En metode for å studere virkningen av kjemisk-indusert eggstokksvikt på arbeidskapasiteten og Cardiac Adaptation i Mus

Summary

To trenings paradigmer ble testet på en nyutviklet kjemisk indusert overgangsalderen musemodell for å undersøke virkningen av overgangsalderen på arbeidskapasiteten og hjerte tilpasning til trening.

Abstract

Risikoen for hjerte-og karsykdommer (CVD) øker hos postmenopausale kvinner, men likevel, rollen av øvelsen, som et forebyggende tiltak for CVD risiko hos postmenopausale kvinner har ikke blitt tilstrekkelig undersøkt. Følgelig, vi undersøkt effekten av frivillig bur-wheel trening og tvunget tredemølle trening på hjerte-tilpasning i overgangsalderen mus. Den mest brukte induserbar modell for å etterligne overgangsalder hos kvinner er den ovariektomisert (OVX) gnager. Imidlertid har OVX modellen et par ulikheter fra menopause hos mennesker. I denne studien har vi gitt fire-vinylcyclohexene diepoxide (VCD) til hunnmus, som akselererer eggstokksvikt som et alternativ overgangsalder modell for å studere virkningen av øvelsen i overgangsalderen mus. VCD selektivt akselererer tapet av primære og primordial follicles resulterer i en endokrin tilstand som etterligner den naturlige progresjon fra pre-til peri-til post-menopause hos mennesker. For å fastslå effekten av trening på treningkapasitet og hjerte tilpasning i VCD-behandlet hunnmus ble det to metoder som brukes. Først utsettes vi en gruppe VCD-behandlede og ubehandlede mus til en frivillig bur hjul. For det andre brukte vi tvunget tredemølle trening for å bestemme treningskapasiteten i en egen gruppe VCD-behandlet og ubehandlet mus målt som en toleranse på treningsintensiteten og utholdenhet.

Introduction

Den naturlige utbruddet av overgangsalder er preget av uttømming av eggstokkene primordial follicles gjennom atresi, til slutt resulterer i eggstokkene senescens. I USA, vil over 30% av en kvinnes levetid bli brukt etter menopausen. I respons til en nedgang i eggstokkfunksjonen, kan flere fysiologiske og psykologiske konsekvenser oppstår, inkludert økt fedme, vaskulær ustabilitet, og humør eller søvnforstyrrelser. På grunn av økt fedme / fedme sammenlignet med premenopausale kolleger ^1,2, postmenopausale kvinner er spesielt mer utsatt for metabolsk syndrom og tilhørende samtidige, inkludert hjerte-og karsykdommer (CVD) ^tre. Dessuten er det stadig tydeligere at vellykket hjerte rehabilitering for pasienter med hjerte-og karsykdom inkluderer regelmessig aerob trening, og at trening reduserer kardiovaskulær sykelighet og dødelighet i disse fagene ^4,5. Likevel, hvordan arbeidskapasiteten changes under pre-til post-menopausal overgangen har ikke vært godt studert. Enda viktigere, den rollen på trening som et forebyggende tiltak for CVD risiko hos postmenopausale kvinner forblir bemerkelsesverdig lite studert.

Den mest brukte induserbar modell for å etterligne overgangsalder hos kvinner er den ovariektomisert (OVX) gnager. Nylig, har den yrkes kjemiske 4-vinylcyclohexene diepoxide (VCD) vist seg spesifikt mot små primære og primordial ovariefollikler ved å akselerere den naturlige prosessen med atresi, til slutt resulterer i eggstokksvikt uten åpenbar toksisitet funnet i andre vev ^seks. Brunst av VCD-behandlede mus, som er analog til en menneskelig menstruasjonssyklus, opphører innen 2-3 måneder etter ferdigstillelse av VCD injeksjoner, som igjen resulterer i en gradvis tilbaketrekking av østrogen, etterligne peri-til post-menopausale overgang. Dermed en hårsekken-deplete, eggstokk-intakt dyr tett tilnærmet naturlig menneskeligprogresjon gjennom pre-til peri-til post-menopausal overgang ^7-9. Dessuten gir det en ikke-kirurgisk alternativ til OVX modellen redusere komplikasjoner fra kirurgi, for eksempel infeksjon. I denne studien benyttet vi VCD-indusert menopause mus for å studere virkningen av øvelsen på hjerte tilpasning i overgangsalderen mus.

