Summary
Zwei Paradigmen Übung wurden auf einem neu entwickelten chemisch induzierte Menopause Mausmodell getestet werden, um die Auswirkungen der Wechseljahre auf die körperliche Belastbarkeit und Herz Anpassung ausüben zu untersuchen.
Abstract
Das Risiko von Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) erhöht bei postmenopausalen Frauen, doch die Rolle der Übung, als vorbeugende Maßnahme für CVD-Risiko bei postmenopausalen Frauen wurde nicht ausreichend untersucht. Daher untersuchten wir die Auswirkungen der freiwilligen Käfig-Rad-Bewegung und gezwungen Laufband auf die kardiale Anpassung in der Menopause Mäusen. Das am häufigsten verwendete induzierbare Modell zur Nachahmung der Menopause bei Frauen ist die ovariektomierten (OVX) Nagetier. Allerdings hat das Modell OVX ein paar Unterschiede von den Wechseljahren in den Menschen. In dieser Studie haben wir verabreichten 4-Vinylcyclohexendiepoxid (VCD) zu weiblichen Mäusen, die Eierstockversagen als Alternative Menopause-Modell, um die Auswirkungen von Bewegung in der Menopause Mäusen untersucht werden beschleunigt. VCD selektiv beschleunigt den Verlust von primären und Primordialfollikeln was in einer endokrine Zustand, imitiert den natürlichen Verlauf von der Vor-peri-bis Post-Menopause beim Menschen. Um die Auswirkungen von Bewegung auf die Bewegung bestimmenKapazität und Herz Anpassung in VCD-behandelten weiblichen Mäusen wurden zwei Methoden verwendet. Zunächst ausgesetzt wir eine Gruppe von VCD-behandelten und unbehandelten Mäusen zu einer freiwilligen Käfig-Rad. Zweitens haben wir gezwungen Laufband Übung zu Übung Kapazität in einer separaten Gruppe VCD-behandelten und unbehandelten Mäusen gemessen als Toleranz, um die Intensität und Ausdauer trainieren zu bestimmen.
Introduction
Der natürliche Beginn der Wechseljahre ist durch die Erschöpfung der Eierstock Primordialfollikel durch Atresie gekennzeichnet, die später in Eierstock Seneszenz. In den Vereinigten Staaten, werden über 30% der eine Frauen-Lebensdauer nach der Menopause ausgegeben werden. In Reaktion auf eine Abnahme der Eierstockfunktion, können mehrere physiologische und psychologische Konsequenzen auftreten, einschließlich erhöhter Adipositas, vaskulärer Instabilität und Stimmung oder Schlafstörungen. Aufgrund der erhöhten Fettleibigkeit / Adipositas, verglichen mit 1,2 prämenopausalen Pendants, sind Frauen nach der Menopause besonders anfällig für metabolische Syndrom und die damit verbundenen Begleiterkrankungen, einschließlich Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) 3. Darüber hinaus wird es immer deutlicher, dass erfolgreiche kardiologische Rehabilitation für Patienten mit CVD beinhaltet regelmäßige Aerobic-Übungen, und dass die Ausübung reduziert kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität bei diesen Patienten 4,5. Doch wie körperliche Belastbarkeit changes während der Pre-bis Post-Menopause noch nicht gut untersucht. Noch wichtiger ist, bleibt die Rolle der Bewegung als vorbeugende Maßnahme für CVD-Risiko bei postmenopausalen Frauen bemerkenswert under.
Das am häufigsten verwendete induzierbare Modell zur Nachahmung der Menopause bei Frauen ist die ovariektomierten (OVX) Nagetier. Vor kurzem hat die Arbeits chemische 4-Vinylcyclohexendiepoxid (VCD) hat sich gezeigt, dass vor allem auf kleine und ursprüngliche Primär Eibläschen durch die Beschleunigung der natürlichen Prozess der Atresie, was letztlich zu einer Eierstockversagen ohne erkennbare Toxizität in anderen Geweben 6 gefunden. Der Sexualzyklus der VCD-behandelten Mäusen, die analog zu einem menschlichen Menstruationszyklus ist, hört innerhalb von 2-3 Monaten nach dem Abschluss des VCD-Injektionen, die wiederum führt zu einer allmählichen Rückzug von Östrogen, imitiert den peri-zu post-menopausalen Übergang. So ein Follikel-Abbau-, Eierstock-intakten Tier sehr nahe der natürlichen menschlichenProgression durch die Pre-peri-Post-Menopause 7-9. Darüber hinaus bietet sie eine nicht-chirurgische Alternative zur OVX-Modell reduziert Komplikationen von Operationen, wie beispielsweise Infektion. In dieser Studie verwendeten wir VCD-induzierten Menopause Mäusen, um die Auswirkungen von Bewegung auf die Herz Anpassung in der Menopause Mäusen untersucht.
