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Immunology and Infection

स्वचालित पृथक्करण doi: 10.3791/51090 Published: March 21, 2014

Summary

wormsorter फ्लोरोसेंट पत्रकारों की अभिव्यक्ति के अनुसार कीड़े छँटाई द्वारा Caenorhabditis एलिगेंस में आनुवंशिक स्क्रीन की सुविधा. यहाँ, हम एक नए प्रयोग का वर्णन: एक GFP-व्यक्त रोगज़नक़ द्वारा उपनिवेशन के अनुसार छँटाई, और हम प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया शुरू करने में रोगज़नक़ मान्यता के खराब समझ भूमिका की जांच करने के लिए यह रोजगार.

Abstract

wormsorter Caenorhabditis एलिगेंस की पढ़ाई में प्रयोग किया जाता है कि एक FACS मशीन के अनुरूप एक साधन है, जो आम तौर पर एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की अभिव्यक्ति के आधार पर कीड़े सॉर्ट करने के लिए. यहाँ, हम एक GFP-व्यक्त रोगज़नक़ द्वारा उपनिवेशन के अपने डिग्री के अनुसार कीड़े छँटाई के लिए, इस उपकरण के लिए एक विकल्प के उपयोग पर प्रकाश डाला. इस नए प्रयोग हमें कीड़ा आंत और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के शामिल के उपनिवेशवाद के बीच के रिश्ते को संबोधित करने की अनुमति दी. जबकि सी. विभिन्न रोगजनकों के लिए एलिगेंस प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है कि यह उन्हें आरंभ करता है क्या अभी भी अज्ञात है, प्रलेखित किया गया है. (परस्पर अनन्य नहीं कर रहे हैं) दो मुख्य संभावनाओं रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न की पहचान, और संक्रमण की वजह से नुकसान का पता लगाने के हैं. दो संभावनाओं के बीच अंतर करने, रोगज़नक़ के लिए जोखिम का कारण बनता क्षति से अलग किया जाना चाहिए. ग्राम n द्वारा बड़े पैमाने पर-उपनिवेश थे कि कीड़े के wormsorter सक्षम जुदाईउपनिवेश इसी अवगत कराया गया कि कीड़े से होने की संभावना रोगज़नक़ लोड की वजह से नुकसान, लेकिन नहीं, या सीमांत, साथ egative रोगज़नक़ Pseudomonas aeruginosa,. ये अलग आबादी रोगज़नक़ लोड और transcriptional प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के शामिल के बीच संबंध का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया. परिणाम दो रोगज़नक़ मान्यता की संभावना का समर्थन करते हुए अलग कर रहे हैं कि सुझाव देते हैं.

Introduction

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स्वचालित कीड़ा छँटाई, यह एक ट्यूब में सीधा गुजरता है (आमतौर पर संवाददाता प्रोटीन की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति द्वारा प्रदान की) एक कीड़ा में एक फ्लोरोसेंट संकेत को मापने के द्वारा संचालन पुनर्निर्देशन या तो एक संग्रह ट्यूब को अच्छी तरह / या बर्बादी कंटेनर के अनुसार, की अनुमति ज्यादा FACS की तरह है शोधकर्ता 1 द्वारा निर्धारित मापदंडों gating के लिए. wormsorter कई मायनों में अनुसंधान की सुविधा कर सकते हैं, एक विश्लेषणात्मक उपकरण के रूप में यह रोजगार का एक उदाहरण लगभग 1,000 जीन 2 के लिए प्रमोटर गतिविधि के spatiotemporal पैटर्न का पालन किया है कि एक अध्ययन है.
हालांकि, wormsorter के प्रमुख उपयोग लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति के स्तर या कीड़ा 3-5 की धुरी के साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन का स्थानीयकरण निम्नलिखित, आनुवंशिक स्क्रीन में है.

यहाँ, हम एक fluorescently टैग किया रोगज़नक़ द्वारा कीड़ा के उपनिवेशन निम्नलिखित में, wormsorter के लिए एक नया आवेदन का वर्णन. इस के साथ एक उपकरण के रूप में हम pathog के बीच के रिश्ते पर केंद्रितउपनिवेशन / भार और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया एन, कृमि में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की दीक्षा के लिए जिम्मेदार तंत्र में नए अंतर्दृष्टि लाभ.

