En metode til at undersøge virkningen af ​​Kemisk induceret ovariesvigt på arbejdskapacitet og Cardiac Tilpasning i mus

Summary

To motion paradigmer blev testet på en nyudviklet kemisk induceret menopause musemodel at undersøge virkningen af ​​overgangsalderen på arbejdskapacitet og hjerte-tilpasning til at udøve.

Abstract

Risikoen for hjerte-kar-sygdom (CVD) stiger hos postmenopausale kvinder, men alligevel, den rolle af motion, som en forebyggende foranstaltning for CVD risiko hos postmenopausale kvinder er ikke blevet tilstrækkeligt undersøgt. Derfor undersøgte vi effekten af ​​frivillig bur-wheel motion og tvungen løbebånd motion på hjerte-tilpasning i overgangsalderen mus. De hyppigst anvendte inducerbare model til at efterligne overgangsalderen hos kvinder er den ovarieektomiserede (OVX) gnaver. Men OVX model har et par forskelle fra menopausen hos mennesker. I denne undersøgelse har vi administreret 4-vinylcyclohexen diepoxidet (VCD) til hunmus, som accelererer ovariesvigt som alternativ overgangsalderen model til at undersøge virkningen af ​​motion i overgangsalderen mus. VCD accelererer selektivt tab af primære og primordiale follikler resulterer i en endokrin tilstand, der nøje efterligner den naturlige udvikling fra præ-til peri-til post-overgangsalderen hos mennesker. For at bestemme effekten af ​​motion på motionkapacitet og hjerte-tilpasning i VCD-behandlede hunmus blev brugt to metoder. Først, vi er udsat en gruppe af VCD-behandlede og ubehandlede mus til en frivillig bur hjul. For det andet, brugte vi tvunget løbebånd øvelse at bestemme motion kapacitet i en separat gruppe VCD-behandlede og ubehandlede mus målt som en tolerance træningsintensiteten og udholdenhed.

Introduction

Den naturlige starten af ​​overgangsalderen er kendetegnet ved nedbrydningen af ​​æggestokkene primordiale follikler gennem atresi, i sidste ende resulterer i æggestokkene ældning. I USA, vil over 30% af en kvinders levetid blive brugt postmenopausale. Som reaktion på et fald i æggestokkene funktion, kan der forekomme flere fysiologiske og psykologiske konsekvenser, herunder øget overvægt, vaskulær ustabilitet, og humør eller søvnforstyrrelser. På grund af øget fedme / overvægt i forhold til præmenopausale modstykker ^1,2, postmenopausale kvinder er særligt mere modtagelige for metabolisk syndrom og tilhørende følgesygdomme, herunder hjerte-kar-sygdom (CVD) ^3.. Desuden er det mere og mere tydeligt, at en vellykket hjerterehabilitering for patienter med CVD omfatter regelmæssig aerob motion, og at motion reducerer kardiovaskulær morbiditet og mortalitet i disse fag ^4,5. Men hvordan arbejdskapacitet changes under pre-til post-overgangsalderen overgang er ikke blevet godt undersøgt. Endnu vigtigere er, hvilken rolle motion som en forebyggende foranstaltning for CVD risiko hos postmenopausale kvinder er stadig bemærkelsesværdigt understudied.

De hyppigst anvendte inducerbare model til at efterligne overgangsalderen hos kvinder er den ovarieektomiserede (OVX) gnaver. For nylig har den erhvervsmæssige kemiske 4-vinylcyclohexen diepoxidet (VCD) vist sig at være målrettet mod små primære og primordiale ovariefollikler ved at fremskynde den naturlige proces af atresi, i sidste ende resulterer i ovariesvigt med nogen indlysende toksicitet findes i andre væv ^6. Den estrale cyklus af VCD-behandlede mus, der er analog til et menneske menstruationscyklus, ophører inden for 2-3 måneder efter afslutningen af ​​VCD injektioner, hvilket igen resulterer i en gradvis tilbagetrækning af østrogen, efterligne peri-til postmenopausale overgang. Således er en follikel-nedbryder, æggestok-intakt dyr nærmest det naturlige menneskeprogression gennem præ-til peri-til postmenopausale overgang ^7-9. Endvidere giver det en kirurgisk alternativ til OVX model reducere komplikationer fra kirurgi, såsom infektion. I denne undersøgelse har vi ansat VCD-induceret overgangsalderen mus for at undersøge virkningen af ​​motion på hjertets tilpasning i overgangsalderen mus.