Es gibt mehrere Fälle, die den Zusammenhang zwischen Östrogen und Käfig-Rad in Bewegung Nagetiere beider Geschlechter 10-13 vorschlagen. Östrogenentzug durch chirurgische OVX nimmt freiwillige Übung Aktivität bei Mäusen und Ratten 14,15. Zwei Methoden der Übung wurden in dieser Studie verwendet, um die Belastungsfähigkeit der VCD-induzierten Menopause Mäusen testen. Cage Radfahr wird allgemein als eine Art freiwillige Übung in Tiermodellen betrachtet und durchgeführt wird, vermutlich unter weniger stressigen Bedingungen. Allerdings Käfig Radfahr nicht, der die relative Belastungsfähigkeit von Tieren, die Tiere benötigt, um Exercise in viel höheren Mengen. Zwangslaufband wurde zur körperlichen Leistungsfähigkeit, gemessen als einer Toleranz, um die Intensität und Ausdauer trainieren zu bestimmen. Darüber hinaus haben wir bereits gezeigt, dass Käfig Rad Übung stellt einen Anreiz für Herzhypertrophie und das hypertrophe Wachstum ist Sex-abhängige 16. Deshalb haben wir auch Herz Anpassung an Käfig Rad Übung in VCD-induzierten Menopause Mäusen gemessen.
Protocol
Alle Versuche, Wohnen und Pflege von Tieren wurde mit Protokollen, die Richtlinien eingehalten werden und der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss an der Universität von Arizona zugelassen und bis 2011 NIH-Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren.
1. Die Behandlung mit 4-Vinylcyclohexendiepoxid
- VCD Dosierungsprotokoll: In einer chemischen Abzugshaube, hinzufügen, 0,587 ml VCD auf einen sauberen Kolben, bringen das endgültige Volumen auf 10 ml mit Sesamöl, und dann mischen durch Invertieren vorsichtig, Abdeckung und Abdichtung mit Parafilm. Die Lösung wird in einem Dosierungsfläschchen, mit Parafilm verschließen und bei 4 ° C für bis zu 7 Tage. Seien Sie sicher, dass alle Reagenzien sind steril.
- Verwenden Sie Sesamöl als Fahrzeugsteuerung als VCD wird in Sesamöl gelöst. Speicher VCD (MW = 140.2 g / mol, Dichte = 1,09 g / ml) bei -20 ° C.
- VCD Injektionsprotokoll: Im Alter von 2 Monaten, wiegen und zu verwalten tägliche intraperitoneale Injektionen von Raumtemperaturratur VCD in einer Dosis von 160 mg / kg an 20 aufeinanderfolgenden Tagen. Injizieren Kontrollmäusen in einer ähnlichen Weise mit der Trägerlösung, Sesamöl, in einem Volumen von 2,5 ml / kg.
Hinweis: Während der Einspritzdauer, versuchen, die Injektionsstellen abzuwechseln, um die Chancen der lokalen Infektion. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um die für die Injektion benötigte Volumen berechnen: Körpergewicht (g) x kg / 1000 gx 2,5 ml / kg = Volumen (ml) der Lösung, was zu etwa 50 ml / Injektion mit einer 27 G-Nadel zu injizieren. Aufgrund der Größe der Nadel Lokalanästhetika sind nicht erforderlich. - Sexualzyklus Überwachung: Nach der Einspritzdauer abgeschlossen ist, überwachen die Ovarialzyklen täglich durch den Erhalt Vaginalabstrichen. Rain Mäuse mit dem Rücken scruff Methode. Legen Sie eine Pipette mit 0,2 ml steriler Kochsalzlösung in die Scheidenöffnung bis zu einer Tiefe von 0,5 cm. Man reibt Salzlösung (3x) und 1 Tropfen auf eine leere Folie. Unmittelbar bewerten Proben mikroskopisch mit Hilfe eines Standard-Licht Microscope bei 100-facher Größe.
Hinweis:. Vaginal Zytologie ist entschlossen, Verlust von Regeln sicherzustellen und damit zu validieren Ovarialinsuffizienz 2A zeigt typische Vaginalzytologie in verschiedenen Phasen des Sexualzyklus bei Mäusen, nämlich Proestrus, Brunst, Metöstrus, Diöstrus 17-19. Während Proestrus, kernhaltigen Zellen sind Epithelzellen (2A, Pfeile zeigen kernhaltigen Zellen); während der Brunst werden die Zellen überwiegend verhornten Plattenepithel Epithelzellen; Metöstrus wird durch eine Mischung von Zelltypen ist, mit einer Vorherrschaft von Leukozyten; Diöstrus wird von Leukozyten dominiert. Einstellung der Brennebene erforderlich sein, um Zellen und Zellkerne in der Probe zu visualisieren. Wie in 2B dargestellt ist, ist eine typische Maus Östruszyklus 4-5 Tage. Die Mäuse werden nach 15 aufeinander folgenden Tagen in persistent diestrus als azyklisch. Ovarialzyklen während der gesamten Dauer der Studie pro Kontinuierliche Überwachungiod Mangel an Ovarialzyklen in VCD behandelten Mäusen bestätigen.