तारीख करने के लिए अध्ययन लगभग सभी जीवों में, माइक्रोबियल रोगज़नक़ों को सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की दीक्षा रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) की मान्यता पर निर्भर करता है, और / या खतरे / क्षति जुड़े आणविक पैटर्न (damps) 6,7. माइक्रोबियल सेल दीवार, इसके कशाभिका, या अपने लिपिड bilayer 6 के घटक शामिल हैं कि पहले संरक्षित कर रहे हैं माइक्रोबियल संरचनाओं, दूसरा, दोनों जारी अणुओं (जैसे एटीपी 8), बदल प्रोटीन या बदल सेलुलर प्रक्रियाओं 9,10 के अन्य मार्करों शामिल हैं. संकेतों के दोनों प्रकार के विशिष्ट पर एक पैटर्न अणु के बंधन एक रक्षात्मक प्रतिक्रिया के लिए प्रमुख घटनाओं की एक श्रृंखला को सक्रिय जो पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (PRRs), के रूप में नामित प्रोटीन द्वारा मान्यता प्राप्त हैं. सी. एलिगेंस एक tracta के रूप में अत्यंत उपयोगी हो गया हैble मॉडल मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के विभिन्न पहलुओं को काटना, लेकिन अच्छी तरह से नहीं समझा गया है कि एक बात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया कीड़ा में शुरू कर रहे हैं कि कैसे करने के लिए. अन्य जीवों में पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (PRRs) को orthologous हैं कि ख्यात रिसेप्टर्स में से कोई भी PAMPs बाध्य करने के लिए दिखाया गया है, और अन्य जीवों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए निर्णायक हैं कि PRRs की orthologs के कई कीड़ा रोगज़नक़ उत्तर करने के लिए एक आश्चर्यजनक सीमित योगदान दिखाने और प्रतिरोध. उदाहरण के लिए, ग्राम पॉजिटिव रोगजनकों विरोध करने के लिए आवश्यक है जो ड्रोसोफिला टोल रिसेप्टर, सी. में प्रतिनिधित्व किया है यह दर्शाता डेटा के साथ संयुक्त नहीं बल्कि अन्य परीक्षण किया ग्राम नकारात्मक, या पॉजिटिव रोगजनकों 11,12 से, ग्राम नकारात्मक रोगज़नक़ साल्मोनेला 11 से संरक्षण के लिए योगदान देता है. इन टिप्पणियों एकमात्र Homolog, सहने-1,, द्वारा एलिगेंस कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया सेलुलर प्रोटीन अनुवाद घंटे में बाधा पहुँचा द्वारा प्रेरित किया जा सकता हैके नेतृत्व के रूप में कुछ करने के लिए सुझाव है कि सी. एलिगेंस मुख्य रूप damps 9,13,14 का पता लगाता है. फिर भी, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित करने के लिए मृत रोगजनकों की क्षमता का वर्णन रिपोर्टों PAMP बंधन सी. में रोगज़नक़ मान्यता में एक महत्वपूर्ण भूमिका है हो सकता है एलिगेंस 15,16. उम्र सिंक्रनाइज़ आनुवंशिक रूप से समान सी. में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर ध्यान केंद्रित पिछला काम एलिगेंस आबादी, जीवाणु ग्राम नकारात्मक रोगज़नक़ Pseudomonas aeruginosa से आंतों उपनिवेशन में बड़ी व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता का प्रदर्शन किया.

हालांकि, transcriptional रूपरेखा पढ़ाई एक इकाई 17,18 के रूप में इन अस्थायित्व-उपनिवेश आबादी का इलाज किया. इस परिवर्तनशीलता का लाभ उठाते हुए, हम GFP-व्यक्त पी. के संपर्क में Caenorhabditis एलिगेंस के विभिन्न उपनिवेश आबादी को अलग करने के लिए एक स्वचालित wormsorter ध्यान केंद्रित एक प्रोटोकॉल विकसित aeruginosa. अलग ढंग-उपनिवेश आबादी में जीन अभिव्यक्ति faci की जांचरोगज़नक़ लोड (और जुड़े नुकसान) और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और सी में रोगज़नक़ मान्यता के बारे में उपलब्ध कराई गई नई अंतर्दृष्टि के बीच के रिश्ते की litated मूल्यांकन एलिगेंस 19. हम किसी भी fluorescently लेबल रोगज़नक़ से संक्रमित कीड़े सॉर्ट करने के लिए लागू किया जा सकता है जो प्रोटोकॉल का वर्णन नीचे.