Det er flere tilfeller som tyder på sammenhengen mellom østrogen og bur hjulet øvelse i gnagere av begge kjønn ^10-13. Østrogen utarming av kirurgisk OVX reduserer frivillig trening aktivitet hos mus og rotter ^14,15. To metoder for utøvelse ble anvendt i denne studien for å teste arbeidskapasiteten av VCD-indusert menopausal mus. Cage rattet kjører er generelt ansett som en form for frivillig trening i dyremodeller og utført, formodentlig, under mindre stressende forhold. Imidlertid er ikke en indikasjon på den relative arbeidskapasiteten av dyr, som krever dyr å exerci buret hjulløpeSE på mye høyere nivåer. Tvunget tredemølle trening ble brukt til å bestemme arbeidskapasitet, målt som en toleranse på treningsintensiteten og utholdenhet. I tillegg har vi tidligere vist at buret hjulet trening gir en stimulans for hjerte-hypertrofi og dette hypertrofisk vekst er sex-avhengig ^16. Derfor har vi også målt hjerte tilpasning til bur hjulet øvelse i VCD-indusert menopause mus.

Protocol

Alle eksperimenter, bolig og omsorg for dyr ble utført ved hjelp av protokoller som følges retningslinjer og godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Arizona, og til 2011 NIH retningslinjer for stell og bruk av forsøksdyr.

En. Behandling med 4-vinylcyclohexene diepoxide

1. VCD dosering protokollen: I et avtrekksskap, legge 0,587 ml VCD til en ren kolbe, bringe det endelige volumet til 10 ml med sesamolje, og deretter bland ved å snu forsiktig, cover og forsegle med Parafilm. Overfør løsningen til et doseringshetteglass, som lukkes tett med Parafilm og oppbevares ved 4 ° C i opptil 7 dager. Pass på at alle reagenser er sterile.
   1. Bruk sesamolje som den kjøretøykontroll som VCD er oppløst i sesamolje. Butikk VCD (MW = 140.2 g / mol, densitet = 1,09 g / ml) ved -20 ° C.
   2. VCD injeksjon protokollen: På to måneder gammel, veier og administrere daglig intraperitoneal injeksjon av romtemperaturenperatur VCD i en dose på 160 mg / kg i 20 påfølgende dager. Injiser kontroll mus på en lignende måte med kjøretøyets løsning, sesamolje, i et volum på 2,5 ml / kg.
      Merk: Under injeksjon periode, prøv å veksle nettstedene til injeksjon for å redusere sjansene for lokal infeksjon. Bruk følgende ligning for å beregne volumet som er nødvendig for injeksjon: Kroppsvekt (g) x kg / 1,000 gx 2,5 ml / kg = volum (ml) av løsningen for å injisere noe som resulterer i omtrent 50 ml / injeksjon med en 27 G nål. På grunn av størrelsen av nålen lokale bedøvelsesmidler ikke er nødvendig.
   3. Brunst overvåking: Etter injeksjonen perioden er fullført, overvåke Østerussykluser daglig ved å skaffe vaginal prøver. Holde-mus ved hjelp av fotens rygg scruff metoden. Sett en pipette med 0,2 ml sterilt saltvann i vaginal åpningen til en dybde på 0,5 cm. Triturer saltvann (3x) og plassere en dråpe på en tomt lysbilde. Umiddelbart evaluere prøvene mikroskopisk ved hjelp av en standard lys mikroskopope på 100X magnitude.
      Merk:. Vaginal cytologi er fast bestemt på å sikre tap av sykling og dermed validere eggstokksvikt Figur 2A illustrerer typiske vaginal cytologi tvers av ulike faser av brunst hos mus, nemlig proestrus, estrus, metestrus, diestrus ^17-19. Under proestrus, celler inkluderer nukleerte epitelceller (Figur 2A, piler indikerer kjerneholdige celler); under løpetid, blir cellene hovedsakelig cornified squamous epitelceller; Metestrus er karakterisert ved en blanding av celletyper, med en overvekt av leukocytter; Diestrus er dominert av leukocytter. Regulering av brennplanet kan være nødvendig for å visualisere celler og kjerner i prøven. Som illustrert i figur 2B, er et typisk murine østrus syklus 4-5 dager. Mus anses acyclic etter 15 sammenhengende dager i vedvarende diestrus. Kontinuerlig overvåking Østerussykluser hele varigheten av studien perIOD å bekrefte manglende østrogensyklus i VCD behandlede mus.