2. Freiwillige Cage-Rad-Übung
Inzuchtstamm C57BL / 6 und B6C3F1 weibliche Mäuse im Alter von 7 Monaten, sind die freiwillige Radfahr Käfig ausgesetzt. Haus Tiere einzeln in einem Käfig (47 cm x 26 cm x 14,5 cm) mit unbelasteten Zugang zu einem Käfig Rad für 28 Tage.
- Geräte-Setup: Der Käfig Rad Vorrichtung besteht aus einem 11,5 cm Scheibendurchmesser mit einer 5,0 cm breite Lauffläche mit einem digitalen Zähler, der durch magnetische Radumdrehung aktiviert ausgestattet. Vor jedem Rad Lauftest, kalibrieren Sie den Käfig Rad nach den Richtlinien des Herstellers. Den Innendurchmesser des Laufrades, berechnen Sie den Umfang und geben Sie diesen Wert in die digitale Zähler als Radgröße.
- Befestigen Sie den Computer Teil des digitalen Magnet Zähler auf dem Rad Stand mit Klebeband.
- Befestigen Sie den Computer-PortIon der digitalen Magnet Zähler auf dem Rad Stand mit Klebeband.
- Schließen Sie das freie Magnet der digitalen Magnet gegen die zentrale Bar auf der gleichen Seite wie der Magnet mit dem Computer verkabelt, wieder Taping ausreichend, um den Magneten vom Kauen Schäden zu schützen. Die Magnete sollten so positioniert werden, dass jede Drehung des Rades durch den Computer ohne Störung oder Widerstand zur Raddrehung vervollständigen aufgezeichnet.
Hinweis: Klebeband wurde erfolgreich verwendet, um die Komponenten des digitalen magnetischen entgegen der Laufrad befestigen. Taping sollte ausreichend sein, um den Magneten vollständig bedecken und Schäden durch Kauen durch das Tier zu verhindern. Der Magnet so nahe wie möglich an dem Rad ohne Behinderung seiner Bewegung positioniert werden. Jedoch sollte die Einrichtung täglich Fraß überwacht und bei Bedarf repariert werden. - Montieren Sie das Rad, um den Käfig, indem das Rad durch die obere Verdrahtung des Tierkäfig stehen. Sichern Sie die Schleifbock zu ter Käfig Verdrahtung mit Bindemittel Clips.
Anmerkung: der Clip auf der Oberseite des Verdrahtungs vom Tier sein. Führen Sie das Computerbereich und keine zusätzlichen Kabel durch die Verdrahtung des Käfigs. Stellen Sie den Computer und das überschüssige Kabel außerhalb der Reichweite des Tieres. Dies kann, indem man eine mittelgroße Plastikschüssel wiegen auf der Verdrahtung des Käfigs, um den Computer und das überschüssige Kabel zu halten erreicht werden.
- Übung: Für einen bestimmten Wurf, nach dem Zufallsprinzip vergeben Mäuse entweder mit dem sitzenden Steuer-oder Trainingsprogramm. Geben Sie allen Tieren Wasser und Standard-Festnagetierfutter ad libitum.
- Manuell aufzeichnen Tageswerte für den Abstand ran (km / Tag) und die Gesamtzeit für das Ausführen (h / Tag), durch die magnetische Gegen gegeben. Jeden Tag für genaue und konsistente Werte während der 28 Tage Dauer der Ausübungsfrist Rekord Distanz und Zeit-Werte innerhalb der gleichen Stunde ein Zeitrahmen. Clear (Null) die magnetische Zähler nach jeden Tag der Aufnahme um genaue Messwerte für die Folgeten Tag.
- Berechnen der Durchschnittswerte von Entfernung und Geschwindigkeit für jede Gruppe. Berechnen Geschwindigkeit basierend auf den gegebenen Werten von Entfernung und Zeit jeden Tag für jede Maus. Die Daten können für jeden gemessenen Parameter als tägliche oder wöchentliche Durchschnittswerte angezeigt werden.
- Tissue Ernte: Am Ende des jeweiligen Ausübungszeitraum, innerhalb von 30 Minuten der Entfernung aus Käfigen durch Genickbruch unter inhalativen Anästhesie ausgeübt einschläfern und sitzende Kontrolltieren. Wiegen Körpermasse und schnell Verbrauch Herz, Skelettmuskel, und der Eierstöcke.
- Zum Zeitpunkt der Ernte Gewebe, montieren und färben die Eierstöcke mit Hemotoxylin gesammelt und Eosin (H &E; 2C). Unter Vergrößerung, zu zählen und zu klassifizieren Follikel als ursprüngliche, primäre, sekundäre oder Antrum für jeden VCD-behandelten und unbeTier 20. Ein Primordialfollikel enthält eine kleine primäre Oozyte, eine einzelne Schicht aus flachen oder Plattenepithelkarzinom Granulosazellen eng mit der Eizelle gegenüberliegt und eine basaleLamina. Eine primäre Follikel wird durch die Anwesenheit von einem oder mehreren quaderförmigen Granulosa-Zellen, die in einer einzigen Schicht um die Eizelle angeordnet sind, definiert. Eine sekundäre Follikel enthält Granulosazellen, die mehrere Schichten um die Eizelle, und eine Theca bilden. Ein antralen Follikel durch einen Hohlraum oder "Antrum" enthaltende Flüssigkeit ist.