Der er flere tilfælde, der tyder på sammenhæng mellem østrogen og bur hjul øvelse i gnavere af begge køn ^10-13. Østrogen udtømning ved kirurgisk OVX falder frivillig øvelse aktivitet hos mus og rotter ^14,15. To metoder til motion blev anvendt i denne undersøgelse for at afprøve udøvelsen kapacitet VCD-inducerede overgangsalderen mus. Cage hjul kører er generelt betragtes som en form for frivillig øvelse i dyremodeller og udført, formentlig under mindre stressende forhold. Men bur hjul kører, er ikke udtryk for den relative fysiske kapacitet af dyr, som kræver dyr at exerciSE ved meget højere niveauer. Tvungen løbebånd øvelse blev brugt til at bestemme motion kapacitet, målt som en tolerance træningsintensiteten og udholdenhed. Desuden har vi tidligere vist, at bur hjul motion giver et incitament til hjerte hypertrofi og dette hypertrofisk vækst er sex-afhængige ^16. Derfor har vi også målt cardiac tilpasning til bur hjul øvelse i VCD-inducerede overgangsalderen mus.

Protocol

Alle eksperimenter, bolig og omsorg for dyr blev udført ved hjælp af protokoller, der overholdt retningslinjer, og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på University of Arizona, og til 2011 NIH retningslinier for pleje og brug af forsøgsdyr.

1.. Behandling med 4-vinylcyclohexen diepoxid

1. VCD dosering protokol: I en kemisk stinkskab, tilsættes 0,587 ml VCD til en ren kolbe, bringe det endelige volumen til 10 ml med sesamolie, og derefter blandes ved at vende forsigtigt, dække og forsegle med Parafilm. Overfør opløsningen til en dosering hætteglas, forsegles med parafilm, og opbevares ved 4 ° C i op til 7 dage. Vær sikker på alle reagenser er sterile.
   1. Brug sesamolie som vehikelkontrollen som VCD opløses i sesamolie. Store VCD (MV = 140,2 g / mol, massefylde = 1,09 g / ml) ved -20 ° C.
   2. VCD indsprøjtning protokol: Ved 2 måneders alderen, veje og administrere daglige intraperitoneale injektioner af plads temperamentratur VCD i en dosis på 160 mg / kg i 20 dage i træk. Injicer kontrolmus på en lignende måde med vehikelopløsning, sesamolie, i et volumen på 2,5 ml / kg.
      Bemærk: Under indsprøjtning periode, så prøv at skifte de steder injektion for at mindske risikoen for lokal infektion. Brug følgende ligning til at beregne den nødvendige volumen til injektion: Kropsvægt (g) x kg / 1,000 gx 2,5 ml / kg = volumen (ml) opløsning til at injicere resulterer i cirka 50 ml / injektion ved hjælp af en 27 G kanyle. På grund af størrelsen af ​​nålen lokalanæstetika er ikke nødvendig.
   3. Estrale overvågningsperiode: Efter injektionen periode er færdig, overvåge Østralperioder dagligt ved at opnå vaginale udstrygninger. Holde mus ved anvendelse dorsum lurvet metode. Sæt en pipette med 0,2 ml sterilt saltvand i det vaginale åbning til en dybde på 0,5 cm. Triturer saltvand (3x) og placere 1 dråbe på en tom dias. Umiddelbart evaluere prøverne under mikroskop ved hjælp af en standard lys MicroscOPE på 100X størrelsesorden.
      Bemærk:. Vaginal cytologi er fast besluttet på at sikre tab af cykling og dermed validere ovariesvigt 2A illustrerer typisk vaginal cytologi tværs af forskellige faser af estrous cyklus i mus, nemlig proøstrus, brunst, metestrus, diestrus ^17-19. Under proestrus celler indbefatter kerneholdige epitelceller (figur 2A, Pilene angiver kerneholdige celler); under brunst, celler overvejende forhornet pladeepitelceller; Metestrus er kendetegnet ved en blanding af celletyper, med en overvægt af leukocytter; Diestrus er domineret af leukocytter. Justering af brændplanet kan være nødvendigt at visualisere celler og kerner i hele prøven. Som illustreret i figur 2B, en typisk murin estrus cyklus er 4-5 dage. Mus betragtes acycliske efter 15 på hinanden følgende dage i vedvarende diestrus. Løbende overvåge Østralperioder under hele undersøgelsen perIOD at bekræfte fravær af østrus cykler i VCD-behandlede mus.

