Primäre Kultur der Menschen vestibuläre Schwannome

Summary

Vestibuläre Schwannome (VSS) nicht-malignen Tumoren von Schwann-Zellen (SC) Ursprungs, mit Mutationen im NF2 Tumorsuppressor-Gen assoziiert ist. Wir berichten über einen reproduzierbaren, effizienten Protokoll für primäre humane VS Zellkultur, die für die molekulare und zelluläre experimentelle Manipulation und Analyse ermöglicht und rekapituliert die heterogene Natur der menschlichen Krankheit.

Abstract

Vestibuläre Schwannome (VSS) stellen Schwann-Zellen (SC) Tumoren des Nervus vestibularis, Kompromisse 10% aller intrakraniellen Neoplasmen. VSs treten entweder sporadisch oder familiär (Neurofibromatose Typ 2, NF2) Formen, die beide mit Inaktivierung von Defekten in der NF2 Tumorsuppressor verbunden Gen. Die Behandlung ist in der Regel für VSS chirurgische Resektion oder Radiochirurgie, aber die Morbidität dieser Verfahren hat Ermittlungen in weniger invasive Behandlungen angetrieben. Historisch sind der fehlende Zugang zu frischen Gewebeproben und der Tatsache, dass Schwannom Zellen nicht verewigt deutlich die Verwendung von Primärkulturen zur Untersuchung der Tumorgenese Schwannom behindert. Um das begrenzte Angebot an Primärkulturen zu überwinden, wurde die verewigt HEI193 VS Zelllinie durch Transduktion mit HPV-Onkogene E6 und E7 erzeugt. Diese onkogene Transduktion eingeführt signifikanten molekularen und phänotypischen Veränderungen der Zellen, die ihre Verwendung als Modell für menschliche s begrenzenchwannoma Tumoren. Wir stellen daher eine vereinfachte, reproduzierbare Protokoll für die Kultur von primären humanen Zellen VS. Diese leicht zu beherrschen Technik ermöglicht molekularen und zellulären Untersuchungen, genauer rekapitulieren die Komplexität der VS Krankheit.

Introduction

Vestibuläre Schwannome (VSS) stellen Schwann-Zellen (SC) Tumoren des Nervus vestibularis, Kompromisse 10% aller intrakraniellen Neoplasmen ^1-3. VSs treten entweder sporadisch oder familiär (Neurofibromatose Typ 2, NF2) Formen, die beide mit Inaktivierung von Defekten in der NF2 Tumorsuppressor verbunden Gen. Die Behandlung ist in der Regel für VSS chirurgische Resektion oder Radiochirurgie, aber die Morbidität dieser Verfahren beinhaltet Taubheit, Gesichts Neuropathien, Rückenmarksflüssigkeit auslaufen, Ungleichgewicht, und ^ein erneutes Tumorwachstum. Außerdem werden nicht alle Patienten sind akzeptabel chirurgischen oder strahlen Kandidaten. Solche erheblichen Morbidität sowie ein Mangel an alternativen Therapien hat die Untersuchung in die einzigartige molekulare Biologie der VSs in der Hoffnung, die Entwicklung neuer Behandlungen ^3,4 angetrieben.

