – Maus, Zytokinsekretion und Gen-Expression von γHV68-infizierten Mavs + / + und Mavs – / – MEFs und Zytokin-mRNA-Spiegel von γHV68-infizierten Mavs – / – MEFs "wiederhergestellt" mit MAVS. Diese repräsentativen Experimenten nutzen Gen-Knockout-Mäusen, die antivirale Zytokin-…

Discussion

Viral Immunevasion ist einer der dynamischsten und faszinierende Wechselwirkungen Anbindung viralen Angriff und Abwehr 9. Die Wirts angeborenen Immunkomponenten werden so strukturiert, dass die Signaltransduktion wirksam initiiert und originalgetreu übertragen. Absteckung der Hierarchie und Regulierung von Signalkaskaden ist eine herausragende Thema der angeborenen Immunität. Hier stellen wir ein Protokoll, um die regulatorischen Rolle der angeborenen Immunkomponente, MAVS, der Virushinterziehung von Zytoki…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wildtyp (Mavs + / +) und Knockout (Mavs – / -)-Mäusen, Wildtyp (Mavs + / +) und Knockout (Mavs – / -) MEFs wurden freundlicherweise von Dr. J. Chen Zhijian (Universität bereitgestellt Texas Southwestern Medical Center) 13. Diese Veröffentlichung basiert auf der Arbeit durch Zuschüsse aus NIH (R01 und R01 CA134241 DE021445) und American Cancer Society (RSG-11-162-01-MPC) finanziert basiert.

Materials

Mouse CCL5 ELISA kit R&D systems DY478
1.0 mm Zirconia/Silica beads BioSpec Products 11079110z
TRIzol Invitrogen 15596-018
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064-014
CCL5 quantitative real-time PCR primers
CCTGCTGCTTTGCCTACCTCTC
ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA

References

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Cite This Article
Zhang, J., Zhu, L., Feng, P. Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production. J. Vis. Exp. (85), e51078, doi:10.3791/51078 (2014).

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