2. Frivillig Cage-wheel Motion

Indavlede C57BL / 6 og B6C3F1 hunmus, alderen 7 måneder er udsat for frivillig bur hjul kørende. Hus enkelte dyr i et bur (47 cm x 26 cm x 14,5 cm) med uhindret adgang til et bur hjul i 28 dage.

1. Udstyr opsætning: apparat Buret hjul består af en diameter hjul med en 5,0 cm bred kører overflade udstyret med en digital magnetisk tæller, der aktiveres ved hjulrotation 11,5 cm. Før hvert hjul kører test, skal du kalibrere bur hjul i henhold til producentens retningslinjer. Mål den indvendige diameter af løbehjul, beregne omkredsen og indtaste denne værdi i digitale tæller som hjulstørrelse.
   1. Fastgør computerens del af den digitale magnetisk tæller til hjulet stativet bruge tape.
   2. Fastgør computerens portion af den digitale magnetisk tæller til hjulet stativet bruge tape.
   3. Fastgør fri magnet af det digitale magnetisk imod den centrale stang på samme side som magneten kablet til computeren igen taping tilstrækkeligt til at beskytte magneten tygge skader. Magneterne skal være placeret således, at hver omdrejning af hjulet registreres af computeren uden forstyrrelser eller resistens for at fuldføre hjulrotation.
      Bemærk: Gaffatape succes har været anvendt til at fastgøre komponenterne i den digitale magnetisk tæller til løbehjul. Taping bør være tilstrækkelig til helt at dække magneten og forhindre skader fra tygge af dyret. Magneten skal placeres så tæt som muligt på rattet uden at hindre dens bevægelse. Dog bør overvåges opsætningen dagligt for at tygge skader og nødvendig repareret.
   4. Monter hjulet til buret ved at skubbe hjulet stå igennem den øverste ledningsføring af dyret bur. Fastgør hjulet stand til than bur ledninger med bindemiddel klip.
      Bemærk: klip skal være på toppen af ​​ledninger, væk fra dyret. Feed computerens del og eventuelle ekstra kablet gennem ledninger af buret. Placér computeren og overskydende kabel utilgængeligt for dyret. Dette kan opnås ved at placere en mellemstor plast vejer fad oven på ledninger af buret for at holde computeren og overskydende kabel.
2. Øvelse: For en given kuld tilfældigt tildele mus til enten stillesiddende kontrol eller motion regime. Giv alle dyr vand og standard hårde gnaver ad libitum.
   1. Manuelt optage daglige værdier for afstanden løb (km / dag) og den samlede tid brugt kører (t / dag), givet ved den magnetiske tæller. Optag distance og tid værdier inden for samme 1 time tidsramme hver dag for nøjagtige og ensartede værdier i hele 28 dages varighed af udnyttelsesperioden. Clear (nul) den magnetiske counter efter hver dags optagelse for at sikre nøjagtige aflæsninger opfølgningning dag.
   2. Beregn gennemsnitsværdierne for afstand og hastighed for hver gruppe. Beregn hastighed baseret på de givne værdier af afstand og tid hver dag for hver mus. Kan vises som daglige eller ugentlige gennemsnit af data for de enkelte målte parameter.
3. Tissue høst: Ved afslutningen af ​​den specifikke udnyttelsesperiode, aflive udøves, og stillesiddende kontroldyr inden for 30 minutter af fjernelse fra bure ved cervikal dislokation under inhaleret anæstesi. Kropsmasse og hurtigt punktafgifter hjerter, skeletmuskulatur, og æggestokke afvejes.
   1. På tidspunktet for væv høst, montere og plette de indsamlede æggestokke med hemotoxylin og eosin (H &E; figur 2C). Under forstørrelse, tælle og klassificere hårsække som ur, primær, sekundær eller antral for hver VCD-behandlede og kontrollere dyr ^20. Et ur follikel indeholder en lille primær oocyt, et enkelt lag af flade eller skællede granulosaceller tæt imod oocytten og basallamina. En primær follikel er defineret ved tilstedeværelsen af ​​én eller flere kubisk granulosaceller, der er anbragt i et enkelt lag, der omgiver ægget. En sekundær follikel indeholder granulosaceller, der danner flere lag omkring ægget og en theca. En antral follikel er kendetegnet ved et hulrum eller "antrum", der indeholder væske.
   2. Punktafgiftspligtige hjerte, lave en mediale snit på den ventrale side og visualisere hjertet efter åbning mellemgulvet. Hurtigt udskære hjertet på basen og sted i koldt phosphatpufret saltvand til tilstrækkelig udvaskningsperiode resterende ventrikulær blod. Trim hjertet af overskydende væv, vejer hele hjertet og snap-freeze i flydende nitrogen.
   3. Vask alle andre udskårne væv med en modificeret iskold phosphatpufret saltopløsning (PBS), og snap-freeze i isopentan afkølet i flydende nitrogen.