- Um das Herz herauszuschneiden, machen Sie eine mediale Inzision an der Bauchseite und visualisieren das Herz nach dem Öffnen der Membran. Schnell das Herz herauszuschneiden an der Basis und in kaltem Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung ausreichend Wash-out-Rest ventrikuläre Blut. Schneiden Sie die Herzen der überschüssiges Gewebe, wiegen das ganze Herz und Snap-in flüssigem Stickstoff einfrieren.
- Mit einem modifizierten eiskalten Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Waschen Sie alle anderen herausgeschnitten Gewebe und Snap-in Isopentan Einfrieren in flüssigem Stickstoff gekühlt.
3. Zwangslaufband Übung
- Beim Einsatz einer Übung gezwungen Paradigma to Messung der körperlichen Leistungsfähigkeit, verwenden Sie ein Laufband und setzen sich wie folgt:
- Legen Sie einen elektrischen Schlag Gitter an der Basis des Lauframpe. Dieser Schock erzeugt dient als Anregung für die Übung. Die Intensität und die Frequenz der elektrischen Impulse werden manuell durch den Benutzer gesteuert. Grids kann aktiviert oder individuell für jede Spur deaktiviert zu sein. Die Datenerhebung erfolgt manuell.
- In regelmäßigen Abständen kalibrieren das Laufband nach den Richtlinien des Herstellers.
- Stellen Sie sicher, dass das Laufband Frontplatte des Reglers Knie auf "STOP".
- Platz Geschwindigkeitssensor am Laufband lane1 und sicher zu befestigen mit Schraubverschluss unten in Position.
- Mit dem Rad auf der Vorderseite Laufband-Controller, passen Sie die Geschwindigkeit auf 88,7 m / min Sie dann die elektrische Reizfrequenz bis 2 Hz auf Laufband-Controller Frontplatte.
- Drücken Sie die "ODOMETER RESET" drücken, um Kalibrierung zu initialisieren.
- Akklimatisierung: Akklimatisieren Mäusen auf dem Laufband 3-7 Tage vor dem Experiment täglich. Um dies zu tun, statt Mäuse im Laufband mit der Band unbeweglich und Schocknetze aus, aber mit der Bandmotor auf (Rauschen). Verlassen Mäuse für mindestens 15 min ungestört.
- Warm up: Aufwärmen Schritte wie in diesem Protokoll verwendet werden, sind wie folgt:
- Platzieren Sie jede Maus auf dem Laufband. Deaktivieren Sie den Schock Gitter und erhöhen Bandgeschwindigkeit bis 4 m / min für 15 min.
- Aktivieren Sie den Schock Gitter und pflegen Bandgeschwindigkeit an4 m / min Bandgeschwindigkeit für weitere 10 min.
- Übung Trainingsprogramme
- Nach Warm-up, halten Schock Gitter auf und erhöhen die Bandgeschwindigkeit bis 5 m / min für 15 min.
- Erhöhung der Bandgeschwindigkeit auf 15 m / min für weitere 15 min.
- Nach Ausbildung, übertragen Mäuse zurück in ihre Käfige.
Hinweis: In dieser Studie wurde die Bewegungstraining täglich für 1 Woche durchgeführt. - Akute Trainingsprogramm: Eine akute Trainingsprogramm wurde entwickelt, um die kurz-und langfristigen Auswirkungen von extremen Belastungs bestimmen.
- Nach Warm-up, erhöhen Bandgeschwindigkeit von 5 m / min bis 10, 15, 20, 25 und 30 m / min in 10-Minuten-Intervallen.
Hinweis: Beenden Übung, wenn Mäuse sind nicht in der Lage zu laufen oder zeigen Anzeichen von Erschöpfung oder Stress weiter. In der vorliegenden Studie wurden die meisten Tiere bei 25 m / min gestoppt und kein Tier geleitet, die 30 m / min Stufe. - Testen Sie jede Maus drei Mal, so dass 2-3 Tage zwischen den Tests. Berechnen Durchschnittswerte über alle Exerpräzise Sitzungen für jede Maus.
- Nach Warm-up, erhöhen Bandgeschwindigkeit von 5 m / min bis 10, 15, 20, 25 und 30 m / min in 10-Minuten-Intervallen.
- Trainingsprogramm für Ausdauer: Ein Ausdauertraining Protokoll wurde entwickelt, um Mäuse für eine längere Exposition gegenüber dem Laufband trainieren Reiz. Diese Art von Protokoll testet die Kapazität, um die langfristigen Auswirkungen von moderater Bewegung Stress zu tolerieren.