2. Frivillig Cage-wheel Exercise

Innavlede C57BL / 6 og B6C3F1 hunnmus, i alderen 7 måneder, er utsatt for frivillig bur hjulet kjører. Huset dyrene enkeltvis i et bur (47 cm x 26 cm x 14,5 cm) med uhemmet tilgang til et bur hjul for 28 dager.

1. Setup Utstyr: Buret hjulet anordning består av en 11,5 cm diameter hjul med en 5,0 cm bred løpeflaten er utstyrt med et digitalt magnet teller som aktiveres av hjulrotasjonen. Før hvert hjul kjører test, kalibrere buret hjulet i henhold til produsentens retningslinjer. Mål den indre diameter av løpehjulet, beregne omkrets og angi denne verdi i den digitale teller i hjulstørrelsen.
   1. Fest datamaskindelen av det digitale magnetiske telleren til hjulstativet ved hjelp av tape.
   2. Fest datamaskinportenion av det digitale magnetiske telleren til hjulstativet ved hjelp av tape.
   3. Fest frie magnet av det digitale magnetiske telleren til den sentrale linjen på samme side som magnet kables til datamaskinen, igjen taping tilstrekkelig til å beskytte magnetene tygge skade. Magnetene bør plasseres slik at hver omdreining av hjulet blir tatt opp av maskinen uten noen forstyrrelser eller motstand for å fullføre hjulrotasjon.
      Merk: Kanal båndet har blitt brukt med hell til å feste komponentene til digitalt magnetisk disk til løpehjulet. Taping bør være tilstrekkelig for å fullstendig dekke magneten og hindre skade fra tygging av dyret. Magneten bør plasseres så nært som mulig til hjulet uten å hindre sin bevegelse. Imidlertid bør oppsettet være overvåket daglig for å tygge skade og repareres etter behov.
   4. Monter-hjulet til buret ved å skyve hjulet står gjennom toppen ledninger av dyret buret. Fest hjulet stand til than bur ledningene med bindemiddel klipp.
      Merk: klemmen skal være på toppen av ledninger, borte fra dyret. Strøm datamaskinen delen og noen ekstra kabel gjennom ledningsnett av buret. Plasser maskinen og overflødig kabel utilgjengelig for dyret. Dette kan oppnås ved å plassere et mellomstore plast veie fatet på toppen av ledninger av buret for å holde maskinen og overskytende kabel.
2. Øvelse: For en gitt kull, tilfeldig tildele mus til enten stillesittende kontroll eller utøve diett. Gi alle dyr vann og standard hardt gnager chow ad libitum.
   1. Manuelt registrere daglige verdier for avstanden løp (km / dag) og total tid brukt kjører (t / dag), gitt av den magnetiske disken. Record avstand og tidsverdiene innenfor samme en hr tidsramme hver dag for nøyaktige og konsistente verdier i hele 28 dagers varighet av øvelsen perioden. Clear (null) den magnetiske disken etter hver dags opptak for å sikre nøyaktige målinger ettering dag.
   2. Beregn gjennomsnittsverdiene av avstand og fart for hver gruppe. Beregn hastigheten basert på gitte verdier av avstand og tid hver dag for hver mus. Data kan vises som daglig eller ukentlig gjennomsnitt for hver målt parameter.
3. Tissue innhøsting: På slutten av den spesifikke øvelsen perioden, avlive utøves og stillesittende kontroll dyr innenfor 30 min av fjerning fra merdene ved halshugging i henhold inhalert anestesi. Vei body mass og raskt avgifts hjerter, skjelettmuskulatur, og eggstokkene.
   1. På tidspunktet for vev høsting, montere og beis de innsamlede eggstokkene med hemotoxylin og eosin (H &E; Figur 2C). Under forstørrelse, telle og klassifisere follikler som primordial, primær, sekundær eller antral for hver VCD-behandlet og kontrollere dyre ^20. En primordial hårsekken inneholder en liten barneskole eggcelle, et enkelt lag av flate eller plateepitel granulosa celler tett motsetning til eggcelle, og en basallamina. En primær follicle er definert ved tilstedeværelsen av en eller flere av kubisk granulosa celler som er anordnet i et enkelt lag rundt oocyte. Et sekundært hårsekken inneholder granulosa celler som danner flere lag rundt eggcelle og en theca. En antralfollikel er preget av et hulrom eller "antrum" som inneholder væske.
   2. Å skjære hjertet, gjør en medial snitt på ventral side og visualisere hjertet etter å ha åpnet mellomgulvet. Raskt skjære hjertet ved basen, og plasser i kald fosfat-bufret saltløsning for å i tilstrekkelig grad å vaske ut gjenværende ventrikulær blod. Trim hjertet av overflødig vev, veie hele hjertet og hurtigfrys i flytende nitrogen.
   3. Vask alle andre vev skåret ut med en modifisert is-kald fosfat-bufret saltoppløsning (PBS), og hurtigfrys i isopentan avkjølt i flytende nitrogen.