3. Tvungen løbebånd

1. Ved ansættelse af en tvungen øvelse paradigme to måle motion kapacitet, skal du bruge et løbebånd og sat op som følger:
   1. Placer en elektrisk stød gitter i bunden af ​​løbebåndet rampen. Dette chok genereret tjener som et incitament til motion. Intensiteten og hyppigheden af ​​de elektriske stimuli styres manuelt af brugerne. Gitre kan aktiveres eller deaktiveres individuelt for hver bane. Alle dataindsamlingen sker manuelt.
   2. Med jævne kalibrere løbebåndet i henhold til producentens retningslinjer.
      1. Sørg for, at løbebånd Controller frontpanelet toggle er sat til "STOP".
      2. Placer hastighedssensoren på løbebånd bælte lane1 og fastgør med skrue møtrik i position vist nedenfor.
      3. Brug af skiven på løbebånd Controller frontpanelet justere hastigheden til 88,7 m / min Indstil derefter den elektriske stimulus frekvens til 2 Hz på Løbebånd Controller frontpanelet.
      4. Tryk på "KILOMETERTÆLLER RESET" knappen for at initialisere kalibreringen.
         
2. Akklimatisering: Akklimatisere mus til løbebåndet 3-7 dage før eksperimentet dagligt. For at gøre dette, skal du placere mus i trædemølle med bælte unmoving og chok net ud, men med bæltet motoren på (støj). Lad mus uforstyrret i mindst 15 minutter.
3. Varm op: Varm op trin som anvendes i denne protokol er som følger:
   1. Placer hver mus på løbebåndet. Deaktiver chok nettet og øge båndhastighed til 4 m / min i 15 min.
   2. Aktiver chok nettet og vedligeholde bælte hastighed4 m / min båndhastighed i yderligere 10 min.
4. Træning regimer
   1. Efter varme op, holde stød gitre på og øge båndhastighed til 5 m / min i 15 min.
   2. Stigning båndhastighed på 15 m / min i yderligere 15 min.
   3. Efter træning, overfører mus tilbage til deres bure.
      Bemærk: I denne undersøgelse blev træningen udføres dagligt i 1 uge.
   4. Akut øvelse regime: En akut øvelse regime er designet til at bestemme de kort-og langsigtede virkninger af ekstreme øvelse stress.
      1. Efter varme op, øge båndhastighed fra 5 m / min til 10, 15, 20, 25 og 30 m / min i 10 min intervaller.
         Bemærk: Afslut øvelse, hvis mus er i stand til at fortsætte med at køre eller viser tegn på udmattelse eller nød. I vores undersøgelse, blev de fleste dyr stoppet ved 25 m / min, og at ingen dyr passerede 30 m / min fase.
      2. Test hver mus tre gange, hvilket giver 2-3 dage mellem hver test. Beregn gennemsnitlige værdier på tværs af alle exercise sessioner for hver mus.
   5. Øvelse regime til udholdenhed: En udholdenhedstræning protokollen er designet til at træne mus i en længere eksponering for løbebånd stimulus. Denne type af protokol tester evnen til at tolerere de langsigtede virkninger af moderat motion stress.
      1. Begynd med båndhastighed skitseret i den varme op periode, 4 m / min.
      2. Gradvist øge båndhastighed ved 1m/min indtil en endelig hastighed på 20 m / min er nået. Samlet varighed af et typisk forsøg protokollen er 50 min.
      3. Efter øvelse regime, overfører mus tilbage til deres bure.
         Bemærk: Løb mus til udmattelse undgås. Hvis der på noget tidspunkt under forsøget en mus viser tegn på udmattelse, deaktivere chok nettet og lade musen til at hvile og komme sig.

