שיטה לחקר ההשפעה של כשל שחל מושרה כימי ביכולת גופנית ולב הסתגלות בעכברים

Summary

שתי פרדיגמות תרגיל נבדקו על חדש שפותח במודל עכבר בגיל המעבר כימי שגרם לבחון את ההשפעה של גיל המעבר על יכולת גופנית והסתגלות לב לפעילות גופנית.

Abstract

הסיכון למחל לב וכלי דם (CVD) מגביר בנשים בגיל הבלות, ובכל זאת, את התפקיד של פעילות גופנית, כאמצעי מניעה לסיכון CVD בנשים בגיל הבלות לא נחקר כראוי. בהתאם לכך, אנחנו בדקנו את ההשפעה של פעילות גופני כלוב גלגל מרצון ופעילות גופני הליכון נכפתה על הסתגלות לב בעכברים בגיל המעבר. המודל מושרה הנפוץ ביותר לחיקוי גיל המעבר אצל נשים הוא מכרסם ovariectomized (OVX). עם זאת, יש במודל OVX כמה שוני מגיל המעבר בבני אדם. במחקר זה, אנו מנוהלים diepoxide 4 vinylcyclohexene-(VCD) לנקבות עכברים, אשר מאיץ את הכשל שחלה כמודל גיל המעבר חלופי לחקור את ההשפעה של פעילות גופנית בעכברים בגיל המעבר. VCD סלקטיבי מאיץ את האובדן של זקיקים ראשוניים וקמאיים וכתוצאה מכך מדינה האנדוקרינית המחקה מקרוב את ההתקדמות הטבעית ממראש לפרי שלאחר גיל המעבר בבני אדם. כדי לקבוע את ההשפעה של פעילות גופנית על פעילות גופניתקיבולת והסתגלות לב בנקבות עכברים שטופלו VCD, שתי שיטות היו בשימוש. ראשית, אנו חשופים קבוצה של עכברים שטופלו VCD ואינו מטופלים לגלגל בכלוב מרצון. שנית, השתמשנו בתרגיל הליכון נאלץ לקבוע את היכולת הגופנית בעכברים ואינם מטופלים שטופלו VCD נפרדים קבוצה נמדדים כסובלנות לעצימות אימון וסיבולת.

Introduction

התפרצות הטבעית של גיל המעבר מאופיין בדלדול של זקיקים בשחלות באמצעות קדמוניים atresia, סופו של דבר וכתוצאה מהזדקנות השחלות. בארצות הברית, מעל 30% מהחיים של נשים יוקדש בגיל הבלות. בתגובה לירידה בתפקוד השחלות, כמה השלכות פיסיולוגיות ופסיכולוגיות עלולות להתרחש, כוללים השמנה מוגברת, חוסר יציבות של כלי דם, ומצב רוח או הפרעות בשינה. בגלל עליה בהשמנת יתר / השמנה בהשוואה לעמיתיהם לפני גיל המעבר ^1,2, נשים לאחר גיל המעבר הן במיוחד רגישות יותר לתסמונת מטבולית ומחלות הרקע נלווה, כולל מחלות לב וכלי דם (CVD) ^3. יתר על כן, זה הופך ברור יותר ויותר כי שיקום לב מוצלח בחולים עם CVD כולל פעילות גופנית אירובית על בסיס קבועה, וכי הפעילות הגופנית מפחיתה את התחלואה לב וכלי דם ותמותה בנושאים אלה ^4,5. ובכל זאת, איך צ'ה היכולת הגופניתnges במהלך המעבר מראש כדי שלאחר גיל המעבר לא נחקר היטב. חשוב מכך, תפקידה של פעילות גופנית כאמצעי מניעה לסיכון CVD בנשים בגיל הבלות נשאר להפליא understudied.

המודל מושרה הנפוץ ביותר לחיקוי גיל המעבר אצל נשים הוא מכרסם ovariectomized (OVX). לאחרונה, diepoxide התעסוקתי הכימי 4 vinylcyclohexene-(VCD) הוכח במיוחד למטרת זקיקים בשחלות ראשוניות וקמאיים קטנים על ידי האצת התהליך הטבעי של אטרזיה, סופו של דבר וכתוצאה מכך כשל שחלה ללא רעילות ברורה שנמצאה ברקמות אחרות ^6. מחזור הייחום של עכברים שטופלו VCD, שהוא מקביל למחזור אדם, מפסיק בתוך 2-3 חודשים לאחר השלמת זריקות VCD, שבתורה גוררת בנסיגה הדרגתית של אסטרוגן, מחקה את פרי שלאחר גיל המעבר מעבר. לפיכך, זקיק-ימוצה, בעלי חיים השחלה-פגע קירוב אנושי הטבעי מקרובהתקדמות דרך מראש לפרי למעבר בגיל ההבלות ^7-9. יתר על כן, הוא מספק אלטרנטיבה לא ניתוחית למודל OVX צמצום סיבוכים מניתוח, כגון זיהום. במחקר זה, אנו מועסקים עכברים בגיל המעבר מושרה VCD כדי לחקור את ההשפעה של פעילות גופנית על אימוצו של הלב בעכברים בגיל המעבר.