संभावित प्रयोक्ताओं के लिए इसे बाहर हल किया जाना आवश्यक कीड़े की संख्या में उपयोग में बाद के विश्लेषण और प्रोटोकॉल की प्रकृति पर निर्भर करता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के मामले में,> 1,000 कीड़े मानक प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाता है, तो पर्याप्त शाही सेना प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो जाएगा, लेकिन प्रवर्धन कार्यरत है अगर ~ 100 कीड़े पर्याप्त होगा, माल की तेजी से संग्रह की अनुमति है और इस तरह के लिए तनाव को कम करने कीड़े.

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Protocol

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1. युवा वयस्क जानवरों की एक तुल्यकालन संस्कृति प्राप्त

  1. OP50-1 ई. के साथ वरीयता प्राप्त कई एन जी एम प्लेटों पर कीड़े हो जाना कोलाई बैक्टीरिया (10x एक संतृप्त संस्कृति से केंद्रित) कई कीड़े गर्भवती चरण में पहुंच गया है जब तक.
  2. एक तुल्यकालन संस्कृति (अंडे) प्राप्त करने के लिए अंडे प्रस्तुत करने का समाधान के साथ गर्भवती पशुओं का इलाज.
  3. कई 60 मिमी एन जी एम प्लेटों पर प्लेट अंडे मोटे तौर पर 150-200 अंडे / प्लेट के घनत्व पर 10x केंद्रित OP50-1 के साथ वरीयता प्राप्त.
  4. (- युवा वयस्क मंच कीड़े L4 पर पहुँच गए हैं जब तक) 2 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं.

2. Pseudomonas aeruginosa प्लेट्स की तैयारी और कीड़े संक्रमण

  1. अंडा प्रस्तुत करने का (1.1 कदम) के दिन 100 ग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में राजा के बी मीडिया वाले रिफैम्पिसिन के 2 मिलीलीटर में एक PA14 :: GFP संस्कृति टीका लगाना. आंदोलन हे / एन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति सेते
  2. PA14 :: GFP संस्कृति प्लेटपरख के लिए आवश्यक के रूप में कई धीरे किलिंग प्लेट्स (एसकेपी) पर ture. प्रत्येक 150 मिमी एसकेपी पेट्री डिश पिपेट में 75-100 संतृप्त संस्कृति के μl और एक बाँझ कांच स्प्रेडर का उपयोग समान रूप से फैला. 20-24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं.
  3. इनक्यूबेटर से प्लेटें निकालें और उन्हें आरटी (~ 20 मिनट) को शांत करने के लिए अनुमति देते हैं. M9 बफर का प्रयोग, PA14 पर 1.4 कदम से कीड़े धो :: GFP प्लेटें तरल पदार्थ की एक न्यूनतम मात्रा में. 150 मिमी प्लेट का उपयोग करते हैं, तो कई सौ कीड़े एक ही थाली पर रखा जा सकता है.
  4. 18-21 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं. पी. के लिए aeruginosa उजागर युवा वयस्क कीड़े, इस noncolonized जानवरों बनाम उपनिवेश का इष्टतम वितरण प्रदर्शित समय खिड़की है.

3. Wormsorter स्थापना

नमूना के आधार पर क्रमबद्ध प्रदर्शन से पहले, मशीन ठीक से कार्य कर रहा है यह सुनिश्चित. विवरण http://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43 पर प्राप्त किया, और वें किया जा सकता हैई आवश्यक कदम नीचे उल्लिखित हैं.