Tre. Tvunget tredemølle trening

1. Ved ansettelse av en tvungen trening paradigme to måle arbeidskapasiteten, bruke en tredemølle og satt opp som følger:
   1. Plasser et elektrisk støt rute nederst på tredemølle rampen. Dette sjokket generert fungerer som en stimulans for trening. Intensiteten og frekvensen av elektriske stimuli styres manuelt av brukeren. Rister kan aktiveres eller deaktiveres individuelt for hvert kjørefelt. All datainnsamling er gjort manuelt.
   2. Med jevne mellomrom, kalibrere tredemølle i henhold til produsentens retningslinjer.
      1. Kontroller at tredemølle Controller frontpanelet vippe er satt til "STOP".
      2. Place hastighetssensoren på tredemølle belte lane1 og stram skruen mutteren i posisjon som vist nedenfor.
      3. Bruke tall på tredemølle Controller frontpanelet, justere hastigheten til 88,7 m / min Deretter stiller elektrisk stimulans frekvensen til 2 Hz på tredemølle Controller frontpanelet.
      4. Trykk på "ODOMETER RESET" knappen for å initialisere kalibreringen.
         
2. Akklimatisering: Akklimatisere mus til tredemølle 3-7 dager før eksperimentet daglig. For å gjøre dette, plasserer mus i tredemølle med beltet ubevegelig og støt nett av, men med beltet motor på (støy). La mus uforstyrret i minst 15 min.
3. Oppvarming: Varm opp trinnene som brukes i denne protokollen er som følger:
   1. Plasser hver mus på tredemølle. Disable støt gitteret og øke beltehastigheten til 4 m / min i 15 min.
   2. Aktiver sjokk rutenett og vedlikeholde båndhastighet på4 m / min beltehastighet i ytterligere 10 min.
4. Trening opplæring regimer
   1. Etter oppvarming, hold sjokk gittere på og øke beltehastigheten til 5 m / min i 15 min.
   2. Øk båndhastighet 15 m / min i ytterligere 15 min.
   3. Etter endt opplæring overføre mus tilbake til burene sine.
      Merk: I denne studien ble fysisk trening utført daglig i en uke.
   4. Akutt øvelse diett: En akutt øvelse diett er designet for å avgjøre de kortsiktige og langsiktige effekter av ekstrem anstrengelse.
      1. Etter oppvarming, øke båndhastighet på 5 m / min til 10, 15, 20, 25 og 30 m / min i 10 min intervaller.
         Merk: Avslutt trening hvis musene ikke klarer å fortsette å kjøre eller viser tegn på utmattelse eller nød. I vår studie, ble de fleste dyrene stoppet på 25 m / min, og ingen dyr passerte 30 m / min scenen.
      2. Test hver mus tre ganger, slik at 2 til 3 dager mellom hver test. Beregn gjennomsnittsverdier over all utøvelsepresise økter for hver mus.
   5. Øvelse diett for utholdenhet: En utholdenhetstrening protokollen er designet for å trene musene i en lengre eksponering for tredemølle trening stimulans. Denne type protokoll tester kapasitet til å tolerere de langsiktige virkningene av moderat trening stress.
      1. Begynn med båndhastighet skissert under oppvarmingsperioden, 4 m / min.
      2. Øk gradvis båndhastighet etter 1m/min inntil en slutthastighet på 20 m / min nås. Total varighet av en typisk undersøkelse protokoll er 50 min.
      3. Etter øvelse diett, overføre mus tilbake til burene sine.
         Merk: Kjøring av mus til utmattelse unngås. Hvis du på noe tidspunkt i løpet av eksperimentet en mus viser tegn til utmattelse, deaktivere sjokk rutenett og lar musen hvile og gjenopprette.