ישנם כמה מקרים שמצביעים על הקשר בין אסטרוגן ופעילות גופני גלגל כלוב במכרסמים משני המינים ^10-13. דלדול אסטרוגן על ידי OVX כירורגית מקטין פעילות גופנית מרצון בעכברים וחולדות ^14,15. שתי שיטות של פעילות גופנית ששימשו במחקר זה על מנת לבחון את היכולת הגופנית של עכברים בגיל המעבר מושרה VCD. ריצה גלגל קייג' נחשב בדרך כלל כסוג של פעילות גופני מרצון במודלים של בעלי חיים ושבוצעה, ככל הנראה, בתנאים פחות מלחיצים. עם זאת, הריצה גלגל כלוב אינה מעידה על היכולת ביחס המימוש של בעלי חיים, אשר דורשת בעלי חיים לexercise ברמות הרבה יותר גבוהה. תרגיל הליכון כפייה שימש כדי לקבוע את היכולת הגופנית, שנמדדה כסובלנות לעצימות אימון וסיבולת. בנוסף, יש לנו הראינו בעבר כי תרגיל גלגל כלוב מספק גירוי להיפרטרופיה לבבית וצמיחת hypertrophic הזה היא מין תלוי ^16. לכן, אנחנו גם נמדדו הסתגלות לב לגלגל בכלוב תרגיל בעכברים בגיל המעבר מושרה VCD.

Protocol

כל הניסויים, הדיור, והטיפול בבעלי החיים בוצעו באמצעות פרוטוקולים שדבקו בהנחיות ובאושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת אריזונה, ועד 2011 הנחיות NIH לטיפול ושימוש בבעלי החיים במעבדה.

1. טיפול עם 4-Vinylcyclohexene Diepoxide

1. פרוטוקול VCD מינון: במנדף הכימי, להוסיף .587 מיליליטר של VCD לבקבוק נקי, להביא את הנפח הסופי ל10 מיליליטר עם שמן שומשום, ולאחר מכן מערבב על ידי היפוך בעדינות, מכסים ולאטום עם Parafilm. מעביר את הפתרון לבקבוקון מינון, לאטום אותו עם Parafilm, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 7 ימים. ודא שכל חומרים כימיים הם סטרילי.
   1. השתמש בשמן שומשום כשליטה ברכב כVCD הוא מומס בשמן שומשום. VCD חנות (MW = 140.2 g / mol, צפיפות = 1.09 גר '/ מיליליטר) ב -20 ° C.
   2. פרוטוקול הזרקת VCD: ב2 חודשים של גיל, משקל ולנהל זריקות intraperitoneal יומיות של מזג חדרVCD שבמקום במינון של 160 מ"ג / קילוגרם ל20 ימים רצופים. הזרק עכברי שליטה באופן דומה עם פתרון הרכב, שמן שומשום, בהיקף של 2.5 מיליליטר / קילוגרם.
      שים לב: במהלך תקופת ההזרקה, נסה להחליף את האתרים של הזרקה כדי להפחית את הסיכויים לזיהום מקומי. השתמש במשוואה הבאה כדי לחשב את הנפח הדרוש להזרקה: משקל גוף (g) x קילוגרם / 1,000 GX 2.5 מיליליטר / קילוגרם = נפח (מיליליטר) של פתרון להזריק וכתוצאה מכך כ 50 מיליליטר / הזרקה באמצעות מחט G 27. בשל גודלו של מחט הרדמה מקומית ולא נחוצות.
   3. ניטור מחזור ייחום: לאחר תקופת ההזרקה היא מוחלטת, לפקח על מחזורי הייחום מדי יום על ידי קבלת מריחות נרתיק. לרסן את העכברים בשיטת עורף dorsum. הכנס הטפטפת עם 0.2 מיליליטר של תמיסת מלח סטרילית לתוך פתח הנרתיק עד לעומק של 0.5 סנטימטר. Triturate מלוח (3x) ומקום 1 טיפה לשקופית ריקה. מייד להעריך דגימות מיקרוסקופיות באמצעות microsc אור סטנדרטיאופ בגודל 100X.
      הערה:. הציטולוגיה נרתיק היא נחושה בדעתה להבטיח אובדן של רכיבה על אופניים, ולכן לאמת את הכשל שחלה איור 2A ממחיש ציטולוגיה טיפוסית בנרתיק על פני שלבים שונים של מחזור הייחום בעכברים, כלומר proestrus, ייחום, metestrus, diestrus ^17-19. במהלך proestrus, תאים כוללים תאי אפיתל בעלי גרעין (איור 2 א, חיצים מצביעים על תאי בעלי גרעין); במהלך ייחום, תאים בעיקר cornified תאי אפיתל קשקש; Metestrus מאופיין בתמהיל של סוגי תאים, עם דומיננטיות של לויקוציטים; Diestrus נשלט על ידי כדוריות דם לבנות. התאמה של מטוס המוקד עשויה להידרש לדמיין תאים וגרעינים ברחבי המדגם. כפי שמודגמים באיור 2, מחזור ייחום עכברי טיפוסי הוא 4-5 ימים. עכברים נחשבים אציקליות לאחר 15 ימים רצופים בdiestrus המתמשך. ברציפות לפקח מחזורי ייחום לאורך כל תקופת הלימוד בiod כדי לאשר עדר של מחזורי ייחום בעכברים שטופל VCD.