Zellkultur ermöglicht eine schnelle, einfache und gründliche Analyse der molekularen und zellulären Verhalten und Screening von potenziellen therapeutischen comPfund. Historisch sind der fehlende Zugang zu frischen Gewebeproben und der Tatsache, dass Schwannom Zellen nicht verewigt deutlich die Verwendung von Primärkulturen zur Untersuchung der Tumorgenese Schwannom behindert. Um das begrenzte Angebot an Primärkulturen zu überwinden, wurde die verewigt HEI193 VS Zelllinie durch Transduktion mit HPV-Onkogene E6 und E7 ⁵ erzeugt. Diese onkogene Transduktion eingeführt signifikanten molekularen und phänotypischen Veränderungen der Zellen, die ihre Verwendung als Modell für menschliche Tumoren Schwannom begrenzen. SC Kulturen aus transgenen Mauslinien, die eine funktionelle NF2-Gen fehlt abgeleitet sind eine weitere Alternative zu NF2 abhängige SC Tumorgenese in vitro zu untersuchen. Diese Kulturen allerdings nicht die heterogene Natur der menschlichen VSs oder Konto für den menschlichen bestimmtes Verhalten zu rekapitulieren. Die meisten bisherigen VS Kulturtechniken benötigt relativ lange Bearbeitungszeiten und komplizierte selektiven Kulturtechniken ^8.6.Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache, reproduzierbare Protokoll für VS primären Zellkultur mit Komplettbearbeitung in unter 3 Stunden, mit 95% Reinheit, wie Tumorzellen durch Immunfärbung bestimmt.

Protocol

Ethikerklärung: Einsatz der menschlichen Tumorproben in diesem Protokoll wurde von der University of Iowa Institutional Review Board (IRB) genehmigt.

1. Setup-Tumor am Tag vor Ernte

1. Coat Zellkulturplatten: In einem sterilen Kulturhaube, fügen Sie genug Poly-L-Ornithin (0,01% Lösung) auf den Boden einer Polystyrol / Kunststoff-Kultur gut / Schale bedecken, ersetzen Sie den Deckel, und lassen Sie sich bei Raumtemperatur für mindestens 2 Stunden. Glasobjektträger oder Deckgläser für Polystyrol für Experimente Bildgebung erfordern ersetzt werden.
2. Nach 2 Stunden, entfernen Sie die Poly-L-Ornithin-Lösung mit Saug-und damit die Platten vollständig in einem sterilen Kulturhauben trocknen. Fügen Sie genug Laminin-Lösung (10 g / ml in Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +-freiem} HBSS [HBSS-/ -]), um die Kulturplatten vollständig zu bedecken, Deckel zu ersetzen, dann ist entweder 1) in kühlen 4 ° C Kühlschrank über Nacht oder 2) in 37 ° C-Inkubator für mindestens 2 Stunden. Wenn Plattenwird über Nacht oder länger aufbewahrt werden, wickeln die Platten in der Plastikverpackung, um Verdunstung / Austrocknung zu verhindern.

2. Setup-der Tag der Ernte Tumor

1. Bereiten Kultur, Medien: Die Medien werden frisch am Tag der Tumor Ernte und Verarbeitung gemacht, bei 4 ° C gelagert und auf 37 ° C im Brutschrank unmittelbar vor der Medien Ergänzungen / Änderungen.
2. Schwannom Kulturmedien mit hohem Glucosegehalt (4,5 mg / ml) DMEM (mit Phenolrot) mit 0,1 mg / ml Penicillin und 0,1 mg / ml Streptomycin; N2 Medien ergänzen endgültigen Verdünnung 1:100; Rinder-Insulin 5 ug / ml; Fötales Rinderserum und 10% Volumen. Filtern Sie alle Medien durch 0,22 um-Filter.
3. Bereiten Probentransport Kühler: Senden Sie eine Eis gefüllt Kühler mit 1-2 (je nach Höhe der Tumor, geerntet werden) steriles 50 ml konische Röhrchen mit 25 ml HBSS mit Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} (HBSS + / +) in den Operationssaal für die Tumorprobentransfer und Transport.
4. Bereiten indiv.idual Tumor Dissoziation Röhren - füllen sterile 2 ml Rundbodenröhrchen mit 1 ml HBSS + / + und auf Eis. (Tubes für scharfe Dissektion / Dissoziation von Tumorproben verwendet werden).
5. Für Dissoziation, bereiten etwa eine Dissoziation Rohr für jeden 0,5 cm ³ gewonnene Gewebe; zum Beispiel, wird eine Tumorprobe beträgt 1,0 x 1,0 x 1,0 cm (1 cm ³⁾ zwei HBSS + / + Dissoziation Rohre erfordern.
6. UV-Licht Sterilisation: Platz Gewebe Schere, kleine Zange, Skalpell Griff, 1x normale Petrischale, Pipette P1000 und Pipettenspitzen in einem sterilen Kultur Haube, und lassen unter UV-Licht für ~ 15 min vor Ankunft und Verarbeitung von Tumorgewebe.

