Summary
Il processo di guarigione cellule feriti comporta tratta di specifiche proteine e dei compartimenti subcellulari al sito della lesione membrana cellulare. Questo protocollo descrive saggi per monitorare questi processi.
Abstract
La capacità delle cellule danneggiate per guarire è un processo cellulare fondamentale, ma i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella guarigione delle cellule feriti sono poco conosciute. Qui saggi sono descritti per monitorare la capacità e la cinetica di guarigione delle cellule in coltura dopo la lesione localizzata. Il primo protocollo descrive un approccio basato punto di fine di valutare simultaneamente cellule riparazione della membrana capacità di centinaia di cellule. Il secondo protocollo descrive un metodo di immagini in tempo reale per monitorare la cinetica di riparazione membrana cellulare in cellule singole seguenti lesioni localizzate con un laser pulsato. Come cellule di guarigione feriti comporta tratta di specifiche proteine e dei compartimenti subcellulari al sito della lesione, il terzo protocollo descrive l'uso di approccio basato punto finale di cui sopra per valutare uno di questi eventi traffico (esocitosi lisosomiale) in centinaia di cellule danneggiate simultaneamente e l'ultimo protocollo descrive l'uso di lesioni laser pulsato con micros TIRFcopia di monitorare le dinamiche dei singoli compartimenti subcellulari in cellule danneggiate ad alta risoluzione spaziale e temporale. Mentre i protocolli che seguono descrivono l'uso di questi approcci per studiare il legame tra riparazione membrana cellulare e lisosomiale esocitosi in cellule muscolari coltivate, possono essere applicate come tali per qualsiasi altra cellula in coltura aderente e compartimento subcellulare di scelta.
Introduction
Membrana cellulare mantiene l'integrità delle cellule, fornendo una barriera tra la cella e l'ambiente extracellulare. Uno stimolo chimico, elettrico o meccanico che supera la normale soglia fisiologica così come la presenza di agenti patogeni invasori può ogni risultato lesioni alla membrana cellulare e innescare una risposta cellulare successiva per riparare questa lesione. Per sopravvivere queste lesioni alla membrana cellulare, cellule possiedono un meccanismo efficiente per la riparazione. Questo meccanismo è dipendente dal calcio e coinvolge traffico intracellulare di proteine come MG53 annexins e tra gli altri, nonché compartimenti subcellulari come endosomi, lisosomi, Golgi vescicole derivate e mitocondri alla membrana cellulare feriti 1-7. Tuttavia, i dettagli della sequenza di eventi molecolari e subcellulari coinvolti nella riparazione membrana cellula danneggiata rimane poco compresa.
Risposta di riparazione del cellulare può essere segregato in un orecchioly e risposte tardive. Le prime risposte, che si verificano in pochi secondi in scala minuti di tempo, sono estremamente importante nel determinare la natura delle risposte tardive che portano alla riparazione delle cellule successo o la morte delle cellule. Analisi del punto di arrivo sulla base di analisi biochimiche e cellulari di massa hanno contribuito a stabilire il coinvolgimento di processi molecolari e cellulari di riparazione. Ma, a causa della eterogeneità e rapidità di risposta di riparazione cellulare, saggi punto finale non riescono a fornire i dati cinetici e spaziali della sequenza di eventi che portano alla riparazione. Approcci che consentono pregiudizio controllata di membrana cellulare e permettono di monitorare la riparazione della membrana cellulare e subcellulare risposte associate ad alta risoluzione spaziale e temporale sono ideali per tali studi. Qui, tali approcci sono stati presentati. Due dei protocolli descrivono approcci per monitorare le reali cinetica momento della riparazione membrana cellulare e le risposte subcellulari associati al processo di riparazione in cellule vive seguenti inj laserury. Come complemento a queste analisi basate imaging cellulare dal vivo, saggi punto finale sono anche stati descritti che forniscono una misura basata sulla popolazione per il monitoraggio riparazione delle singole cellule e le risposte subcellulari associati. Per dimostrare la loro utilità questi approcci sono stati utilizzati per monitorare il traffico e l'esocitosi dei lisosomi in risposta al danno membrana cellulare.