  1. लगभग 5 साई (4.5-5.5 रेंज) को म्यान वाल्व दबाव सेट करें.
  2. , कि म्यान द्रव का प्रवाह दर उचित है सत्यापित निकालने की मशीन के नीचे एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब जगह, म्यान वाल्व पर बारी, और सॉर्टर वाल्व बंद करने के लिए. 60 सेकंड के लिए निकालने की मशीन के नीचे ट्यूब पकड़ो. ट्यूब में मात्रा 9-10 मिलीग्राम होना चाहिए. यह इस सीमा के बाहर है, तो उसके अनुसार म्यान वाल्व दबाव को समायोजित.
  3. (3.2 कदम के रूप में स्थापित) कि म्यान द्रव का प्रवाह दर 40 माइक्रोन नियंत्रण कणों का उपयोग के आधार पर क्रमबद्ध दर परीक्षण सटीक छँटाई अनुमति देगा सुनिश्चित करने के लिए:
  4. म्यान वाल्व बंद करें. जलाशय को नियंत्रण कण समाधान के बारे में 25 मिलीलीटर जोड़ें.
  5. म्यान वाल्व, और नमूना वाल्व चालू करें.
  6. कंप्यूटर सॉफ्टवेयर पर, "नियंत्रण कण मोड" नेविगेट करने के लिए और प्राप्त क्लिक करें.
  7. कण प्रवाह की दर चौड़ाई approximating एक TOF (उड़ान के समय) के साथ, ~ 5-8 कणों / सेक है सुनिश्चित करेंकण की, 40 माइक्रोन. इस तरह की एक TOF केवल एक ही 40 माइक्रोन वस्तु एक समय में के माध्यम से गुजर रहा है. मानों इस सीमा के बाहर हैं, तो तदनुसार (ऊपर निर्देशों का पालन) सेटिंग्स समायोजित.

4. Noncolonized कीड़े बनाम उपनिवेश छँटाई

  1. M9 का उपयोग करना, 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में कीड़े धो लो. वयस्क कीड़े गंभीरता से ट्यूब के नीचे सिंक और सतह पर तैरनेवाला हटाने की अनुमति दें. ताजा M9 साथ ट्यूब भरें. इस प्रक्रिया 3-4x दोहराएँ. यह एक लार्वा का बड़ा हिस्सा साथ ही साथ अतिरिक्त बैक्टीरिया को हटाता है और के बारे में 10 मिनट लगते हैं.
  2. एक धीरे मिश्रण छोटे हलचल पट्टी के साथ wormsorter जलाशय को कीड़े जोड़ें.
  3. 200 को 600 ग्रीन पीएमटी की स्थापना और लाल और पीला पीएमटी द्वारा प्रारंभिक संकेत लाभ को समायोजित करें.
  4. सेटिंग्स समायोजित करने के लिए डेटा प्राप्त करने के लिए शुरू.
  5. प्रति सेकंड 25-30 घटनाओं (कीड़े) के एक प्रकार के दर के लिए निशाना लगाओ. संख्या की दर बहुत अधिक है, उसके अनुसार M9 के साथ जलाशय में कीड़े पतला. मूल्यांकन करने के लिए है, तोओ कम, M9 की एक छोटी मात्रा में अधिक कीड़े जोड़ें.
  6. प्रयोग noncolonized कीड़े बनाम उपनिवेश का एक बहुत कड़े जुदाई की आवश्यकता है, "संयोग की जांच करने के लिए" "शुद्ध" सेट. इस घटना में दो वस्तुओं एक दूसरे के बहुत करीब होते हैं या एक ही बूंद में, मशीन बल्कि यह संग्रह से बूंद को खारिज कर दिया कि यह सुनिश्चित करता है.
  7. ब्याज की आबादी सॉर्ट आकार (वयस्क कीड़े प्राप्त करने के लिए) और (noncolonized के लिए कम उपनिवेश के लिए यानी उच्च,) प्रतिदीप्ति तीव्रता का संकेत कुल्हाड़ियों के आसपास फाटकों आकर्षित करने के लिए. प्रतिदीप्ति gating के लिए मूल्यों अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए.
  8. कीड़े छँटाई शुरू करने के आधार पर क्रमबद्ध वाल्व खुला तो कीड़े इकट्ठा करने के लिए एक बहु - अच्छी तरह से थाली या निकालने की मशीन के नीचे एक पेट्री डिश में रखें.
  9. क्रमबद्ध आबादी ब्याज की जनसंख्या है कि खुर्दबीन के नीचे सत्यापित करने के लिए पशुओं की एक छोटी सी आबादी लीजिए. यदि नहीं, तो तदनुसार gating मापदंडों को समायोजित करने और नमूना संग्रह के साथ जारी है.