4. Data og statistisk analyse

1. Presentere resultater som gjennomsnitt ± SEM og bruke to-veis ANOVA (behandlingsgruppe og exercise som hovedfaktorer), etterfulgt av en Student-Newman Keuls post hoc test eller en student t-test for å sammenligne forskjeller mellom gjennomsnittsverdier.
2. Bestem den prosentvise endring i hjertemasse med øvelse, ved å sammenligne massen av hver utøves dyr til den midlere hjerte massen av stillesittende gruppe. Forskjellen i hjerte-masse blir så uttrykt som en prosent endring fra stillesittende dyr for hver respektive dyr. p-verdier på <0,05 er ansett statistisk signifikant.

Representative Results

En typisk eksperimentell protokoll, slik som det som er brukt i denne undersøkelsen, er vist i figur 1. Etter 20 sammenhengende dager med VCD behandling, ble vaginal cytologi brukt til å fastslå tilstedeværelse eller fravær av cyclicity i VCD-injisert mus; kjøretøy injisert mus ble også overvåket. Det trinn i estrus syklusen ble bestemt ved andelen av epitelceller, cornified epitelceller, leukocytter og i det vaginale utstryk (figur 2A). Tilstedeværelsen av bare cornified epitelceller indikerte musa var i brunst, og derfor var fortsatt sykling. Brunst hos mus vanligvis varer fire dager, derfor VCD injisert dyr ble ansett acyclic etter 15 dager med vedvarende diestrus, der vaginal cytologi avdekket et flertall av leukocytter (Figur 2A). Østerussyklus VCD-behandlede mus ble uregelmessig, og deretter stanset i løpet av 2-3 måneder etter starten av VCD injeksjoner (figur 2B) (Figur 2C).

For å teste effekten av VCD-indusert eggstokksvikt på trening ytelse, vi randomisert syv måneder gamle VCD-og placebobehandlede mus (to stammer, C57BL / 6 og B6C3F1) til enten stillesittende eller bur hjultreningsgrupper 4-6 uker etter opphør av sykling (figur 1). Daglig mosjon verdiene ble registrert for tid og avstand for hvert utøvd dyr i hele fire ukers trening periode. Ukentlige gjennomsnitt av daglige driftsverdier for avstand, tid og hastighet er vist i figur 3 for C57BL / 6 mus behandlet med bærer eller VCD. Vi fikk ikke se signifikante forskjeller i trening ytelse målt ved gjennomsnittlig daglig tid, distanse og hastighet på buret hjulet mellom VCD-og placebobehandlede gruppene i enten C57BL / 6 eller B6C3F1 musbelastning (figur 4A). De beregnede hjulgående hastigheter gradvis økt over 4-ukers løpe periode som tidligere vist ^16, men var ikke signifikant forskjellig mellom forsøksgrupper. Disse studiene indikerer effekten av VCD-indusert eggstokksvikt på frivillig bur hjulet trening transcenderer minst to musestammer.