2. תרגיל קייג' גלגל מרצון

C57BL / 6 וB6C3F1 עכברים טהורים נשיים, 7 חודשים בגיל, נחשפים לריצת גלגל כלוב מרצון. חיות בית בנפרד בכלוב (47 סנטימטר x 26 סנטימטר x 14.5 סנטימטר) עם גישה חופשית לגלגל בכלוב ל28 ימים.

1. התקנת ציוד: מנגנון גלגל כלוב מורכב מגלגל בקוטר 11.5 סנטימטר עם 5.0 סנטימטר רחב ריצת השטח מצויד בדלפק מגנטי דיגיטלי המופעל על ידי סיבוב גלגל. לפני כל מבחן ריצה גלגל, לכייל את הגלגל בכלוב על פי ההנחיות של היצרן. מדוד את הקוטר הפנימי של גלגל הריצה, לחשב את ההיקף והזן את הערך הזה לדלפק הדיגיטלי כגודל גלגל.
   1. צרף את חלק המחשב של הדלפק המגנטי הדיגיטלי לדוכן הגלגל באמצעות קלטת.
   2. צרף את יציאת המחשביון של הדלפק המגנטי הדיגיטלי לדוכן הגלגל באמצעות קלטת.
   3. צרף את המגנט החופשי של הדלפק המגנטי הדיגיטלי לבר המרכזי באותו הצד כמו המגנט הבריק למחשב, שוב מקליט מספיק כדי להגן על המגנט מלעיסת נזק. צריכים להיות ממוקמים המגנטים, כך שכל סיבוב של ההגה שתועד על ידי המחשב ללא כל הפרעה או התנגדות כדי להשלים סיבוב הגה.
      הערה: סרט דביק כבר השתמש בהצלחה כדי לצרף את הרכיבים של הדלפק המגנטי הדיגיטלי לגלגל הריצה. מקליטה צריכה להיות מספיק כדי לכסות לחלוטין את המגנט ולמנוע נזק מהלעיסה על ידי בעלי החיים. המגנט צריך להיות ממוקם קרוב ככל האפשר לגלגל בלי להפריע את תנועתו. עם זאת, ההגדרה צריכה להיות במעקב היומיומי ללעיסת נזק ולתקן במידת צורך.
   4. הר את הגלגל לכלוב על ידי הזזה של הגלגל לעמוד דרך החיווט העליון של כלוב בעלי החיים. אבטח את עמדת הגלגל כדי לאהוא כלוב חיווט עם קליפים קלסר.
      הערה: הסרטון צריך להיות בחלק העליון של החיווט, הרחק מבעלי החיים. להאכיל את חלק מחשב וכל כבל נוסף באמצעות החיווט של הכלוב. מקם את המחשב והכבל עודף מהישג ידם של בעלי החיים. ניתן לעשות זאת על ידי הצבת פלסטיק בגודל בינוני שוקל צלחת על גבי החיווט של הכלוב כדי להחזיק את המחשב וכבל עודף.
2. פעילות גופנית: להמלטה נתון, באופן אקראי להקצות לעכברים או השליטה בישיבה או משטר התעמלות. תן את כל חיות מים וכרצונך מודעת צ'או מכרסמים קשיחים רגיל.
   1. באופן ידני להקליט ערכים יומיים לרץ למרחקים (קילומטר / יום) וסה"כ זמן ריצה (שעה / יום), שניתן על ידי הדלפק המגנטי. ערכי שיא מרחק וזמן בתוך אותה מסגרת זמן 1 שעות בכל יום לערכים מדויקים ועקביים לכל האורך 28 היום של תקופת המימוש. ברור (אפס) הדלפק המגנטי לאחר ההקלטה של ​​כל יום כדי להבטיח קריאה מדויקת המעקבing יום.
   2. לחשב את הערכים הממוצע של מרחק ומהירות עבור כל קבוצה. לחשב את המהירות המבוססת על ערכים המסוימים של מרחק וזמן בכל יום לכל עכבר. ניתן להציג נתונים כמו יומי או שבועי ממוצע עבור כל פרמטר נמדד.
3. קציר רקמות: בתום תקופת המימוש הספציפי, להרדים ימומש ובעלי חיים שליטה בישיבה בתוך 30 דקות של ההסרה מכלובים על ידי נקע בצוואר הרחם בהרדמה בשאיפה. שוקל מסת גוף ואת לבם במהירות בלו, שרירי שלד, והשחלות.
   1. בעת קצירת רקמות, הר ולהכתים את השחלות שנאספו עם hemotoxylin ו eosin (H &E; איור 2C). תחת הגדלה, לספור ולסווג את הזקיקים כ,,, או antral המשניים העיקריים בראשיתי עבור כל חיה ולשלוט טופלו VCD ^20. זקיק קדמוני מכיל ביצית קטנה ראשונית, שכבה אחת של תאי granulosa שטוחים או קשקש התנגדו באופן הדוק לביצית, והבזלייםlamina. זקיק ראשוני מוגדר על ידי הנוכחות של תאי granulosa cuboidal אחד או יותר שמסודרות בשכבה אחת המקיפה את הביצית. זקיק משניים מכיל תאי granulosa שיוצרים שכבות מרובות סביב הביצית, וtheca. זקיק antral מאופיין בחלל או "antrum" המכיל נוזל.
   2. שתחתוך את הלב, לעשות חתך המדיאלי בצד הגחון ולדמיין את הלב לאחר שפתח את הסרעפת. מהירות בלו הלב בבסיס והמקום בופר פוספט הקר מספיק לשטוף החוצה דם חדרית שיורית. חתוך את הלב של רקמה עודפת, לשקול את כל הלב וSnap-הקפאה בחנקן נוזלי.
   3. לשטוף את כל הרקמות נכרתה אחרות עם פתרון הותאם קר כקרח פוספט שנאגרו מלוח (PBS), ולהצמיד הקפאה בisopentane מקוררת בחנקן נוזלי.