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Representative Results

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उम्र से मिलान करते हैं, आनुवंशिक रूप से समान सी. एलिगेंस पी. के संपर्क में हैं aeruginosa, एक व्यापक वितरण उपनिवेशन (चित्रा 1 ए) के स्तर में मनाया जाता है. उपनिवेश कीड़े से noncolonized के कुशल जुदाई (चित्रा 1 बी) प्राप्त किया जा सकता यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल की मदद से. Noncolonized कीड़े के विपरीत, उपनिवेश कीड़े ऐसी सुस्ती और कम शौच 19 के रूप में क्षति के लक्षण दिखा. बाद के कीड़े पी. द्वारा उपनिवेश एक कारण हो सकता है aeruginosa कठिनाई संक्रमण समाशोधन है. इस noncolonized रूप में हल कीड़े पहले उपनिवेश नहीं थे, सुझाव है कि वर्णित प्रोटोकॉल के लिए सीधा प्रभाव पड़ता है. सीधे इस दावे को सही है कि क्या परीक्षण करने के लिए, हाथ उठाया उपनिवेश कीड़े छँटाई प्रयोग में उन के रूप में इसी तरह धोने कदम के अधीन है और बाद में एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे की जांच की गई, केवल 4/56 रोगज़नक़ को मंजूरी दे दी. इसलिए, यह संभावना वें हैnoncolonized रूप में हल उन लोगों के बीच पहले उपनिवेश कीड़े के अनुपात में नगण्य है. हालांकि, यह पी. के अलावा अन्य रोगजनकों के लिए एक मुद्दे के और अधिक हो सकता है जो विश्लेषण पर गलत छँटाई के प्रभाव को रोकने के लिए वाशिंग चरणों के दौरान उपनिवेशन में परिवर्तन की निगरानी करने की सलाह दी जाती है aeruginosa.

एक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए क्रमबद्ध कीड़े का इस्तेमाल किया और पी. के लिए अनिवार्य रूप से समान प्रतिक्रियाओं मनाया यहां वर्णित प्रोटोकॉल को रोजगार पिछला काम समय 19 साल की एक ही राशि के लिए रोगज़नक़ को उजागर किया गया था कि उपनिवेश और noncolonized कीड़ा आबादी में aeruginosa. 2 सी का हिस्सा बनने के लिए जाना जाता चार जीनों की अभिव्यक्ति को मापने के लिए मात्रात्मक (क्यू) आरटी पीसीआर का उपयोग इसी प्रवृत्ति को दर्शाता है चित्रा . एलिगेंस प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया: LYS-2 एक लाइसोजाइम, F08G5.6 और F55G11.2 पहले भी infec के लिए जो योगदान के संक्रमण के लिए विशेष रूप से जवाब है कि दो uncharacterized जीन हैं encodestion के प्रतिरोध, और पीजीपी -5, संक्रमण करने के साथ ही भारी धातु को तनाव प्रतिक्रिया है. सभी चार जीन पी. द्वारा इसी प्रेरित थे परवाह किए बिना कीड़े के उपनिवेशन स्थिति की aeruginosa जोखिम,. इस बसाना और उसके संबंधित क्षति के बजाय संकेत के रूप में रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न तरफ इशारा करते हुए, एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक नहीं कर रहे हैं यह दर्शाता है कि पहले प्रकाशित परिणामों की पुष्टि होती है. यही पीजीपी-5 व्यापक क्षति का सामना होने की उम्मीद नहीं कर रहे हैं जो noncolonized जानवरों में प्रेरित है, सी. में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और सामान्य तनाव प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित विनियामक कार्यक्रमों में एक ओवरलैप पता चलता है एलिगेंस.