4.. Data og statistiske analyser

1. Præsentere resultater som gennemsnit ± SEM og bruge 2-vejs ANOVA (behandlingsgruppe og exercise som vigtigste faktorer) efterfulgt af en Student-Newman Keuls post hoc test eller en student t-test til at sammenligne forskellene mellem middelværdier.
2. Bestem den procentvise ændring i hjertets masse med motion ved at sammenligne massen af ​​hver udøves dyr til middelværdien hjertets masse stillesiddende gruppe. Forskellen i hjertets masse derefter udtrykt som en procentvis ændring fra stillesiddende dyr for de respektive dyr. p-værdier på <0,05 anses for statistisk signifikant.

Representative Results

En typisk eksperimentel protokol, som den, der anvendes i denne undersøgelse, er vist i figur 1. Efter 20 dage i træk VCD behandling blev vaginal cytologi anvendes til at bestemme tilstedeværelsen eller fraværet af cyclicity i VCD-injicerede mus; vehikel-injicerede mus blev også overvåget. Den fase i estrus cyklus blev bestemt ved den andel af epitelceller, forhornede epitelceller og leukocytter i vaginale smear (figur 2A). Tilstedeværelsen af ​​kun forhornede epitelceller indikerede mus var i brunst, og blev derfor stadig cykling. Den estrale periode i mus varer typisk 4 dage, derfor VCD injicerede dyr blev betragtet acycliske efter 15 dages vedvarende diestrus, hvor vaginal cytologi afsløret et flertal af leukocytter (figur 2A). Den estrale cyklus af VCD-behandlede mus blev uregelmæssig, og derefter ophørte inden for 2-3 måneder efter starten på VCD injektioner (Figur 2B) (Figur 2C).

For at teste effekten af ​​VCD-induceret ovariesvigt på øvelse ydeevne, vi randomiseret 7 måned gammel VCD-og køretøjs-behandlede mus (to stammer, C57BL / 6 og B6C3F1) til enten stillesiddende eller bur hjul motion grupper 4-6 uger efter ophør af cykling (Figur 1). Daglig motion værdier blev registreret for tid og distance for hver udnyttet dyr i hele fire uger udnyttelsesperiode. Ugentlige gennemsnit af daglige løbende værdier for afstand og hastighed er vist i figur 3 for C57BL / 6 mus behandlet med vehikel eller VCD. Vi kunne ikke se væsentlige forskelle i motion ydeevne målt ved gennemsnitlig daglig tid, distance og hastighed på buret hjul mellem VCD-og vehikelbehandlede grupper i enten C57BL / 6 eller B6C3F1 musstamme (figur 4A). De beregnede hjul kørende hastigheder gradvist steget i løbet af 4-ugers drift periode som tidligere vist ^16, men var ikke signifikant forskellig mellem eksperimentelle grupper. Disse undersøgelser viser effekten af ​​VCD-induceret ovariesvigt på frivillig bur hjul motion transcenderer mindst 2 musestammer.