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Protocol
1. Imaging Membrana cellulare Repair Uso Bulk (perle di vetro) Ferimento
Questo protocollo permette separatamente segnando le cellule danneggiate e quelli che non riescono a guarire. Quantificare queste popolazioni di cellule richiede l'utilizzo di tre condizioni: 1. Test (C1) - Le cellule possono riparare in presenza di Ca 2 +, 2. Controllo 1 (senza pregiudizio C2) - Le cellule vengono incubate in presenza di Ca 2 +, ma non feriti, e 3. Control 2 (senza C3 riparazione) - le cellule sono autorizzati a riparare in assenza di Ca 2 +.
- Crescere le cellule a> 50% di confluenza in tre coprioggetto sterili e lavare C1 e C2 due volte con CIM a 37 ° C e C3 con PBS a 37 ° C e di trasferimento coprioggetto su O-ring in silicone.
- Aggiungere 100 ml di soluzione di destrano FITC preriscaldata in CIM su C1 e C2 o C3 in PBS su.
- Ferire membrana plasmatica in C1 e C3 da dolci 40 perle mg di vetro sopra il vetrino a temperatura ambiente mediante lamelle inclinabili manualmente indietro evia 6-8 volte con un angolo di 30 °.
Nota: per lesioni lievi, assicurano le perle di vetro sono distribuite in modo uniforme, riducendo così al minimo le lesioni ripetute. Per migliorare la riproducibilità del pregiudizio tra i campioni, contemporaneamente effettuare la lesione branello di vetro dei diversi campioni da confrontare. - Evitare inoltre di rotolamento di perline, trasferire tutti i vetrini di un incubatore 37 ° C a CO 2 ambiente e consentire la riparazione di procedere per 5 min.
- Senza lasciare le perle rotolano, rimuovere le perline di vetro e FITC destrano mediante lavaggio con CIM (C1 e C2) o PBS (C3) a 37 ° C.
- Luogo coprioggetto torna sul ring e aggiungere 100 ml di soluzione di lisina TRITC destrano risolvibile preriscaldata in CIM su C1 e C2 o in PBS su C3.
- Incubare a 37 ° C per 5 min a CO 2 ambiente.
- Lavare coprioggetti due volte con preriscaldata CIM e fissare con PFA 4% per 10 min a RT.
- Lavare due volte con PBS e incubare per 2 min a RT in Hoechst colorante.
- Wash samples due volte con PBS, montare su un vetrino utilizzando supporti di montaggio e celle di immagine utilizzando un microscopio a epifluorescenza.
- Utilizzare cellule da C2 per determinare il fondo rosso e verde intensità di colorazione e utilizzare questo valore di soglia per i canali rosso e verde per tutti i campioni (C1-C3).
- Punteggio numero totale di cellule che sono a) verde (infortunato e riparato) e b), rosso o entrambi rosso e verde (infortunato, ma non è riuscito a riparare) in campioni C1 e C3.
- Conte> 100 cellule verdi per ogni condizione ed esprimere la frazione di cellule che non sono riusciti a riparare come percentuale di tutte le cellule danneggiate (verde e rosso).
2. Immagini dal vivo della cinetica di membrana cellulare di riparazione Following Laser Injury
- Lavare le cellule con preriscaldata CIM e poi mettere il vetrino in CIM con la tintura FM.
- Posizionare il coprioggetto in un supporto in incubatrice all'inizio stadio mantenuto a 37 ° C.
- Selezionare una regione della membrana cellulare 1-2 mm 2, e per irradiare <; 10 msec con il laser pulsato. Attenuare la potenza laser attraverso il software al 40-50% della potenza di picco. Potenza ottimale consente pregiudizio consistente, ma non letale e questo deve essere determinato per tentativi per ogni singolo strumento e linea cellulare utilizzato.
- Per monitorare la riparazione, un'immagine ogni 10 secondi in epifluorescenza e chiaro, iniziando prima di pregiudizio e proseguire per 3-5 minuti dopo la lesione.
Nota: Per nessun controllo la riparazione, ripetere i passaggi 2,1-2,4 con le cellule feriti in PBS contenente colorante FM. - Per quantificare la cinetica di riparazione, misurare FM cellulare colorante fluorescente e tracciare la variazione di intensità (ΔF/F0) nel corso di imaging. Questi dati devono essere in media per oltre 10 celle in ogni stato e tracciata come media o il valore della singola cella, se necessario.