3. Specimen Isolation und Verkehr

1. Isolieren Tumorproben durch chirurgische Resektion.
2. Sofort legen Tumorproben in die eiskalte HBSS + / + so schnell wie möglich nach der Entnahme aus dem Patienten. Sobald alle tissue-Proben werden gesammelt, Transport-Proben (auf Eis) von der operativen Theater an das Labor zur weiteren Verarbeitung.

4. Tissue Dissoziation und Verreiben

1. Folgende Standard sterilen Technik in einem Abzug mit laminarer Strömung, bringen konischen Rohr mit Tumorprobe in das Kulturhaube und Waschproben durch Umdrehen des Röhrchens und Tumor 50x. Lassen Fragmente auf den Boden der Röhre fallen, und entfernen Sie dann HBSS + / +. Refill mit 30 ml HBSS + / + und agitieren / invertieren 50x wieder. Wiederholen Inversion / media Entfernung für insgesamt 4x.
2. Re-suspend Tumorfragmente in 30 ml HBSS + / + zum letzten Mal, dann gießen Mischung in eine sterile100 mm Petrischale und separate Tumor in 0,5 cm ³ Gruppierungen. Wenn größere Tumorfragmente auftreten, verwenden Sie die Schere oder Skalpell Gewebe (# 11 oder # 15 Klinge) in kleinere Stücke schneiden.
3. Verwenden Sie die Zange, um die 0,5 cm ³ Gewebe Gruppen in den einzelnen HBSS + / + gefüllten, 2 ml-Rundkegelal Röhren, die alle auf dem Eis. Verwenden Sie die Schere, um Gewebe Tumorfragmente in Unter 1 mm-Fragmente der Aussetzung Hackfleisch sollte eine "Schneekugel" Aussehen (Abbildung 1) zu haben. Blatt vor den Tumor nur bis die Mehrheit der Fragmente Unter 1 mm; nicht "over-mince" die Tumorproben. Zeigen vollständig zerkleinerte Gewebe Rohr zurück auf dem Eis, und wiederholen Sie mit allen zusätzlichen Probenröhrchen.
4. Übertragen Sie alle fragmentierten Tumorproben in einem einzigen 15 ml konischen Röhrchen. Ein P1000 Pipette mit einem Schnitt / geändert sterile Spitze eignet sich gut für diesen Schritt. Sie besonders HBSS + / + zu spülen / spülen Sie die 2 ml Röhrchen Dissoziation sicherstellen, dass alle Tumorprobe wurde in 15-ml-Röhrchen gesammelt. Spin down-Gemisch in Zentrifuge bei 23 ° C, bei 73 xg für 5 min.
5. Abzusaugen HBSS + / +, so dass die Zellpellet. Re-suspend-Fragmente in 1:1-Gemisch von 0,25% Trypsin: 0,2% Kollagenase (in HBSS-/ gelöst -) - fügen gerade genug, um in Tumorfragmente halten engen suspension. Ersetzen Schraubverschluss, und in 37 ° C-Inkubator für 30 min. Man schüttelt Zellgemisch mindestens einmal während der Inkubation, um Fragmente in Suspension zu halten. Legen Sie das Schwannom Kulturmedien in den Brutschrank, um es in dieser Zeit zu wärmen auch.
6. Nach der Inkubation werden 100 ul FBS zu jedem Röhrchen, um das Trypsin zu inaktivieren, und dann Zentrifuge Probe bei 23 ° C, 73 × g für 5 min. Mit einer Pipette vorsichtig abzusaugen, so viel wie möglich, ohne überstehende Zellpellet zu stören. Hinzufügen des erwärmten Kulturmedien (N2/insulin/5% FBS) zu den Tumorfragmente zu einem endgültigen Verhältnis von 1:2 Tumorfragmente: Kulturmedien (z. B. wenn es 1 ml Tumorfragmente, fügen in 2 ml warmem Medien).
7. Bereiten Sie für die Tumor Verreiben durch Schneiden der Spitze weg von einer P1000 Pipettenspitze zu einem Durchmesser von etwa 1-2 mm. Langsam verreiben die Zellsuspension mit immer kleiner und kleiner Durchmesser Pipettenspitzen, bis Sie einfach pipettieren der Lösung durch eine unaltEred P1000 Pipettenspitze. Unmittelbar auf eine kleinere Spitze zu bewegen, sobald man leicht pipettieren den Tumor-Lösung durch die Spitze - nicht über die Probe verreiben. Wenn ein einzelnes größeres Stück Gewebeblöcke Aspiration während Verreiben, Antippen der Pipettenspitze an der Unterseite des konischen Rohrs ermöglicht oft fort Verreiben.