चित्रा 1
चित्रा 1. उपनिवेश और सी. noncolonized एलिगेंस एक wormsorte का उपयोग कर अलग कियाजंगली प्रकार वयस्क सी. आर. (ए) प्रतिनिधि छवि GFP-व्यक्त पी. के संपर्क में एलिगेंस 18 घंटे के लिए aeruginosa. (बी) एक noncolonized और उपनिवेश कीड़े की छवियों प्रतिनिधि wormsorter का उपयोग कर अलग कर दिया. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. औपनिवेशीकरण पी. के लिए ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक नहीं है aeruginosa. LYS-2 (ए) की शाही सेना के स्तर, F08G5.6 (बी), F55G11.2 (सी), और जंगली प्रकार के पशुओं में QRT-पीसीआर द्वारा मापा पीजीपी-5 (डी) ई. से अवगत कराया कोली या पी. aeruginosa </ ~ 18 घंटे के लिए उन्हें>. इसका मतलब है और तीन का एक प्रतिनिधि है जो एक प्रयोग है, से डुप्लिकेट माप के एसडी दिखाया गया. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

तालिका 1
तालिका 1. सामग्री और एक wormsorter प्रयोग के लिए आवश्यक अभिकर्मकों.

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Discussion

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हम वर्णन विधि कीड़ा और इसके माहौल के बीच बातचीत का पालन करने के लिए, कृमि के बाहर संस्थाओं के फ्लोरोसेंट लेबलिंग का लाभ लेता है. हम वर्तमान मामले में, जुदाई एक रोगज़नक़ की लेबलिंग के आधार पर किया गया था और नहीं (या प्रकाश) भार के साथ उन लोगों से भारी रोगज़नक़ भार के साथ अलग कीड़े के लिए नियुक्त किया गया था. इसके बाद जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण वे रोगज़नक़ लोड की स्वतंत्र थे, सुझाव है कि दो समूहों के बीच प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में कोई अंतर नहीं पाया. प्रतिक्रिया शुरू संकेत है कि शारीरिक रूप से यह संकेत एक PAMP हो सकता है, सुझाव है कि बल्कि स्रावित किया जा रहा है, की तुलना में बैक्टीरिया के साथ जुड़े होने के लिए कहीं दिखाया गया था. साथ में, इन परिणामों PAMP मान्यता सी. में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया शुरू करने में एक भूमिका निभाता है कि परिकल्पना का समर्थन किया एलिगेंस 19.

ऊपर वर्णित छँटाई प्रोटोकॉल का एक लाभ यह दोनों उपनिवेश और noncolonized कीड़े एक एकल आबादी से अलग कर रहे हैं. गुहै noncolonized बनाम उपनिवेश रहे हैं कि जानवरों की एक इष्टतम वितरण के साथ एक जनसंख्या होने पर निर्भर करता है. हमने पाया है कि पी. के साथ युवा वयस्क, जंगली प्रकार के कीड़े को संक्रमित जब aeruginosa, यह मोटे तौर पर 18 घंटे के एक जोखिम समय के लिए corresponded. इस प्रदर्शन के समय पशुओं के बहुमत एक "मध्यवर्ती" डिग्री तक उपनिवेश, लेकिन कई सौ कीड़े पूर्ण बसाना दिखाया है, और एक समान संख्या noncolonized गया गया जहां एक की आबादी का उत्पादन किया. यह हमारे उद्देश्यों के लिए इष्टतम वितरण का प्रतिनिधित्व करता है, दूसरों को अपने स्वयं के इष्टतम वितरण परिभाषित कर सकते हैं.

छँटाई के दौरान, यह एक प्रयोग में बनी "गुणवत्ता नियंत्रण" है उचित है. हम दो तरह से किया है कि. एक, जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए, हम जीन की एक सीमित सेट पर QRT-पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो एक फ्लोरोसेंट विदारक माइक्रोस्कोप के तहत (उपनिवेश और noncolonized) कीड़े की एक छोटी संख्या हाथ उठाया. ये क्या जीन expressi के लिए "सोने के मानक 'के रूप में सेवावास्तव में एक शुद्ध आबादी में पर लग जाएगा. दूसरे, यह उम्मीद के रूप में साधन प्रदर्शन कर रहा है कि एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे सत्यापित करने के लिए प्रत्येक स्वतः ही हल आबादी के लिए एक थाली करने के लिए 20 या अधिक कीड़े सॉर्ट करने के लिए अच्छा अभ्यास है. बहाव के आवेदन के आधार पर, सॉर्टिंग प्रोटोकॉल का "निष्ठा" के विभिन्न डिग्री आवश्यक हो सकता है. क्रमबद्ध कीड़े उपनिवेशवाद का वांछित डिग्री के अनुरूप नहीं है, gating मानकों (कदम 4.7) समायोजित किया जाना चाहिए. यह फाटक, उच्च प्रारंभिक जरूरत कीड़े की संख्या, और प्रयोगों के हिसाब से बढ़ाया जा चाहिए और अधिक कड़े कि ध्यान दिया जाना चाहिए.