3. תרגיל הליכון כפייה

1. כאשר מעסיק לא הפרדיגמה תרגיל נאלץo למדוד את היכולת הגופנית, להשתמש הליכון ולהגדיר באופן הבא:
   1. מניחים רשת התחשמלות בבסיס רמפת הליכון. ההלם הזה שנוצר משמש כגירוי לפעילות גופנית. עוצמת ותדירות הגירויים החשמליים נשלטות באופן ידני על ידי המשתמשים. ניתן להפעיל או להשבית רשתות בנפרד עבור כל מסלול. כל איסוף הנתונים נעשה באופן ידני.
   2. מעת לעת, כייל את ההליכון על פי ההנחיות של היצרן.
      1. ודא שהמתג בלוח הקדמי הליכון בקר מוגדר "עצור".
      2. חיישן מהירות במקום lane1 חגורת הליכון ומאובטח להדק עם אגוז בורג בעמדה שמוצגת להלן.
      3. שימוש בחיוג בלוח הקדמי הליכון Controller, להתאים את המהירות ל88.7 מ '/ דקה לאחר מכן, קבע את תדירות הגירוי החשמלית ל2 הרץ בלוח קדמי הליכון Controller.
      4. לחץ על כפתור "RESET מד המרחק" לאתחל הליך כיול.
         
2. הסתגלות: להסתגל עכברים להליכון 3-7 ימים לפני הניסוי יומי. לשם כך, עכברי מקום בהליכון עם הרשתות ללא ניע והלם החגורה כבוי, אבל עם מנוע החגורה ב( רעש). השאר עכברים ללא הפרעה במשך לפחות 15 דקות.
3. להתחמם: חימום צעדים כמו שימוש בפרוטוקול זה הם כדלקמן:
   1. מניחים כל עכבר על ההליכון. השבת את רשת ההלם ולהגדיל את מהירות החגורה עד 4 מ '/ דקה ל15 דקות.
   2. אפשר רשת ההלם ולשמור על מהירות חגורה ב4 מ '/ דקת מהירות חגורה עבור נוספת 10 דקות.
4. משטרי אימוני תרגיל
   1. מעקב חם, לשמור על רשתות הלם ובלהגדיל את מהירות החגורה עד 5 מ '/ דקה ל15 דקות.
   2. להגדיל את מהירות חגורה ל15 מ '/ דקה ל15 דקות נוספות.
   3. לאחר אימון, להעביר עכברים חזרה לכלובים שלהם.
      שים לב: במחקר זה, אימון תרגיל בוצע ביום למשך השבוע 1.
   4. משטר חריף תרגיל: משטר אימונים חריפים נועד כדי לקבוע את ההשפעות קצרה וארוך טווח של מתח גופני קיצוני.
      1. מעקב חם, להגביר את מהירות החגורה מ -5 מ '/ דקה ל10, 15, 20, 25, ו30 מ' / דקה ב10 מרווחי דקות.
         הערה: לסיים תרגיל אם עכברים הם לא יוכלו להמשיך סימני ריצה או מופע של תשישות או מצוקה. במחקר שלנו, רוב בעלי החיים נעצרו ב25 מ '/ דקה, ולא בבעלי חיים עברו 30 מ' / דקת במה.
      2. בדוק את כל עכבר שלוש פעמים, מה שמאפשר 2-3 ימים בין כל בדיקה. חישוב ערכים ממוצע על פני כל exerמפגשי CISE לכל עכבר.
   5. משטר אימוני סיבולת: פרוטוקול אימוני סיבולת נועד להכשיר עכברים לחשיפה ממושכת לגירוי הפעילות הגופנית על הליכון. סוג זה של פרוטוקול בדיקות את היכולת לסבול את ההשפעות ארוך הטווח של מתח פעילות גופני מתון.
      1. תתחיל עם מהירות החגורה התוותה במהלך תקופת החימום, 4 מ '/ דקה.
      2. בהדרגה להגדיל את מהירות חגורה ידי 1m/min עד מהירות סופית של 20 מ '/ דקה הוא הגיע. משך זמן כולל של פרוטוקול מחקר טיפוסי הוא 50 דקות.
      3. אחרי משטר אימונים, להעביר עכברים חזרה לכלובים שלהם.
         שים לב: הפעלת עכברים לתשישות הוא התחמק. אם בשלב כלשהו במהלך ניסוי עכבר מראה סימנים של תשישות, לבטל את רשת ההלם ולאפשר העכבר כדי לנוח ולהתאושש.