5. Zellüberzug

1. Ein 0,5 mm ^3-Fragment von Gewebe ist genug, um 1 x 100 mm-Schale, oder 4 x Dias 8-well/4-well Saatgut. Kurz vor der Zugabe der Medien / Zellgemisch, entfernen Sie das Laminin-Lösung von den Kulturplatten, aber nicht die Platten trocknen lassen.
2. Für jede 100-mm-Schale, die Auflösung der Tumor-Fragment in 10 ml Kulturmedium erwärmt.
3. Für jede Vertiefung einer 4-gut rutschen, 750 ul erwärmt Kulturmedien (3 ml für die ganze Folie).
4. Für jede Vertiefung eines 8-Well-rutschen, 400 ul erwärmt Kulturmedien (3,2 ml für die ganze Folie).
5. Die Kulturen in 37 & inkubieren# 160; ° C, 100% Luftfeuchtigkeit, 6% CO _2. Lassen Sie die Kulturen allein für mindestens 36 Stunden, und ändern Sie dann die Medien, wenn die Lösung vergilbt (sauer). Die Medien bei 72 h Ansonsten ändern, dann alle 2-3 Tage oder wenn die Medien zu sauer. Wenn das Medium sauer wird täglich für mehrere Tage in einer Reihe, das ist in der Regel ein Hinweis auf einen möglichen Bakterien-oder Hefe-Verunreinigung.

Representative Results

Korrekte Tumor Fragmentierung ist für die optimale Aussaat und Vermehrung in Gewebekulturschalen (Abbildung 1). Identifizierung von Schwannom Zellen während der ersten Tage nach der Plattierung ist oft schwierig, aufgrund verdeckt Mengen von Zelltrümmern und roten Blutkörperchen. Durch die ^4. oder ^5. Tag, wird in der Nähe von adhärenten Zellforttumorfragmente erkennbar erstellen "Schnürung" Muster unter den Trümmern. Nachträgliche Änderungen in der Regel entfernen Medien die Mehrheit der nicht-adhärenten Zellen in der zweiten Woche. Unter Verwendung dieses Verfahrens können 90% Konfluenz zwischen 7-14 Tagen erwartet werden, abhängig von der anfänglichen Vitalität der Tumorfragment vor Zerkleinern und Plattieren Dichte (Abbildung 2). Wie vorstehend beschrieben, erscheinen Schwannom Kulturen von kleinen Fragmenten von adhärenten Tumorfragmente ^9,10 nach außen wachsen. Wie Auswuchs wird durch das Ende der ersten Woche nachweisbar. 2 zeigt bright Bildgebung von Zell-Schwannom Auswuchs von einer einzigen Tumorfragment, in Rot in der unteren rechten Ecke dargestellt. Abbildung 3 veranschaulicht die "Brücken" Auswuchs, zwischen zwei verschiedenen Tumorfragmente auf, in der Kultur Brunnen immun mit polyklonalen Kaninchen-Anti-S100-Antikörper. Wir Kulturen mit Anti-S100 oder Anti-p75 ^NTR Antikörpern routineImmunFärbung, um die Reinheit der Kulturen zu überprüfen und positiv zu identifizieren Schwannom Zellen für die Analyse (Abbildung 4). Mit diesen Methoden über> 95% der Zellen in diesen Kulturen repräsentieren Schwannom Zellen. Schwannom Zellen mit sauren Gliafaserproteins (GFAP) und ErbB2, unter anderen Markern beschriften ¹¹ auch.