3. Imaging Bulk (perle di vetro) Infortunio Induced lisosomiale Esocitosi
Gli esempi includono seguenti cellule cresciute a> 50%confluenza: 1. Test (C1) - Cellule permesso di riparare in presenza di Ca 2 +, 2. Controllo 1 (C2; Nessun danno) - Cellule né feriti né incubate con l'anticorpo primario, e 3. Control 2 (C3, n riparazione) - Cellule autorizzati a riparare in assenza di Ca 2 +.
- Lavare coprioggetto C1 e C2 due volte con CIM a 37 ° C e C3 con PBS a 37 ° C e trasferirli su O-ring in silicone.
- Aggiungere 100 pl di preriscaldata lisina fissabile destrano TRITC in CIM su C1 e C2 e C3 in PBS su.
- Ferire membrana plasmatica su C1 e C3 come al punto 1.3.
- Evitare inoltre di rotolamento di perline, trasferire tutti i vetrini di un incubatore 37 ° C a CO 2 ambiente e consentire la riparazione di procedere per 5 min.
- Rimuovere le perline di vetro e TRITC destrano lavando i coprioggetti in terreno di crescita freddo, assicurando ancora nessun rotolamento delle sfere di vetro sulle cellule.
- Lavare i coprioggetti due volte con mezzo di crescita freddo e trasferire gli O-ring.
- Per C1 e C3, Aggiungere 100 ml di ratto anticorpo anti LAMP1 topo in mezzi di crescita complete freddo e aggiungere il freddo, terreno di coltura completo C2.
- Per consentire legame dell'anticorpo lamelle incubare per 30 min a 4 ° C.
- Lavare i coprioggetti tre volte con CIM freddo e fissare tutti i vetrini con il 4% PFA per 10 min a RT e poi risciacquare 3x con CIM.
- Incubare tutte coprioggetto in 100 ml di soluzione di blocco per 15 minuti a RT
- Incubare tutte coprioggetto in 100 microlitri Alexa Fluor 488 anticorpo anti ratto per 15 min a 4 ° C.
- Lavare due volte con PBS e incubare per 2 minuti a temperatura ambiente in Hoechst.
- Lavare le cellule due volte con PBS, montare su un vetrino utilizzando supporti di montaggio e immagine utilizzando un microscopio a epifluorescenza.
- Utilizzo di immagini di cellule C2, determinare la colorazione di fondo aspecifica in rosso (TRITC destrano) e verde (Alexa Fluor 488 anticorpi) canali e usare questi valori colorazione di fondo di soglia i canali rosso e verde per tutti i campioni (C1-C3). </ Li>
- Utilizzare i rossi etichettati> 100 cellule da C1 e C3 per misurare l'intensità della colorazione LAMP1 (verde) in cellule danneggiate. Per un esperimento riuscito colorazione LAMP1 in celle da C3 sarà notevolmente inferiore rispetto alle cellule di C1.
4. Immagini dal vivo di Cell Membrane Injury Attivato Traffico subcellulare
- Fluorescently etichettare il vano di interesse trasfettando opportuno giornalista (es. CD63-GFP per lisosomi 8) oppure utilizzando coloranti fluorescenti 9.
- Per i lisosomi etichettatura con colorante fluorescente, incubare cellule cresciute al 50% di confluenza in terreni di coltura contenente FITC-destrano
- Lasciare destrano da endocitato per 2 ore (o più, se necessario per l'etichettatura sufficiente endosomal con destrano dalla linea cellulare di interesse) in CO 2 incubatore.
- Lavare le cellule con i media di crescita preriscaldate e incubare per 2 ore in un incubatore CO 2 per consentire a tuttiendocitosi destrano ad accumularsi nel lisosoma.
- Prima di imaging, sciacquare il vetrino in preriscaldata CIM e montare in un supporto vetrino sul incubatore cima fase a 37 ° C.
- Eseguire widefield (per il movimento in tutta la cellula) o TIRF (movimento alla superficie cellulare e esocitosi) immagini - le cellule che non hanno affollato FITC destrano lisosomi etichettati sono l'ideale per l'imaging dei movimenti e esocitosi dei singoli lisosomi.
- Allineamento laser TIRF per microscopio di imaging: Usa 60X o 100X con obiettivo> 1,45 NA. Impostare l'angolo per incidente TIRF fascio laser usando l'approccio del produttore.
- Danneggiare la membrana cellulare irradiando una regione piccola (1-2 mm 2) per <100 msec, con il laser pulsato a 40-50% attenuazione.