4. נתונים וניתוח סטטיסטי

1. תוצאות הנוכחיות כממוצע ± SEM ולהשתמש 2-way ANOVA (קבוצת הטיפול וexercise כגורמים עיקריים) ואחריו שלאחר בדיקת הסטודנטים, ניומן Keuls הוק או מבחן t של סטודנט כדי להשוות הבדלים בין ערכים הממוצעים.
2. לקבוע את אחוז השינוי במסת לב עם פעילות גופנית על ידי השוואת המסה של כל חיה למימוש למסת הלב הממוצעת של הקבוצה בישיבה. ההבדל במסת לב לאחר מכן הביע כשינוי אחוזים מבעלי חיים כרוך בישיבה לכל חיה, בהתאמה. ערכי p של <0.05 נחשבים משמעותיים מבחינה סטטיסטית.

Representative Results

פרוטוקול ניסוי טיפוסי, כמו זה המשמש במחקר זה, בא לידי ביטוי באיור 1. בעקבות 20 ימים רצופים של טיפול VCD, ציטולוגיה נרתיק הייתה בשימוש כדי לקבוע את קיומו או היעדריו של מחזוריות בעכברים מוזרק VCD; עכברים שהוזרק רכב גם היו במעקב. השלב במחזור הייחום נקבע על ידי חלקם של תאי אפיתל, תאי האפיתל cornified, וכדוריות דם לבנות במריחה בנרתיק (איור 2 א). הנוכחות של תאי אפיתל רק cornified הצביעה בעכבר היה בייחום, ולכן עדיין היה רכיבה על אופניים. מחזור הייחום בעכברים בדרך כלל נמשך 4 ימים, ולכן VCD הזריק חיות נחשבו אציקליות לאחר 15 ימי diestrus המתמשך, שבו ציטולוגיה נרתיק מתגלה ברוב של לויקוציטים (איור 2 א). מחזור הייחום של עכברים שטופלו VCD הפך לא סדיר, ולאחר מכן חדל בתוך 2-3 חודשים לאחר תחילת זריקות VCD (איור 2) (איור 2C) מלא.

כדי לבדוק את ההשפעה של כשל שחלה מושרה VCD על ביצועי פעילות גופני, אנו אקראיים 7 בן חודש VCD ועכברים שטופלו רכב (שני זנים, C57BL / 6 וB6C3F1) לשתי קבוצות תרגיל גלגל בישיבה או בכלוב 4-6 שבועות הבאים הפסקה של רכיבה על אופניים (איור 1). ערכי פעילות גופני מדי יום נרשמו לזמן ומרחק לכל בעל חיים למימוש בכל תקופת מימוש 4 שבועות. ממוצעים שבועי של ערכי ריצה יומיים למרחק, זמן ומהירות מוצגים באיור 3 לC57BL / 6 עכברים שטופלו עם רכב או VCD. לא ראו הבדלים משמעותיים בביצועי פעילות גופני נמדדו על ידי זמן יומי ממוצע, מרחק ומהירות על הגלגל בכלוב בין VCD ו-קבוצות רכב שטופלה בשני C57BL / 6 או עכבר B6C3F1זן (איור 4 א). מהירות ריצה בגלגל המחושבת גדלה בהדרגה לאורך תקופת ההרצה של 4 השבועות כפי שמוצג ¹⁶ בעבר, אך לא היו שונים משמעותי בין קבוצות ניסוי. מחקרים אלו מצביעים על ההשפעה של כשל שחלה מושרה VCD על תרגיל גלגל כלוב מרצון מתעלה לפחות 2 זני עכבר.