1. Vergleich der gleichen Tumorprobe sowohl vor (A) und hinterener (B) Wolf. Probe in 1,5 ml HBSS + / + mit Phenol Red in 2,0 ml-Rund konischen Rohr hergestellt.

Abbildung 2. Typisches Erscheinungsbild der Kulturen auf Hellfeldmikroskopie. Spin Schwannom Zellauswuchs strahlt von Tumorfragment, Bild genommen auf 10 Tage Kultur. Maßstabsbalken = 100 um.

Abbildung 3. Immunfärbung von primären Vestibularisschwannom Kulturen mit Anti-S100-Antikörper zeigen typische Kultur-und Zellmorphologie. A) Geringer Strom Ansicht, Auswuchs aus beschichtetem Tumorfragmente, Kultur Tag 14. Skala bar = 200 um. B) Höhere power Blick auf Schwannom Zellen mit Einspindeldrehmaschinen Morphologie, Kultur Tag 14. Skala bar = 100 um.

Abbildung 4. Immunfärbung von primären Vestibularisschwannom Kulturen Reinheit der Kultur-und Zell Identität zu bestätigen. A) Kulturen immunhistochemisch mit anti-S100-Antikörper. Die Zellkerne sind mit DAPI markiert. Maßstabsbalken = 100 um. B) Kulturen mit Anti-p75 ^NTR Antikörper immun. Die Zellkerne sind mit DAPI markiert. Maßstabsbalken = 100 um.

Discussion

Geschichte der In-vitro-Kulturen Schwannom

Die Bemühungen um die In-vitro-Kulturen zu etablieren begann Schwannom weniger Jahrzehnte nach der ersten Akustikusneurinom offenen chirurgischen Resektion erfolgte im Jahre 1894 ^12. Die erste aufgezeichnete Kulturen waren von Kredel in den 1920er Jahren, der erfolglos versuchte, Hackfleisch Tumor durch "hanging drop-Methode" ¹² wachsen . Später Drs. Murray und Stout veröffentlichten ihre in-vitro-Kultur Erfahrung mit neurilemomas auf geronnenes menschliches Plasma gewachsen. Interessanterweise zeigte diese Technik, dass Antoni A und Antoni B-spezifische Fragmente wuchsen anders, mit einzigartigen Zellmorphologie und Differenzraten von Agar Verflüssigung ^13. Cravioto Lockwood und veröffentlicht weitere Beobachtungen von Akustikusneurinom Kulturen in Vogel Blutgerinnsel auf Deckglas rutscht und Rollenrohre. Sie waren auch die ersten, Rose Kammern für Zeitraffer-Bildgebung des Tumorwachstums zu verwenden 10. Baur kombiniert die "en bloc" und Monolayer-Ansätze in ihrer Publikation, die auch zeigten die mitogene Wirkung von Laminin-beschichteten Kulturplatten ^9. Meisten späteren veröffentlichten Protokollen, wie eigene, verwenden ein ähnliches Protokoll der Aussaat Hackfleisch Tumorfragmente auf einer Kulturfläche mit einer geladenen Aminosäure (Poly-L-Ornithin, Poly-L-Lysin) und Laminin Herstellung ⁸ behandelt. Wir haben diese gleiche Methode, um Kultur Schwannomen aus der Gesichts-, Trigeminus, Vagus und Spinalnerven mit ähnlichen Ergebnissen verwendet.