Efter varigheden af ​​den frivillige bur hjulet motion protokol blev kroppens morphometrics registreres og hjerterne blev hurtigt skåret ud og vejet. Vi har tidligere vist, at frivillig bur hjul motion inducerer en stigning i hjertets masse ^16. Her viser vi også hjertehypertrofi som reaktion på bur hjul motion målt ved absolut hjertevægt (HW) og HW normaliseret til tibia længde (TL) (tabel 1). Den absolutte hjerte masse og HW / TL-forholdet var signifikant større i køretøjkilometer og VCD-behandlede mus sammenlignet med stillesiddende kolleger. Der var dog ingen measumenlignelige forskelle i hjertehypertrofi mellem kontrol og VCD-induceret ovariesvigt mus efter frivillig bur hjul motion.

Dernæst brugte vi ufrivillig (tvungen) løbebånd kører for at bestemme motion kapacitet. Vi først udsat mus til en høj intensitet protokol, der øgede gennemsnitshastighed trinvist hver 10 min indtil udmattelse. I gennemsnit er den maksimale hastighed af behandlet køretøj mus var 26,7 ± 0,95 m / min og den maksimale hastighed på VCD behandlede mus var 28 ± 1,4 m / min før udmattelse. Vi anvendte lavere intensitet kører på 20 m / min (omkring 80% af maksimal) for at analysere for udholdenhed kapacitet. Som vist i figur 4B, fandtes ingen signifikant forskel i høj eller lav intensitet motion kapacitet mellem køretøj og VCD behandlede gruppe, hvilket indikerer, at VCD-induceret ovariesvigt havde ingen effekt på mus motion kapacitet.

Konklusionen er, at overgangsalderen induceret af VCD behandling ikke har nogen effekt på hverken frivillig eller tvungen r unning kapacitet, samt hjertets adaptiv reaktion på træning.

Figur 1. VCD-administration og forsøgsprotokol. Mus blev administreret VCD (160 mg / kg) eller sesamolie (vehikelkontrol), startende ved alderen 2 måneder i 20 på hinanden følgende dage. Efter VCD eller vehikelinjektioner blev Østralperioder overvåges og cyclicities blev bestemt som beskrevet i metodeafsnittet. Tab af æggestokkene funktion forekom inden for 60-90 dage og blev bekræftet ved vaginal cytologi. Ved 7 måneders alderen, blev mus udsat for frivillig bur hjul øvelse for 4 uger eller udsættes for løbebånd protokollen.

oad/51083/51083fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51083/51083fig2.jpg "/>
. Figur 2 VCD-induceret ovariesvigt i mus A:. Cytologi af en ufarvet vaginal podning fra et køretøj injicerede mus viser de fire faser af den estrous cyklus: 1) proestrous, overvejende bestående af kerneholdige epitelceller 2) Estrus, kendetegnet ved un -nukleeret forhornede celler; 3) metestrus, bestående af kerneholdige epitelceller (pile), un-kerneholdige forhornede epithelceller (pile), og leukocytter; 4) diestrus, primært bestående af leukocytter; og B:. Gennemsnitlig længde (dage) i estrous cyklus af køretøj-og VCD-injicerede grupper. En cyklus er målt fra den første dag i brunst til den første dag i den næste periode i brunst. Vaginal cytologi begyndte cirka 6 uger efter starten af ​​injektioner. De Østralperioder VCD-indsprøjtning dyr bliver uregelmæssige forhold til køretøjets-injicerede dyrs, og efter 12 brunst cyklusser, cytologi af al VCD injicerede dyrene ikke længere angivet cykling C:. H & E farvning af ovarievæv ved 8 måneders alderen. Snit gøres på 5 um tykkelse for vehikelbehandlet (venstre panel) og VCD-behandlede (højre panel) mus ved 20X (øverste panel) og 200X (nederste panel) forstørrelse. Ovarievæv ved 200X forstørrelse viser et antal follikler i køretøj i forhold til VCD-behandlede mus. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3.. Frivillig bur hjul præstation i køretøj-eller VCD-behandlede C57BL/6J hunmus. Venstre panel: Gennemsnitlig løbedistance (km /dag) for hver perioden 1. uge over de 4 ugers studie periode Middle Panel:. Gennemsnitlig køretid (timer / dag) for hver perioden 1. uge over de 4 ugers studie periode Right Panel:. Gennemsnitlig hastighed (km / t) for hver 1 ugers periode i løbet af de 4 ugers studie periode. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4.. Frivillig bur hjul og løbebånd præstation i køretøj-og VCD-behandlede mus. A: (Top Panel) C57BL / 6 gennemsnitlig løbedistance (km / dag) og tid brugt på hjulet (timer / dag) for hver 24 timer over 4 ugers undersøgelsen. (Nederst panel) & #160; B6C3F1 gennemsnitlig løbedistance (km / dag) og tid brugt på hjulet (t / dag) for hver 24 timer over 4 ugers studie periode B: C57BL / 6 løbebånd kører parametre.. Maksimal tid (Top panel) og maksimal hastighed (Botoom Panel) ved hjælp af protokoller beskrevet i metodeafsnittet.