בעקבות משך פרוטוקול פעילות גופני גלגל כלוב מרצון, morphometrics הגוף הוקלטו והלבבות היו נכרת במהירות ומשקלו. הראינו בעבר כי פעילות גופנית גלגל כלוב מרצון גורמת לעלייה במסת לב ^16. כאן, אנו מראים גם היפרטרופיה לבבית בתגובה לפעילות גופנית גלגל כלוב נמדדה לפי משקל מוחלט לב (HW) וHW המנורמל לאורך השוקה (TL) (טבלה 1). מסת הלב המוחלטת ויחס HW / TL היו גדולים יותר באופן משמעותי וברכב שטופלו עכברי VCD בהשוואה לעמיתיהם בישיבה. עם זאת, לא היו צפחותהבדלי rable בהיפרטרופיה לבבית בין שליטה ועכברי כשל שחלה מושרה VCD הבא תרגיל גלגל כלוב מרצון.

בשלב הבא, שנהגנו שלא מרצון (כפייה) הליכון ריצה כדי לקבוע את היכולת הגופנית. אנו חשופים ראשון עכברים לפרוטוקול בעוצמה גבוהה שעלה בשלבים מהירות ממוצע כל 10 דקות עד אפיסת כוחות. בממוצע, המהירות המקסימלי של עכברים שטופלו רכב הייתה 26.7 ± 0.95 מ '/ דקה והמהירות המקסימלי של עכברים שטופלו היו VCD 28 ± 1.4 מ' / דקה לפני שהוא מותש. אנחנו השתמשנו בעצימות נמוכות פועלות ב20 מ '/ דקה (כ -80% ממשקל מקסימאלי) לassay לכושר סיבולת. כפי שניתן לראות באיור 4 ב ', לא נמצא הבדל משמעותי ביכולת פעילות גופנית בעצימות גבוהה או נמוכה נמצא בין רכב וקבוצה שטופל VCD, המציין כי היה כשל שחלה מושרה VCD אין כל השפעה על יכולת הגופנית עכבר.

לסיכום, יש גיל המעבר הנגרם על ידי טיפול VCD אין כל השפעה על r מרצון או בכפייה קיבולת unning, כמו גם את התגובה המסתגלת לב לפעילות גופנית.

איור 1. VCD-ממשל ופרוטוקול ניסוי. עכברים ניתנו VCD שמן שומשום (160 מ"ג / קילוגרם) או (שליטה ברכב) החל מהשעה 2 חודשים של גיל ל20 ימים רצופים. בעקבות זריקות VCD או כלי רכב, מחזורי ייחום היו במעקב וcyclicities נקבעו כמתואר בסעיף השיטות. אובדן תפקוד השחלות התרחש בתוך 60-90 ימים ואושר על ידי ציטולוגיה נרתיק. בגיל 7 חודשים, עכברים שנחשפו לפעילות גופני גלגל כלוב מרצון במשך 4 שבועות או נתון לפרוטוקול הפעילות הגופנית על הליכון.

"Src =" oad/51083/51083fig2highres.jpg / files/ftp_upload/51083/51083fig2.jpg "/>
. איור 2 כשל שחלה מושרה VCD בעכברים:. ציטולוגיה של מריחה בנרתיק בלא כתם מעכבר רכב מוזרק הוכחת ארבעה שלבים של מחזור הייחום: 1) proestrous, בעיקר מורכב מתאי אפיתל גרעיניים 2) ייחום, המתאפיין באו"ם nucleated-תאי cornified; 3) metestrus, בהיקף של תאי בעלי הגרעין אפיתל (חיצים), תאי האפיתל cornified בלתי גרעיניים (חיצים), וכדוריות דם לבנות; 4) diestrus, המורכב בעיקר מכדוריות הדם לבנות; ו-B:. אורך ממוצע (ימים) של מחזור הייחום של רכב וקבוצות מוזרקים VCD. מחזור אחד נמדד מהיום הראשון בייחום ליום הראשון של המחזור הבא בייחום. ציטולוגיה נרתיק החלה כ 6 שבועות לאחר תחילתה של זריקות. מחזורי הייחום של בעלי החיים, הזריק VCD להיות לא סדירים, בהשוואה לבעלי חיים שהוחדר רכבים, ולאחר מחזורי ייחום 12, ציטולוגיה של כל VCD הזריק חיות כבר לא הצביעה על האופניים C:. צביעת H & E של רקמת השחלה בגיל 8 חודשים. חתכים נעשים בעובי 5μm להגדלת רכב שטופלה (משמאל פנל) ועכברים שטופלו VCD (פנל מימין) ב20X (פנל עליון) ו200X (פנל תחתון). רקמת השחלה בהגדלה 200X מציגה מספר הזקיקים בעכברים שטופלו VCD-לעומת רכב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. ביצועי גלגל בכלוב מרצון ברכב או נקבות עכברים שטופלו VCD C57BL/6J. לוח שמאלי: ריצה למרחקים ממוצע (קילומטר /יום) לכל תקופת 1 שבוע לאורך תקופת המחקר 4 שבועות פנל התיכון:. זמן ממוצע ריצה (שעה / יום) עבור כל תקופת 1 שבוע לאורך תקופת המחקר 4 שבועות ימני פנל:. מהירות ריצה ממוצעת (קילומטר / שעה) עבור כל תקופה 1 שבוע לאורך תקופת המחקר 4 שבועות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4 גלגלים. רצון כלוב וביצועי הליכון ברכב ועכברים שטופלו VCD. : (למעלה לוח) C57BL / 6 מרחק ריצה ממוצעת (קילומטר / יום) ואת משך זמן על ההגה (שעות / יום) עבור כל 24 שעות לאורך תקופת המחקר 4 שבועות. (פנל תחתון) & #160; מרחק B6C3F1 ממוצע ריצה (קילומטר / יום) ואת המשך זמן על ההגה (שעה / יום) עבור כל 24 שעות מעל 4 שבועות תקופת מחקר ב ': C57BL / 6 פרמטרים הליכון ריצה.. זמן מרבי (למעלה לוח) ומהירות המרבית (Botoom לוח) תוך שימוש בפרוטוקולים מפורטים בסעיף השיטות.