यहाँ वर्णित प्रयोग (यह fluorescently टैग है जब तक) ब्याज की किसी भी रोगज़नक़ के साथ किया जा सकता है. छंटाई के बाद, बाद के विश्लेषण जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण का पालन करने की जरूरत नहीं है, और जीवित रहने या भी व्यवहार विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित कर सके. इसके अलावा, इसी तरह के प्रोटोकॉल विश्लेषणात्मक उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, Metabolite अवशोषण का पालन करने के लिए, या रोगज़नक़ लोड, 20,21 अत्यधिक चर रहे हैं जो CFU मायने रखता है, के लिए एक आसान विकल्प उपलब्ध कराने के उत्तरार्द्ध यों की. संख्या में और गति में वृद्धि आनुवंशिक मेजबान में अवरोधों या रोगज़नक़, और विभिन्न पर्यावरणीय स्थितियों सहित विभिन्न शर्तों के तहत रोगज़नक़ भार बढ़ाता सुविधा सकता है. Wormsorter बसाना ट्रैकिंग, अनेक फ्लोरोसेंट अणु का पता लगाने के लिए सुसज्जित किया जा सकता, क्योंकि इसके अलावा, जीवाणु का एक प्रकार तक सीमित नहीं होना चाहिए. यह क्षमता अलग रोगाणुओं उपनिवेशन के लिए प्रतिस्पर्धा करने के लिए अनुमति देता है, पारिस्थितिक अध्ययन के लिए उपयोगी होगा. रोगजनन, सी. के प्रयोगशाला अध्ययन में एलिगेंस आमतौर पर एक जीवाणु मोनोकल्चर पर उगाया जाता है. हालांकि, रोगजनकों उन्मुक्ति प्रभाव हो सकता है कि अन्य सूक्ष्म जीवाणुओं के सैकड़ों लोगों के बीच मौजूद है, जहां जंगली, में जन्मजात उन्मुक्ति के तंत्र का अध्ययन ध्यान 22,23 जुटाने में लगा है.

सारांश, usin मेंजी आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए wormsorter प्रयोगों एक कम समय में किया जा करने की अनुमति देता है, और / या बड़े पैमाने पर. इस तरह के अनुप्रयोगों के प्रदर्शनों की सूची का विस्तार करना सेल्सियस की हमारी समझ अग्रिम सकता शरीर विज्ञान एलिगेंस. विशेष रूप से, सी. के क्षेत्र में एलिगेंस सहज प्रतिरक्षा, अस्तित्व के विभिन्न जीनों का योगदान परीक्षण के लिए एक अक्सर प्रयुक्त मेट्रिक है. हालांकि, उपनिवेशन अभी भी एक कार्यात्मक उत्पादन प्रदान करते हुए उन्मुक्ति आरंभ कि घटनाओं को अधिक समीपस्थ है. यहाँ वर्णित के रूप में ब्याज की आबादी को अलग और / या विश्लेषण करने के लिए प्रोटोकॉल का प्रयोग कीड़ा में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्रारंभिक घटनाओं के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखक अपने समर्थन के लिए एलिसन मेडिकल फाउंडेशन धन्यवाद. हम wormsorter उपयोग करने के साथ सहायता के लिए एबी Dernburg प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद भी कामना करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
M9 Buffer prepared in house Recipe at wormbook.org
Rifampicin Sigma R3501
Egg prep solution prepared in house 50 ml water; 40 ml bleach; 10 ml of 10 N sodium hydroxide
NGM plates prepared in house Recipe at wormbook.org
SKP plates prepared in house Recipe same as NGM only 0.35% peptone instead of 0.25%
Control test particles Union Biometrica 310-5071-001

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References

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स्वचालित पृथक्करण<em&gt; सी. एलिगेंस</em&gt; अस्थायित्व से एक जीवाणु रोगज़नक़ द्वारा उपनिवेश
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Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen. J. Vis. Exp. (85), e51090, doi:10.3791/51090 (2014).More

Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen. J. Vis. Exp. (85), e51090, doi:10.3791/51090 (2014).

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