- Beginnen Sie mit der Bandgeschwindigkeit während der Aufwärmphase, 4 m / min dargestellt.
- Schrittweise Erhöhung der Bandgeschwindigkeit von bis zu einer endgültigen 1m/min Geschwindigkeit von 20 m / min erreicht wird. Gesamtdauer eines typischen Studienprotokoll ist 50 min.
- Nach dem Trainingsprogramm, Transfer Mäuse zurück in ihre Käfige.
Hinweis: Laufen Mäuse bis zur Erschöpfung wird vermieden. Wenn zu irgendeinem Zeitpunkt während des Experiments eine Maus zeigt Anzeichen von Erschöpfung, deaktivieren Sie den Schock Netz und lassen Sie die Maus, um sich auszuruhen und zu erholen.
4. Daten und statistische Analyse
- Anwesend Ergebnisse als Mittelwert ± SEM und benutzen 2-Wege-ANOVA (Behandlungsgruppe und exercise als Hauptfaktoren), gefolgt von einem Student-Newman Keuls post-hoc-Test oder ein Student t-Test, um Unterschiede zwischen Mittelwerten zu vergleichen.
- Bestimmen Sie die prozentuale Veränderung der Herzmasse mit Übung, indem die Masse jedes Tier ausgeübt auf die mittlere Herz Masse der sitzenden Gruppe. Der Unterschied in der Herzmasse wird dann als eine prozentuale Änderung von sitz Tiere für jeden entsprechenden Tier exprimiert. P-Werte <0,05 werden als statistisch signifikant betrachtet.
Representative Results
Ein typischer Versuchsprotokoll, wie das in dieser Studie verwendet wird, ist in Fig. 1 dargestellt. Nach 20 aufeinanderfolgenden Tagen VCD Behandlung wurde Vaginalzytologie verwendet, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von Zyklizität in der VCD-injizierten Mäusen zu bestimmen; Fahrzeug-injizierten Mäusen wurden ebenfalls überwacht. Die Bühne in der Rosse wurde durch den Anteil der Epithelzellen, verhornten Epithelzellen und Leukozyten in der vaginalen Abstrich (2A) bestimmt. Die Anwesenheit von nur verhornten Epithelzellen angegeben die Maus war in der Brunst, und wurde daher noch Radfahren. Der Sexualzyklus bei Mäusen dauert in der Regel 4 Tage, also VCD injizierten Tiere wurden azyklische nach 15 Tagen der anhaltenden diestrus, in der Vaginalzytologie ergab eine Mehrheit der Leukozyten (2A) berücksichtigt. Der Sexualzyklus der VCD-behandelten Mäusen wurde unregelmäßig, und dann nicht mehr innerhalb von 2-3 Monaten nach Beginn der VCD-Injektionen (2B) (Abbildung 2C).
Um die Wirkung der VCD-induzierte Ovarialinsuffizienz auf die Trainingsleistung zu testen, randomisierten es 7 Monate alten VCD-und Vehikel-behandelten Mäusen (zwei Stämme C57BL / 6 und B6C3F1) entweder sesshaft oder Käfig Rad Übungsgruppen 4-6 Wochen nach der Aufhören Radfahren (Abbildung 1). Tägliche Bewegung Werte wurden für Zeit und Distanz für jedes ausgeübte Tier in der gesamten 4 Wochen Ausübungszeitraum erfasst. Wochenmittelwerte der täglichen Betrieb Werte für Entfernung, Zeit und Geschwindigkeit sind in Fig. 3 für C57BL / 6 Mäusen, die mit Vehikel behandelt oder VCD gezeigt. Wir hatten keine signifikanten Unterschiede in der Trainingsleistung von durchschnittlichen Tageszeit, Distanz und Geschwindigkeit auf dem Käfig Rad zwischen VCD-und Vehikel-behandelten Gruppen entweder in C57BL / 6 oder B6C3F1 Maus, gemessen anStamm (Fig. 4A). Die berechneten Rad-Laufgeschwindigkeiten allmählich über die 4-Wochen-Laufzeit, wie zuvor gezeigt 16 erhöht, aber waren nicht signifikant unterschiedlich zwischen experimentellen Gruppen. Diese Studien zeigen die Auswirkungen der VCD-induzierte Ovarialinsuffizienz auf freiwilligen Käfig Rad Übung transzendiert mindestens zwei Mausstämme.
Nach der Dauer des freiwilligen Käfig Rad Übung Protokoll wurden Morphometrie Körper aufgenommen und die Herzen wurden schnell ausgeschnitten und gewogen. Wir haben bereits gezeigt, dass die freiwillige Käfig Rad Übung bewirkt eine Zunahme der Herzmasse 16. Hier zeigen wir auch Herzhypertrophie in Reaktion auf Käfig-Rad Ausübung absolute Herzgewicht (HW) gemessen und HW normalisiert, um Schienbeinlänge (TL) (Tabelle 1). Im Vergleich zu sesshaften Kollegen Das absolute Herzmasse und HW / TL-Verhältnis waren signifikant höher im Fahrzeug-und VCD-behandelten Mäusen. Es gab jedoch keine Messbare Unterschiede in der Herzhypertrophie zwischen Kontroll-und VCD-induzierte Ovarialinsuffizienz Mäusen nach freiwilligen Käfig Rad Übung.