Discussion

גם פעילות גופני גלגל בכלוב והליכון ריצת משטרי תרגיל נעשה שימוש במחקרים הקודמים שלנו ^16,21,22. כל בעלי החיים נשמרים בחדרי כושר ייעודיים כדי למזער הפרעות אנושיות או סביבתיות. כל הפרעה של בעלי החיים "קצב הביולוגי יכולה להשפיע באופן משמעותי בעלי החיים 'ביצועי פעילות גופני. לכן, יש לעשות כל משטרי הטיפול בבעלי החיים, ניטור ביצועים והקלטה, ופעילות גופנית בתוך אותה מסגרת זמן יומית. חוקרים צריכים לשאוף להימנע מלחצים מיותרים לבעלי החיים על ידי הפגנה באמצעי זהירות כגון הגבלת משך הזמן של חשיפה ללחץ ומכסה את הכלובים בעת הצורך.

תרגיל גלגל קייג'

כאשר מכינים את מנגנון הגלגל בכלוב, הגלגל צריך להיות נגיש לעכבר להר ויציאה. לא צריכים מצעים מינימאליים בחלק התחתון של הכלוב כדי למנוע עכברים מהקינון סביב ההגה ופוגע freתנועת גלגל דואר. החיישן המגנטי הושם על החלק נייח של הגלגל והמגנט מאובטח לגלגל החופשי, כדי לספור כל סיבוב של ההגה כממש את העכבר. מכשיר ההקלטה המחובר לחיישן המגנטי צריך להיות ממוקם מעל המכסה התיל של הכלוב, וכל החוטים החשופים צריכים להיות או מוקלטים או נשמרו מחוץ להישג יד מהעכברים, כדי לספק מחסום נגד לעיסת נזק. חיישן המגנט והמגנטי גם היו מודבק למבנים המתאימים למניעת נזק וגם תנועה לא רצויה. במהלך איסוף הנתונים יומי, כל החוטים המודבקים חייבים להיבדק באופן הדוק על מנת להבטיח את החוטים נותרו על כנן וצריכה להיות retaped בהתאם לצורך. מאז זה עשוי לדרוש כמה ימים לעכברים להתאקלם לסביבה החדשה ולהתחיל בפעילות גופנית קבועה, הקלטת הנתונים צריכה להיות מותאמת לכל בעל חיים בודדים. למרות שבעלי חיים נוטים לבלות שעות רבות על ההגה, רוב הריצה מתרחש בלילה. לכן, חלק מבעלי החיים עשויים לחשוף גדולותפעילות ביצועי שעות גם אם הם נראים רדומים בשעתי יום. יתר על כן, אין זה נדיר שבעלי חיים מסוימים יפגינו ריצה גלגל כלוב מוגבלת. בדרך כלל, פעילות הגלגל בכלוב שמסתכמת לסך של 1 קילומטר / יום ממוצע או פחות מזה היא התוצאה של פעילות כלוב אקראית ואינה קשור לכל גירוי ריצה משמעותי. לכן, בעלי חיים פרמטרים ריצה שנמצאים במרחק 1 / יום או 1 שעות / יום או פחות צריכים להיות שליליים בnonrunners ניתוח הנתונים הסופי.

בהתאם למטרות הספציפיות של מחקר וזנים של עכברים המעורבים אישיים, באורך של פעילות גופנית יכול להיות שונה. המחקר הקודם שלנו הראה כי עבור שני זני העכבר המעורבים, מהירות ריצה בגלגל בממוצע והמשך הזמן של פעילות גופנית על הגלגל בכלוב גדלו בהדרגה לאורך זמן והתייצבו ב -4 שבועות.