Discussion

Både bur hjul motion og løbebånd kører motion regimer har været brugt i vores tidligere undersøgelser ^16,21,22. Alle dyr er holdt i dedikerede motion værelser at minimere de miljømæssige eller menneskelige forstyrrelser. Enhver forstyrrelse af dyrenes biologiske rytme kan have stor indflydelse dyrenes øvelse ydeevne. Derfor bør hele dyret pleje, performance overvågning og registrering, og motion regimer skal gøres inden for den samme daglige tidsramme. Efterforskere bør stræbe efter at undgå ekstra stress for dyrene ved at udstille forholdsregler såsom at begrænse varigheden af ​​stress eksponering og dækker bure når det er hensigtsmæssigt.

Cage hjul motion

Ved udarbejdelsen bur hjul apparatet, skal hjulet være let tilgængelige for musen til at montere og exit. Der bør minimal strøelse i bunden af ​​buret for at forhindre mus fra indlejring rundt om hjulet og hindrer free hjul bevægelse. Den magnetiske sensor er placeret på den stationære del af hjulet og magneten fastgøres til den frie hjul, således at tælle hver rotation af hjulet, da musen udnyttes. Optagelsen enhed er knyttet til den magnetiske sensor skal placeres over wire låg af buret, og alle synlige ledninger skal enten tapes eller opbevares utilgængeligt fra mus, således at tilvejebringe en barriere mod tygge skader. Magnet og magnetiske sensor blev også tapede til de relevante strukturer for at hindre såvel beskadigelse uønsket bevægelse. Under indsamlingen daglig data, skal alle de tapede ledninger nøje kontrolleres for at sikre ledningerne forbliver intakt og bør være retaped som nødvendigt. Da det kan kræve flere dage for mus til at vænne sig til det nye miljø og begynde at motionere regelmæssigt, bør dataregistrering være skræddersyet til hvert enkelt dyr. Selv dyr har en tendens til at bruge mange hr på hjulet, de fleste af driften sker natten. Derfor kan nogle dyr afsløre HIGh ydeevne aktivitet, selv om de synes passiv i dagtimerne. Endvidere er det ikke ualmindeligt, at nogle dyr vil udvise begrænset bur hjul kører. Typisk bur hjul aktivitet, der svarer til en gennemsnitlig 1 km / dag eller mindre er resultatet af tilfældige bur aktivitet og ikke forbundet med nogen væsentlig kørende stimulus. Derfor bør dyr, hvis kørende parametre er på 1 km / dag eller 1 time / dag eller mindre udelukkes i den endelige dataanalyse nonrunners.

Afhængigt af de specifikke formål en individuel studieplan og stammer af mus involverede, kan længden af ​​motion ændres. Vores tidligere undersøgelse viste, at for begge musestammer involverede de gennemsnitlige hjul kørende hastigheder og varigheden af ​​motion på buret hjul gradvist over tid og plateaued af 4 uger.