Vorteile von Vestibularisschwannom Primärkulturen

Studium der Human Schwannom Tumorentstehung oft homogene immortalisierten Zelllinien und transgenen Mausmodellen. Solche Tools sind von Vorteil, aber do nicht genau die Genotypen, Phänotypen und Komplexität der menschlichen Krankheit. Dagegen Primärkulturen wahrscheinlich eine realistischere Modell. Sie treuer rekapitulieren die Heterogenität der genomischen und molekularen Status mit menschlichen Tumoren ¹⁵ zugeordnet.

Die Reinheit der Kulturen Schwannom

Eine Herausforderung, der primären Zellkultur ist die Aufrechterhaltung Zielzelle Reinheit. Schwannome überwiegend von neoplastischen Schwann-Zellen ⁶ bestehen jedoch Kulturen sind nicht immun gegen Kontamination Fibroblasten. Historisch Methoden zur Optimierung Schwannom Zelle Reinheit lassen sich in drei Kategorien: 1) Auswahl von chemisch definierten Medium und spezifischen Wachstumsfaktoren; 2) Immun (beispielsweise mit magnetischen Kügelchen Zellsortierung ^7), 3) eine Kombination der beiden vorhergehenden Verfahren. Nach unserer Erfahrung Fibroblasten oder anderen nicht-Schwannom Zellen umfassen im allgemeinen weniger als 5% der Zellen in der kulwieder, unabhängig von Patientencharakteristika (Alter, Geschlecht), sporadisch oder NF2-assoziierten Tumoren, primäre oder sekundäre Tumorentfernung, oder zystische vs solide Tumorarten. Wenn Fibroblasten scheinen über die Kultur nehmen werden, die Entfernung des Serums für 1-2 Medienwechsel deutlich diese Bevölkerung ohne Schwannom das Überleben der Zelle zu beeinträchtigen reduzieren. Pre-Behandlung von Zellkulturoberflächen mit Laminin erleichtert auch Schwannom Zellwachstum ^9. Minimale Passagieren der Kulturen hilft auch, um unerwünschte Zellkontamination zu verringern - Kryospeicherung ist am besten in den ersten zwei Kulturpassagen abgeschlossen und Kulturexperimente nicht über Passage 4-5 empfohlen. Wir finden optimale Ergebnisse, wenn Kultur Experimentieren wird durch Durchgang 1-2 mit nicht-cryostored Zellen abgeschlossen.

Wir verwenden sowohl Immunfärbung (anti-S100, DAPI) und mikroskopische Aussehen der Zell-und Kernmorphologie als Maßnahmen zur Qualitätskontrolle in unserem Schwannom Kulturen. Gelegentlich ist esist hilfreich, um eine Teilmenge der Kulturen für Monozyten (CD68) oder Fibroblasten-spezifischen Marker Immunfärbung, um die Reinheit der Kultur ⁹ weiter zu verifizieren. Während experimentelle Untersuchungen des Zellverhaltens (z. B. Proliferation oder Zelltod), die wir immer mit anti-S100 oder ^{anti-p75-NTR-Antikörper} Immunfärbung, um zu überprüfen, dass die Ergebnisse Schwannom Zelle spezifisch.