Weiter haben wir unfreiwillig (Zwangs-) Laufband, um die körperliche Belastbarkeit zu ermitteln. Wir zuerst zu einem Hochintensitäts Protokoll, Durchschnittsgeschwindigkeit schrittweise bis zur Erschöpfung erhöht alle 10 min unterworfen Mäusen. Im Durchschnitt beträgt die maximale Geschwindigkeit des Fahrzeugs behandelten Mäusen betrug 26,7 ± 0,95 m / min und die maximale Geschwindigkeit der VCD-behandelten Mäusen war 28 ± 1,4 m / min vor Erschöpfung. Wir verwendeten niedrigeren Intensität läuft bei 20 m / min (etwa 80% der maximalen), die für die Ausdauerleistungsfähigkeit zu untersuchen. Wie in 4B gezeigt, wurde kein signifikanter Unterschied in hoher oder niedriger Intensität der körperlichen Leistungsfähigkeit zwischen Fahrzeug und VCD behandelten Gruppe gefunden, was darauf hinweist, dass VCD-induzierte Ovarialinsuffizienz hatte keine Auswirkung auf die körperliche Belastbarkeit der Maus.
Abschließend hat der Menopause von VCD Behandlung induziert keine Auswirkungen auf entweder freiwillig oder gezwungen r unning Kapazität sowie die Herz adaptive Reaktion ausüben.
Fig. 1 ist. VCD-Verwaltung und Versuchsprotokoll. Mäuse wurden VCD (160 mg / kg) oder Sesamöl (MFK) ab Alter von 2 Monaten für 20 aufeinanderfolgende Tage verabreicht. Nach VCD-oder Fahrzeug Injektionen wurden Ovarialzyklen überwacht und cyclicities wurden wie im Methodenteil beschrieben. Verlust der Eierstockfunktion traten innerhalb 60-90 Tage und wurde von Vaginalzytologie bestätigt. Am Alter von 7 Monaten wurden die Mäuse auf freiwillige Käfig Rad Übung für 4 Wochen ausgesetzt oder zum Laufband-Protokoll unterzogen.
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. Abbildung 2 VCD-induzierte Eierstockversagen bei Mäusen A:. Zytologie einer ungefärbten vaginalen Abstrich von einem Fahrzeug eingespritzt Maus zeigt die vier Phasen des Sexualzyklus: 1) proestrous, überwiegend bestehend aus kernhaltige Epithelzellen 2) Brunst, gekennzeichnet durch un kern verhornten Zellen; 3) Metöstrus, bestehend aus kernhaltige Epithelzellen (Pfeile), un-kern verhornten Epithelzellen (Pfeile) und Leukozyten; 4) diestrus, vor allem bestehend aus Leukozyten; und B:. Durchschnittliche Länge (Tage) des Sexualzyklus des Fahrzeugs-und VCD-injizierten Gruppen. Ein Zyklus ab dem ersten Tag der Brunst bei dem ersten Tag der nächsten Periode in Östrus gemessen. Vaginalzytologie begann ca. 6 Wochen nach Beginn der Injektionen. Die Ovarialzyklen der VCD-injizierten Tieren unregelmäßig werden, im Vergleich zu Fahrzeug-injizierte Tiers, und nach 12 Zyklen Brunst, Zytologie aller VCD injizierten Tiere nicht mehr angezeigt Radfahren C:. H & E-Färbung von Eierstockgewebe bei 8 Monate alt. Querschnitte bei 5 um Dicke für Vehikel-behandelten (links) und VCD-behandelten (rechts) Mäusen bei 20X (oben) und 200-facher (unten) Vergrößerung gemacht. Eierstockgewebe bei 200-facher Vergrößerung zeigt die Anzahl der Follikel in Fahrzeug-Vergleich zum VCD-behandelten Mäusen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Freiwillige Käfig Rad Leistung im Fahrzeug-oder VCD-behandelten C57Bl/6J weiblichen Mäusen. Left Panel: Durchschnittliche Fahrstrecke (km /Tag) für jeden Zeitraum, über 1 Woche im 4-Wochen-Studie Zeitraum mittlere Platte:. Durchschnittliche Laufzeit (h / Tag) für jeden Zeitraum, über 1 Woche im 4-Wochen-Studie Zeitraum rechten Panel:. mittlere Fahrgeschwindigkeit (km / h) für jede 1 Woche Zeitraum, der 4-wöchigen Untersuchungszeitraums. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Freiwillige Käfig Rad und Laufband Leistung im Fahrzeug-und VCD-behandelten Mäusen. A: (Top Panel) C57BL / 6 durchschnittliche Laufstrecke (km / Tag) und die Zeit auf dem Rad (Stunden / Tag) für jeden 24 h über der 4-wöchigen Untersuchungszeitraums verbracht. (An der Unterseite) & #160; B6C3F1 durchschnittliche Laufstrecke (km / Tag) und die Zeit auf dem Rad (h / Tag) für jeden 24 h über der 4-wöchigen Untersuchungszeitraums B verbracht: C57BL / 6 Laufband-Parameter.. Maximale Zeit (Top Panel) und maximale Geschwindigkeit (botoom Panel) unter Verwendung von Protokollen im Methodenteil beschrieben.