Cage hjul kører, er en form for frivillig øvelse i dyremodeller, der generelt opfattes som at blive udført under mindre stressende forhold. Ubegrike løbebånd øvelse, hvor bestemte parametre kan indstilles, alle kører i testen buret er frivillig og let påvirket af miljømæssige eller adfærdsmæssige signaler. Derfor er sammenligninger mellem forskellige eksperimentelle indstillinger typisk undgås, medmindre der anvendes store eksperimentelle grupper tal. Andre potentielle forskningsområder, der kan drage fordel af denne type øvelse paradigme er undersøgelser, der inkorporerer adfærdsmæssige reaktioner med fysiologiske konsekvenser såsom kognitiv neurovidenskab. For forsøg med frivillig bur hjul paradigme, de mest kritiske trin er bur oprettet og overvågning af motionsaktiviteter.

Løbebånd motion

Akklimatisering skridt er nødvendige for at forberede dyrene til løbebånd protokollen. Afhængigt af det specifikke formål med den individuelle undersøgelse, kan varigheden af ​​akklimatiseringsperiode varierer. I denne undersøgelse blev en periode på en uge valgt at tillade, at dyr acclimspiste på løbebåndet apparater og motorstøj i buret, varme op perioder er et vigtigt skridt i træning regime. Svarende til menneskelige modstykker, skal musene varmes op før det bliver til nogen intensiv motion regimer for at undgå skader og potentielle data artefakter. I denne undersøgelse, begyndte vi bæltet på det lavest mulige hastighed (4 m / min) med chok net slukket i 15 min. Alle mus involverede begyndte at løbe til og fra båndet. De chok gitre blev derefter tændes og bæltet hastighed fastholdes på 4 m / min. For at undgå overbelastning af musene, vi sætte elektrisk stød på en mild niveau (1 Hz). Inden for få dage, alle mus tilpasset løbebåndet.

Varigheden af ​​drift samt acceleration kan også skræddersys til hver eksperimentelle design. En anbefalet start acceleration er 1 m / min. Løbebåndet baner af mus viser tegn på udmattelse skal slukkes øjeblikkeligt. Typisk tegn på udmattelse udstillet af mice på løbebåndet er som følger:

1. Kontinuerlig eksponering for chok nettet for> 5-10 sek,
2. Tab af rindende kapacitet resulterer i chok gitter eksponering> 5x under en enkelt øvelse regime, og
3. Tab af rindende kapacitet resulterer i chok gitter eksponering> 2 sek mindst 3x løbet af en enkelt øvelse regime.

De ovenfor anførte værdier skal primært anvendes som retningslinjer for et bestemt eksperiment. Disse parametre skal bestemmes for hver øvelse protokollen som det varierer fra mus stamme til musestamme, eksperiment til eksperiment, og investigator til investigator.

I modsætning til bur hjul motion skal trædemølle undersøgelser gentages flere gange for at fjerne virkningerne af miljømæssige og biologiske faktorer på at køre ydeevne. Det er ikke ualmindeligt at se udsving i køreklar præstationer mellem tests, selv for det samme dyr. Da hver øvelse regime udsætter kører mus til en stress en passende hvile intervallet mellem test er nødvendig. Det er vores erfaring, 2-3 dage hvileperiode mellem hver test var tilstrækkeligt for mus til at komme sig.

Ligesom menneskelige løbebånd motion, hastigheden for udholdenhedstræning bedst bestemmes af puls eller blod iltmætning, en teknisk vanskelig bedrift med museforsøg. Det mest kritiske skridt løbebånd studier er bestemmelsen af ​​udmattelse, som normalt varierer mellem de enkelte mus, og blev sat som 80% maksimal hastighed. I vores egen erfaring registrering af resultater kan afvige væsentligt mellem de enkelte forskere, da kriterierne for udmattelse er for det meste subjektive. Således konsekvent anvendelse af de samme kriterier under optagelsen er kritisk.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Vinylcyclohexene diepoxide (VCD)	Sigma	V-3630
11.5 cm Diameter wheel with a 5.0 cm wide running surface	Petsmart	model 6208
Digital magnetic counter	Sigma Sport	model BC 600
Treadmill exercise	Columbus Instruments	model 1055SDRM