ריצה גלגל קייג' היא סוג של פעילות גופני מרצון במודלים של בעלי חיים, אשר בדרך כלל נלקח כמתבצע בתנאים פחות מלחיצים. Unlתרגיל הליכון אייק שבו ניתן מראש פרמטרים מסוימים, כל הריצה בכלוב המבחן היא בהתנדבות ובקלות מושפעת רמזים התנהגותיים או סביבתיים. לכן, ההשוואה בין הגדרות ניסויים השונות הן בדרך כלל להימנע, אלא אם כן מספרי קבוצות ניסוי גדולים נמצאים בשימוש. אזורים פוטנציאליים אחרים של מחקר שיכול להפיק תועלת מסוג זה של פעילות גופנית הם הפרדיגמה מחקרים המשלבים תגובות התנהגותיות עם השלכות פיסיולוגיות, כגון מדעי המוח הקוגניטיביים. ללימודי ניצול הפרדיגמה גלגל כלוב מרצון, השלבים הקריטיים ביותר הם כלוב שהוקם וניטור של הפעילות הגופנית.

תרגיל הליכון

צעדי הסתגלות נדרשים כדי להכין את בעלי חיים לפרוטוקול הפעילות הגופנית על הליכון. בהתאם לצורך הספציפי של המחקר הבודד, משך תקופת ההסתגלות יכול להשתנות. במחקר זה, לתקופה של שבוע אחד נבחרה כדי לאפשר לבעלי חיים לacclimאכלתי למנגנון הליכון ורעש מנוע בכלוב, תקופות להתחמם הן צעד חשוב במשטר האימונים של פעילות גופנית. בדומה לעמיתיהם אדם, העכברים חייבים להיות התחממו לפני שנכנס לכל משטרי פעילות גופני אינטנסיביים, כדי למנוע פגיעה וחפצי נתונים פוטנציאליים. במחקר זה, שהתחלנו את החגורה במהירות הנמוכה ביותר האפשרית (4 מ '/ דקה) עם רשתות ההלם כבויה במשך 15 דקות. כל העכברים המעורבים התחילו לרוץ ולכבות את החגורה. רשתות ההלם ואז היו מופעלות ומתוחזק על מהירות חגורה ב 4 מ '/ דקה. כדי להימנע מהעכברים והדגישו יתר על המידה, אנו קובעים את ההלם החשמלי ברמה קלה (1 הרץ). בתוך כמה ימים, כל העכברים מותאמים לחגורת הליכון.

משך הריצה כמו גם האצה יכול גם להיות מותאמת לכל עיצוב ניסיוני. מומלץ שיעור ההאצה מתחיל הוא 1 מ '/ דקה. נתיבי הליכון של עכברים מראים סימנים של תשישות חייבים להיות כבויים באופן מיידי. בדרך כלל סימנים של תשישות הוצגו על ידי מילce על ההליכון הם כדלקמן:

1. חשיפה ממושכת לרשת ההלם ל> 5-10 שניות,
2. אובדן של ריצה וכתוצאה מכך יכולת חשיפת רשת הלם> 5x במהלך משטר אימונים בודדים, ו
3. אובדן של ריצה וכתוצאה מכך יכולת חשיפת רשת הלם> 2 שניות לפחות פי 3 במהלך משטר אימונים בודדים.

הערכים המפורטים לעיל הוא לשמש בעיקר כקווים מנחים לניסוי ספציפי. פרמטרים אלה צריכים להיקבע עבור כל פרוטוקול פעילות גופני כפי שהוא משתנה מזן עכבר לזן עכבר, ניסוי לניסוי, וחוקר לחוקר.

בניגוד לפעילות גופני גלגל בכלוב, מחקרי הליכון יש לחזור מספר פעמים על מנת לחסל את ההשפעות של גורמים סביבתיים וביולוגיים על ביצועים בריצה. אין זה נדיר לראות תנודות בביצועים בריצה בין בדיקות אפילו לאותה חיה. מאז כל משטר אימוני ריצה חושף עכברים לstress, מרווח מנוחה הולם בין הבדיקות הכרחי. מניסיוננו, 2-3 ימים מנוחה תקופה שבין כל בדיקה היו מספיק לעכברים כדי להתאושש.

כמו תרגיל הליכון אנושי, את המהירות לתרגיל סיבולת נקבעת על ידי מיטב קצב הלב או רוויון חמצן בדם, הישג קשה מבחינה טכנית עם לימודי עכבר. השלב הקריטי ביותר של מחקרי הליכון הוא נחישות של תשישות, שלרוב נעה בין עכברים בודדים, ונקבע כ80% מהירות מקסימלי. בחוויה שלנו את ההקלטה של ​​תוצאות עשויות להיות שונה באופן משמעותי בין חוקרים בודדים, שכן הקריטריונים לתשישות הם בעיקר סובייקטיבי. לפיכך, היישום העקבי של אותם הקריטריונים במהלך ההקלטה הוא קריטי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Vinylcyclohexene diepoxide (VCD)	Sigma	V-3630
11.5 cm Diameter wheel with a 5.0 cm wide running surface	Petsmart	model 6208
Digital magnetic counter	Sigma Sport	model BC 600
Treadmill exercise	Columbus Instruments	model 1055SDRM