Kultur Morphologie und Wachstumsmuster

Schwannom Tumor Kulturen zeigen typischerweise einzigartige Wachstumsmuster erinnert an Antoni A (hohe Zelldichte, straff organisiert, Hinweise auf Verocay Körperformationen) und nur selten von Antoni B (vergleichsweise spärlich Kerne, reichlich zelluläre Prozesse, weniger Organisation) Muster in der Histopathologie des resezierten Schwannom gesehen ¹⁶ Tumoren. Fast alle Schwannom Zellen zeigen das klassische lange, Einspindeldrehmaschinen, bipolare Zellform sowohl mit Schwann-Zellen und Schwannom ^6,17 jedoch andere Zell morpho verbundenlogien, wie Cravioto (Amoeboid Mikroglia-ähnlichen Zellen, Spindelzellen, Schläger-Shaped Cells, und Kite-förmige Zellen) beschrieben manchmal auftreten ^14. Insgesamt Zellwachstum und Proliferation sind sehr langsam in unser Basismedium (DMEM/10% FBS/Insulin/N2 Aufpreis). Die Zugabe von bekannten mitogenen Faktoren wie Forskolin und β1-Neuregulin deutlich erhöht Zellproliferation ^18.

Kritische Protocol Steps

Unsere Schwannom Gewebekultur-Protokoll ist einfach und ziemlich nachsichtig; jedoch gibt es mehrere wichtige Schritte, die Erfolg sicherzustellen. Erstens ist die richtige Handhabung Tumor kritisch. Erwarten Sie die besten Ergebnisse, wenn Tumor direkt in eiskaltem HBSS + / + so schnell wie möglich wieder aus dem Patienten entfernt platziert. Dies steht im Gegensatz zu der üblichen Praxis der chirurgischen Sammel resezierten Tumor in steriler Kochsalzlösung, dann sendet das Aggregat Gewebe für die Verarbeitung in der Pathologie am Ende des Gehäuses. Zweitens halten Gewebe samples so kühl wie möglich während der Verarbeitung. Es ist wichtig, dass der Tumor reseziert Eis kalt gehalten, und nach der Entfernung, dass die Verarbeitung tritt als zweckmäßig wie möglich. Tun Sie, wie viel von der Gewebeverarbeitung wie möglich auf Eis als auch. Drittens, aggressiv waschen die Tumorproben. Dies hilft, das Risiko einer bakteriellen oder Pilzkontamination. Viertens, nicht über-Hackfleisch Tumorproben. Tumor Verreiben hängt von einer halb subjektive Beurteilung, wann weiter mit einem kleineren Durchmesser P1000 Pipettenspitze.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution	Sigma	P4957	Cell Culture Surface Treatment
Laminin mouse protein	Gibco	23017-015 / L2020	Cell Culture Surface Treatment
0.2% Collagenase (dissolved in HBSS-/-)	Sigma	C2674	Dissociation Reagent
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Dissociation Reagent
TPS 100 mm round culture dish	Midwest Scientific	TP93100
Permanox 4-well slide	Fisher Scientific	1256521
Permanox 8-well slide	Fisher Scientific	1256522
Suction filter flask	Midwest Scientific	TP99500
15 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91015
50 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91050
2 ml Round bottom tube	USA Scientific	1620-2700
Small scissors	FST	14058-11
Small forceps	FST	11251-20
Scalpel handle	FST	10004-13
#11 Scalpel blade	Roboz	RS-9801-11
Non-tissue culture 100 mm round Petri dish	Fisher Scientific	50-820-904
P1000 Pipetteman	Bioexpress	P3963-1000
Serological pipetteman	Bioexpress	R3073-2P
Sterile, non-filtered P1000 pipette tips	Midwest Scientific	TD1250R
Insulated ice cooler
Culture hood	Baker
Centrifuge	Eppendorf -5810R
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)+/+ (w/ Ca2+, Mg2+)	Gibco	24020-117	Schwannoma Culture and Media Components
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)-/- (w/o Ca2+, Mg2+)	Gibco	14170-112	Schwannoma Culture and Media Components
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red	Gibco	11965-092	Schwannoma Culture and Media Components
N2 supplement	Gibco	17502-048	Schwannoma Culture and Media Components
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	Schwannoma Culture and Media Components
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-163	Schwannoma Culture and Media Components
Bovine insulin (1 mg/ml 200x)	Sigma	I6634	Schwannoma Culture and Media Components