Som følge av varigheten av den frivillige buret hjulet utøve protokollen, ble kropps morphometrics registrert, og hjertene ble raskt skåret ut og veid. Vi har tidligere vist at frivillig bur hjulet trening induserer en økning i hjertemassen ^16. Her har vi viser også hjertehypertrofi som følge av buret hjulet utøve målt ved absolutte hjertevekt (HW), og HW normalisert til tibial lengde (TL) (tabell 1). Den absolutte hjerte masse og HW / TL forholdet var signifikant større i vogn og VCD-behandlede mus sammenlignet med stillesittende kolleger. Men det var ingen flakonglige forskjeller i hjerte-hypertrofi mellom kontroll og VCD-indusert eggstokksvikt mus etter frivillig bur hjulet trening.

Deretter brukte vi ufrivillig (tvunget) tredemølle kjører for å bestemme arbeidskapasiteten. Vi først utsatt mus til en høy intensitet protokollen at økt gjennomsnittshastighet trinnvis hvert 10 min til utmattelse. I gjennomsnitt var den maksimale hastigheten til kjøretøyet behandlede mus 26.7 ± 0,95 m / min og den maksimale hastighet VCD behandlede mus var 28 ± 1.4 m / min før konsumpsjon. Vi brukte lavere intensitet som kjører på 20 m / min (omtrent 80% av maksimal) til analysen for utholdenhetskapasitet. Som vist i figur 4B, ble ingen signifikant forskjell i høy-eller lav intensitet arbeidskapasiteten funnet mellom kjøretøy og VCD behandlede gruppen, noe som indikerer at VCD-indusert eggstokksvikt hadde ingen virkning på mus arbeidskapasiteten.

Som konklusjon, menopause indusert av VCD behandlingen har ingen virkning på enten frivillig eller tvungen r unning kapasitet, samt hjerte adaptiv respons på trening.

VCD-administrasjon og eksperimentell protokoll. Mus Figur 1. Ble administrert VCD (160 mg / kg) eller sesamolje (kjøretøykontroll) starter på 2 måneders alder for 20 påfølgende dager. Etter VCD eller kjøretøyets injeksjoner ble Østerussykluser overvåkes og cyclicities ble bestemt som beskrevet i avsnittet Metoder delen. Tap av eggstokkfunksjonen inntraff innen 60-90 dager, og ble bekreftet av vaginal cytologi. Ved 7 måneders alder, ble mus eksponert for frivillig bur hjulet øvelse for fire uker eller utsatt for tredemølle trening protokollen.

oad/51083/51083fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51083/51083fig2.jpg "/>
. Figur 2 VCD-indusert eggstokksvikt hos mus A:. Cytologi av en uplettet vaginalutstryket fra et kjøretøy injisert mus demonstrerer de fire stadier av brunst: 1) proestrous, hovedsakelig bestående av kjerneholdige epitelceller 2) Estrus, preget av un -kjerneholdige cornified celler; 3) metestrus, som består av kjerneholdige epitelceller (piler), un-nukleære cornified epitelceller (piler), og leukocytter; 4) diestrus, bestående hovedsakelig av leukocytter; og B:. Gjennomsnittlig varighet (dager) av brunst av kjøretøy-og VCD-injiserte gruppene. En syklus er målt fra den første dagen i løpetid til den første dagen i den neste perioden i brunst. Vaginal cytologi begynte ca 6 uker etter utbruddet av injeksjoner. De østrogensyklus VCD-injisert dyr bli uregelmessig, sammenlignet med kjøretøy-injisert dyrs, og etter 12 estrus sykluser, cytologi av alt VCD injisert dyr ikke lenger indikeres sykling C:. H & E farging av eggstokkvev ved åtte måneders alder. Tverrsnitt gjort på 5 pm ble tykkelse for kjøretøy-behandlet (venstre panel) og VCD-behandlet (høyre panel) mus ved 20X (øverste panel) og 200X (nedre panel) forstørrelse. Eggstokkvev på 200X forstørrelse viser et antall follikler i kjøretøy-forhold til VCD-behandlede mus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Frivillig bur hjulet ytelse i kjøretøy-eller VCD-behandlet C57BL/6J hunnmus. Venstre panel: Gjennomsnittlig avstand kjører (km /dag) for hver 1 ukers periode over fire ukers studieperioden Middle Panel:. Gjennomsnittlig driftstid (t / dag) for hver 1 ukers periode over fire ukers studieperioden Høyre Panel:. Gjennomsnittlig hastighet kjører (km / t) for hver 1 ukers periode over fire ukers studieperioden. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Frivillig bur hjulet og tredemølle ytelse i kjøretøy-og VCD-behandlede mus. A: (Top Panel) C57BL / 6 gjennomsnittlig kjører avstand (km / dag) og tid brukt på rattet (timer / dag) for hver 24 timer over fire ukers studieperioden. (Nederst Panel) & #160; B6C3F1 gjennomsnittlig kjører avstand (km / dag) og tid brukt på rattet (t / dag) for hver 24 time over fire ukers studieperioden B: C57BL / 6 tredemølle kjører parametere.. Maksimal tid (Top Panel) og maksimal hastighet (botoom Panel) ved hjelp av protokoller beskrevet i metoder delen.