Discussion
Sowohl Käfig Rad Bewegung und Laufband Übung Therapien haben in unseren früheren Studien 16,21,22 verwendet. Alle Tiere werden in speziellen Übungsräumen gehalten werden, um die Umwelt oder die menschliche Störungen zu minimieren. Jede Störung der Tiere biologischen Rhythmus kann erhebliche Auswirkungen auf Tiere Trainingsleistung. Daher sollten die gesamte Tierpflege, Leistungsüberwachung, Aufzeichnung und Bewegung Therapien innerhalb der gleichen Tageszeitrahmen durchgeführt werden. Die Ermittler sollten sich bemühen, zusätzliche Belastung für die Tiere durch Ausstellen Vorsichtsmaßnahmen wie Begrenzung der Dauer der Stressbelastung und gegebenenfalls für die Käfige zu vermeiden.
Cage Rad Übung
Bei der Vorbereitung der Käfig Rad Gerät, sollte das Rad leicht zugänglich sein für die Maus zu montieren und zu beenden. Es sollte minimal Betten auf dem Boden des Käfigs, Mäuse vor Verschachtelung um das Rad zu behindern und verhindern free-Rad-Bewegung. Der Magnetsensor auf dem feststehenden Teil des Rades und dem Magneten, um das freie Rad gesichert angeordnet, so dass jede Drehung des Rads zu zählen, wenn die Maus ausgeübt. Die Aufzeichnungseinrichtung zu dem Magnetsensor befestigt ist, sollte über dem Draht Deckel des Käfigs angeordnet sein, und alle freiliegenden Drähte entweder abgeklebt werden oder außerhalb der Reichweite aus den Mäusen gehalten, um eine Barriere gegen Fraßstellen zur Verfügung stellen müssen. Der Magnet und Magnetsensor wurden auch die entsprechenden Strukturen aufgezeichnet, um sowohl Schäden und ungewollte Bewegung zu verhindern. Bei der täglichen Datenerfassung, müssen alle Leitungen dicht mit Klebeband überprüft werden, um sicherzustellen, die Drähte intakt bleiben und sollte retaped wie nötig. Da es kann mehrere Tage für Mäuse an die neue Umgebung zu gewöhnen und beginnen, regelmäßig trainieren, sollten die Datenaufzeichnung zu jedem einzelnen Tier zugeschnitten werden. Obwohl Tiere neigen dazu, viele Stunden auf dem Rad zu verbringen, kommt der größte Teil der Lauf in der Nacht. Daher können einige Tiere hig zeigenh Leistungstätigkeit, auch wenn sie tagsüber ruhen, angezeigt. Darüber hinaus ist es nicht ungewöhnlich, dass einige Tiere begrenzt Käfig Radfahr aufweisen. Typischerweise Käfig Rad Aktivität, die auf durchschnittlich 1 km / Tag oder weniger beträgt ist das Ergebnis von zufälligen Käfig Aktivität und nicht mit einer erheblichen Lauf Reiz verbunden. Daher sollten die Tiere, deren Laufparameter 1 km / Tag oder 1 h / Tag oder weniger in der endgültigen Datenanalyse nonrunners ausgeschlossen.
Je nach den speziellen Anforderungen von einer einzelnen Studie und Stämme von Mäusen beteiligt sind, kann die Länge der Bewegung geändert werden. Unsere frühere Studie zeigte, dass für beide Mäusestämme beteiligt, die durchschnittlichen Rad-Laufgeschwindigkeiten und die Dauer der Übung auf den Käfig Rad allmählich erhöht und über die Zeit bis zur 4. Woche Plateau.
Cage Radfahr ist eine Art freiwillige Übung in Tiermodellen, die in der Regel als weniger stressig, die unter Bedingungen durchgeführt wird, übernommen. Unlike Laufband-Training, in dem bestimmte Parameter vorgegeben werden, die alle im Testkäfig ausgeführt ist freiwillig und leicht durch Umwelt-oder Verhaltens Hinweise betroffen. Daher werden die Vergleiche zwischen experimentellen Einstellungen typischerweise vermieden werden, wenn große Zahlen Versuchsgruppen eingesetzt werden. Weitere potentielle Forschungsbereiche, die von dieser Art von Übung Paradigma profitieren können, sind Studien, die Verhaltensreaktionen mit physiologischer Konsequenzen wie den kognitiven Neurowissenschaften zu integrieren. Für Studien mit den freiwilligen Käfig Rad Paradigma sind die wichtigsten Schritte Käfig einzurichten und Überwachung der Tätigkeiten ausüben.