- Per monitorare la risposta dei lisosomi alla cella di pregiudizio, celle di immagine a 4-6 fotogrammi / sec per almeno 2 minuti o più, a seconda delle dinamiche di esocitosi nelle cellule di interesse.
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Representative Results
Protocolli descritti qui per l'imaging singola cellula sono di monitorare la capacità e la cinetica di riparazione della membrana cellulare (protocolli 1 e 2) e il traffico subcellulare e la fusione dei lisosomi durante la riparazione (protocolli 3 e 4).
Protocollo 1 mostra un saggio di massa che permette la marcatura tutte le cellule danneggiate e individuare le cellule danneggiate che non sono riusciti a riparare. I risultati in figura 1 mostrano che mentre le cellule illesi (Figura 1A) rimangono senza etichetta, cellule danneggiate da perle di vetro in presenza di destrano FITC sono etichettati verde (Figure 1B e 1C). Quando le cellule sono autorizzati a riparare in presenza di Ca 2 + la maggior parte dei (verdi) cellule danneggiate riescono a riparare e non sono segnati (rosso) da TRITC destrano (Figura 1B). Quando le cellule sono autorizzati a riparare in assenza di Ca 2 +, la maggior parte delle cellule danneggiate sono anche riportate rosso dal destrano TRITC (Figura 1C). Le cellule che non sono mai stati feriti non mostrano alcuna etichettatura con il destrano TRITC. Così, in un dato campione quantificare il numero di cellule solo verde etichettato fornisce una misura delle celle che sono stati feriti da perle di vetro e riparati, mentre quantificare il numero di doppi cellule marcate (rosso e verde) fornisce una misura delle cellule che non hanno a riparare da un infortunio.
Protocollo 2 descrive valutare la cinetica di riparazione membrana cellulare monitorando l'ingresso di colorante FM nella cella. Se incubati colorante FM, cellule intatte mostrano la colorazione membrana cellulare (Figura 2A prima lesione pannello WF). Dopo la lesione laser localizzata di membrana cellulare colorante FM inizia entrare nella cellula e endomembrane, che provoca un aumento improvviso FM colorante fluorescente (Figura 2B) vincolante. Poiché la capacità di membrana cellulare per riparare seguente lesione laser dipende Ca 2 +, una cella ferito in presenza di Ca 2 + è abLe riparare, che causa la voce colorante FM (e quindi aumentare in cellulare FM colorante fluorescente) per cessazione entro un minuto dopo la lesione (Figura 2A, pannello superiore, Figura 2B, linea blu, e animato Video 1 e Figura 2). Al contrario, una cellula autorizzato a riparare in assenza di Ca 2 +, non riesce a riparare, che si traduce in entrata tintura in continuo e quindi continuo aumento FM colorante fluorescente anche 4 min dopo la lesione (Figura 2A, pannello inferiore, Figura 2B, linea rossa e animata Video 2 e Figura 2). Così, riparazione membrana cellulare porta ad un plateauing del colorante colorazione FM, mentre la mancanza di riparazione della membrana cellulare provoca iscrizione colorante continuo che non riesce a plateau.
Protocollo 3 descrive l'uso di bulk (perle di vetro) avvicinamento pregiudizio per monitorare superficie cellulare traslocazione delle vescicole e proteine in risposta al danno. Qui thcellule e sono feriti in presenza di TRITC destrano così, mentre le cellule lesionate non sono etichettati rosso (Figura 3A), ma tutte le cellule danneggiate sono etichettati rosso (Figure 3B e 3C). Le cellule illese che non sono trattati con etichettatura livello di spettacolo anticorpo primario sfondo per LAMP1 superficie cellulare (pannello LAMP1 figura 3A). Tuttavia, quando le cellule sono feriti e lasciati guarire in presenza di calcio, lisosomi subiscono esocitosi e quindi vi è una maggiore livello di LAMP1 colorazione sulla superficie delle ferite (rosso etichettato) cellule (Figura 3B). Questo aumento di etichettatura LAMP1 superficie cellulare è molto più bassa nelle cellule che sono autorizzati a guarire in assenza di calcio (Figura 3C). Questo dimostra la natura di calcio regolate lisosomiale esocitosi e quindi aspetto superficiale di LAMP1. Così sia, quantificare il numero di cellule con alta superficie cellulare LAMP1 colorazione e misurare il livellodi superficie cellulare LAMP1 colorazione sulle cellule danneggiate singole, prevedere misure per la capacità delle cellule di sottoporsi a lesioni attivato lisosomiale esocitosi.