Discussion

Både bur hjulet trening og tredemølle kjører treningsregimer er brukt i våre tidligere studier ^16,21,22. Alle dyrene blir holdt i egne treningsrom for å minimere miljømessige eller menneskelige forstyrrelser. Enhver forstyrrelse av dyrenes biologiske rytmen kan påvirke dyr betydelig 'trening ytelse. Derfor bør hele dyret omsorg, ytelse overvåking og registrering, og trening regimer gjøres innenfor samme daglige tidsramme. Etterforskerne skal bestrebe seg på å unngå ekstra stress for dyrene ved å stille forholdsregler som for eksempel å begrense varigheten av eksponering stress og dekker merdene der det er hensiktsmessig.

Cage rattet trening

Ved utarbeidelsen av buret hjulet apparat, bør hjulet være lett tilgjengelig for musen å montere og exit. Det bør minimal bedding i bunnen av buret for å hindre mus fra nesting rundt hjulet og hindrer free rattbevegelse. Den magnetiske sensor er plassert på den stasjonære del av hjulet, og at magneten er festet til den frie hjul, slik som å telle hver rotasjon av hjulet som mus benyttet. Den opptaksenhet festet til den magnetiske sensoren skal plasseres over ledningen lokket på buret, og alle utsatte ledninger som må enten tapet eller oppbevares utilgjengelig fra musene, slik som å tilveiebringe en barriere mot tygging skade. Magneten og magnetsensor ble også tapet til de aktuelle strukturer for å hindre at både skader og uønsket bevegelse. Under daglig datainnsamling, må alle de teipet ledninger nøye kontrolleres for å sikre ledningene forbli intakt og bør være retaped som nødvendig. Siden det kan ta flere dager for mus å akklimatisere seg det nye miljøet og begynne å trene regelmessig, bør dataregistrering skreddersys til hver enkelt dyr. Selv om dyrene har en tendens til å bruke mange timer på hjulet, det meste av driften skjer om natten. Derfor kan noen dyr avsløre high ytelse aktivitet selv om de vises sovende på dagtid. Videre er det ikke uvanlig at noen dyr vil utvise begrenset bur løpehjulet. Vanligvis bur hjulet aktivitet som utgjør et gjennomsnitt 1 km / dag eller mindre er resultatet av tilfeldige bur aktivitet og ikke er forbundet med noen betydelig løpe stimulus. Derfor bør dyr hvis kjører parametere er på 1 km / dag eller en time / dag eller mindre utelukkes i de endelige dataanalyse nonrunners.

Avhengig av den spesifikke anvendelsen av en individuell undersøkelse og stammer av mus som er involvert, kan lengden av øvelsen modifiseres. Vår tidligere studie viste at for begge musestammer som er involvert, gjennomsnittlig hjul-løpehastighet og varigheten av øvelsen på buret hjulet gradvis økt over tid og plateaued av fire uker.