Laufband-Training
Akklimatisierung Schritte sind notwendig, um Tiere für die Laufband-Protokoll vorzubereiten. Je nach dem spezifischen Zweck der einzelnen Studie kann die Dauer der Akklimatisierung variieren. In dieser Studie wurde ein Zeitraum von einer Woche gewählt, damit die Tiere acclimaß auf die Laufbandvorrichtung und Motorgeräusche in den Käfig, aufwärmen Zeiten sind ein wichtiger Schritt der Übung Trainingsplan. Ähnlich wie bei menschlichen Kollegen, muss die Mäuse sich, bevor man in irgendwelche intensive Übung Regime, um Verletzungen und möglichen Daten Artefakte zu vermeiden erwärmt werden. In dieser Studie haben wir begonnen, den Gürtel mit der niedrigsten Geschwindigkeit möglich (4 m / min) mit den Schocknetze ausgeschaltet für 15 min. Alle Mäuse beteiligt begann, auf und neben dem Riemen laufen. Die Stoß Gitter wurden dann eingeschaltet, und die Bandgeschwindigkeit auf 4 m / min gehalten. Um eine Überbeanspruchung der Mäuse zu vermeiden, setzen wir den Stromschlag an einer milden Ebene (1 Hz). Innerhalb von ein paar Tagen, alle Mäuse angepasst an das Laufband.
Die Dauer der laufenden wie auch die Beschleunigung kann auch auf jedem Versuchsdesign angepasst werden. Eine empfohlene Startbeschleunigung beträgt 1 m / min. Die Laufbahnen der Mäuse Anzeichen von Erschöpfung muss sofort abgeschaltet werden. Typischerweise Anzeichen von Erschöpfung durch mi ausgestelltce auf dem Laufband sind wie folgt:
- Ständige Einwirkung des Schockgitter für> 5-10 sec,
- Verlust der Laufleistung, was zu Stoß Gitter Exposition> 5x während einer einzigen Trainingsprogramm, und
- Verlust der Laufleistung, was zu Stoß Gitter Exposition> 2 Sek. mindestens 3x während einer einzigen Trainingsprogramm.
Die oben genannten Werte sind in erster Linie als Richtlinien für einen bestimmten Versuch verwendet werden. Diese Parameter müssen für jede Übung Protokoll bestimmt werden, da es variiert von Mausstamm zu Mausstamm, Versuch zu Versuch und Ermittler Ermittler.
Anders als Käfig Rad Bewegung, Laufband müssen Studien mehrmals wiederholt werden, um die Auswirkungen von Umwelt-und biologischen Faktoren auf die Laufleistung zu beseitigen. Es ist nicht ungewöhnlich, dass Schwankungen in der Laufleistung zwischen den Tests selbst für das gleiche Tier zu sehen. Da jeder Trainingsprogramm aussetzt läuft Mäusen zu einer stress, eine angemessene Warteintervall zwischen den Tests notwendig. Nach unserer Erfahrung 2-3 Tage Ruhezeit zwischen den einzelnen Test war ausreichend für Mäuse zu erholen.
Wie menschliche Laufband wird die Geschwindigkeit für Ausdauertraining am besten durch die Herzfrequenz oder Sauerstoffsättigung des Blutes, ein technisch schwieriges Unterfangen mit Maus-Studien bestimmt. Der wichtigste Schritt der Laufband-Studien ist die Bestimmung der Erschöpfung, die in der Regel variiert zwischen einzelnen Mäusen und wurde als 80% der maximalen Drehzahl. In unserer eigenen Erfahrung die Aufzeichnung der Ergebnisse können signifikant zwischen einzelnen Forschern, da die Kriterien für die Erschöpfung sind meist subjektiv. Somit ist die konsequente Anwendung der gleichen Kriterien bei der Aufnahme entscheidend.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NIH (HL 098256), von einem National-und Mentored Forschung Wissenschaft Development Award (K01 AR052840) und Unabhängige Scientist Award (K02 HL105799) von der NIH JP Konhilas und der interdisziplinären Ausbildung Grant Herz-Kreislauf Wissenschaften (HL007249 ausgezeichnet unterstützt ). Unterstützung wurde von der Sarver Herzzentrum an der Universität von Arizona und von Steven M. Gootter-Stiftung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Vinylcyclohexene diepoxide (VCD) | Sigma | V-3630 | |
| 11.5 cm Diameter wheel with a 5.0 cm wide running surface | Petsmart | model 6208 | |
| Digital magnetic counter | Sigma Sport | model BC 600 | |
| Treadmill exercise | Columbus Instruments | model 1055SDRM |
References
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