Cage rattet kjører er en type frivillig trening i dyremodeller, som vanligvis tas som blir utført under mindre stressende forhold. UNLike tredemølle trening der visse parametre kan forhåndsinnstilles, alle kjører i testen buret er frivillig og lett påvirket av miljø-eller atferdsmessige signaler. Derfor er sammenligninger mellom forskjellige eksperimentelle innstillinger vanligvis unngås uten at store eksperimentelle grupper nummer brukes. Andre potensielle områder for forskning som kan ha nytte av denne type trening paradigmet er studier som inkluderer atferdsmessige reaksjoner med fysiologiske konsekvenser som kognitiv nevrovitenskap. For studier utnytte den frivillige buret hjulet paradigmet, de mest kritiske trinnene er bur satt opp og overvåking av treningsaktiviteter.

Tredemølle trening

Akklimatisering trinn er nødvendig for å forberede dyr for tredemølle trening protokollen. Avhengig av den spesifikke hensikten med individuelle studier, kan varigheten av akklimatiseringsperiode varierer. I denne studien ble en periode på én uke valgt for å tillate dyrene å acclimspiste til tredemølle apparater og motorstøy i buret, varme opp perioder er et viktig steg på trening diett. I likhet med menneskelige kolleger, må musene bli varmet opp før de kommer inn i noen intensive treningsregimer for å unngå skader og potensielle data gjenstander. I denne studien, begynte vi beltet til lavest mulig hastighet (4 m / min) med sjokk nett slått av i 15 min. Alle musene involverte begynte å løpe på og av beltet. De støtnett ble deretter slått på og beltehastigheten opprettholdes på 4 m / min. For å unngå å overbelaste mus, satt vi den elektriske støt i mild grad (1 Hz). Innen noen få dager, alle mus tilpasset tredemølle belte.

Varigheten av løpe samt akselerasjonen kan også bli skreddersydd for hver eksperimentell design. En anbefalt start akselerasjon rate er en m / min. Tredemøllen baner av mus viser tegn til utmattelse må være slått av umiddelbart. Typisk tegn på utmattelse utstilt ved mice på tredemøllen er som følger:

1. Kontinuerlig eksponering for sjokk rutenett for> 5-10 sek,
2. Tap av å kjøre kapasitet som resulterer i sjokk rutenett eksponering> 5x løpet av en enkelt øvelse diett, og
3. Tap av å kjøre kapasitet som resulterer i sjokk rutenett eksponering> 2 sek minst 3x i løpet av en enkelt øvelse diett.

Verdiene nevnt ovenfor skal brukes primært som retningslinjer for et bestemt eksperiment. Disse parametrene må bestemmes for hver øvelse protokoll som det varierer fra mus belastning til mus belastning, eksperiment for å eksperimentere, og etterforsker til etterforsker.

I motsetning bur hjulet trening, må tredemølle studier gjentas flere ganger for å eliminere effektene av miljømessige og biologiske faktorer på løpingen. Det er ikke uvanlig å se svingninger i løpende ytelse mellom testene selv for samme dyr. Siden hver øvelse diett utsetter kjører mus til en stress, en passende hvileintervallet mellom testene er nødvendig. I vår erfaring, 2-3 dager hvile perioden mellom hver test var tilstrekkelig for mus å komme seg.

Som menneske tredemølle trening, er hastigheten for utholdenhetstrening best bestemmes av hjertefrekvens eller blod oksygenmetning, en teknisk vanskelig prestasjon med musestudier. Den mest kritiske trinn av tredemølle studier er bestemmelse av utmattelse, som vanligvis varierer mellom individuelle mus, og ble angitt som 80% maksimal hastighet. I vår egen erfaring innspillingen av resultater kan avvike vesentlig mellom enkeltforskere, da kriteriene for utmattelse er mest subjektive. Således er den konsekvente anvendelse av de samme kriterier under innspillingen kritisk.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Vinylcyclohexene diepoxide (VCD)	Sigma	V-3630
11.5 cm Diameter wheel with a 5.0 cm wide running surface	Petsmart	model 6208
Digital magnetic counter	Sigma Sport	model BC 600
Treadmill exercise	Columbus Instruments	model 1055SDRM