Protocollo 4 può essere utilizzato per il monitoraggio diretto della cinetica, la natura e la posizione dei singoli fusione lisosoma in risposta al danno membrana cellulare. Le cellule sono feriti dal laser pulsato e superficie cellulare lisosomi sono ripreso da TIRF immagini, che permette di lesioni monitoraggio attivato esocitosi dei lisosomi nelle singole cellule (Figura 4A e animato Video 3). Figura 4A mostra una cella (indicato in verde) visualizzata da l'imaging a contrasto di fase (pannello di sinistra) e mediante microscopia TIRF (pannello centrale), prima della lesione. Pannello di destra mostra TIRF immagine della stessa cella 105 secondi dopo l'infortunio. Lesioni Vari innescato risposte dei lisosomi sono descritte nelle figure 4B-E. Figura 4B mostra lesioni innescato assunzione di un lisosoma (contrassegnatodal cerchio grigio) alla membrana cellulare seguito da esocitosi (animato Video 4 e Figura 4). Questo lisosoma non è visibile immagine TIRF in prima lesione (Figura 4B: -2.5 pannello s), ma dopo un trauma lisosoma arriva alla membrana cellulare e diventa rilevabile (Figura 4B: pannello 102.5 s), come la vescicola si avvicina al membrana cellulare è meglio eccitato dalla illuminazione TIRF e lisosomiale destrano FITC fluorescenza raggiunge il valore massimo quando il poro di fusione apre provocando neutralizzazione del pH lisosomiale e dequenching della fluorescenza destrano FITC (Figura 4B: pannello 104.8 s) così. Successivamente il destrano è scaricato dalla vescicola all'esterno della cellula causando FITC fluorescenza a diffondersi lateralmente e la fluorescenza vescicola a diminuire gradualmente (Figura 4B: pannello 107.1 s). Nella seconda categoria, i lisosomi (contrassegnato da cerchio arancione, animato Video 5 Figura 4) è presente prima lesione (Figura 4C: pannello -2.5 s), vi rimane a livello della membrana (Figura 4C: pannello 91 s) fino alle exocytoses vescicole. Qui il lisosoma exocytosed parzialmente (Figura 4C: pannello 93 s), lasciando dietro di sé un po 'di destrano FITC nella vescicola in seguito alla fusione (Figura 4C: 94.5 s). Il terzo e quarto categorie di vescicole non si fondono alla membrana. Il lisosoma mostrato in Figura 4D (contrassegnato da blu cerchio) si sposta assialmente e lontano dalla membrana cellulare (animata video 6 e Figura 4). Questo lisosomi non è visibile a livello della membrana cellulare prima di lesioni (Figura 4D: -2.5 pannello s), ma quando ci si avvicina membrana cellulare dopo la lesione diventa visibile al microscopio TIRF (Figura 4D: pannello 59,3 s). Ha raggiunto più vicino alla membrana cellulare (Figura 4D: pannello 59,6 s) e poi si allontana senza fondersi (Figura 4D: panel 63.7 s). Il lisosoma nella quarta categoria arriva vicino alla membrana e si muove orizzontalmente lungo la membrana cellulare (area segnata dalla scatola viola in Figura 4A, animata video 7 e Figura 4). Figura 4E (pannello 8.7 s) mostra l'arrivo del lisosoma , che poi si sposta lungo la membrana e può essere visto nella sequenza di immagini successive lesioni (Figura 4E: pannelli 10.7, 11.9, 12.8, 18.8 s). Sulla base della descrizione di cui sopra quantificare il destrano FITC intensità di fluorescenza di ogni lisosomi - fusione (Figure 4B e 4C), spostando assialmente (Figura 4D) o lo spostamento orizzontale (Figura 4E) permette di determinare la risposta di lisosomi al danno.
Figura 1. . Cella Bulk lesioni membrana perle di vetro Images mostrano colorazione nucleare (Hoechst, pannello di sinistra), lesioni (colorazione verde - FITC Dextran), le cellule non riparati (colorazione rosso - TRITC Dextran), e le immagini fuse (Merge). (A) le cellule illeso in presenza di calcio, (B) cellule danneggiate in presenza di calcio, e (C) Infortunati cellule in assenza di calcio. Scale bar 10 micron. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 2. . In tempo reale immagini di riparazione della membrana delle cellule in risposta al danno laser (A) Immagine di cellule (descritto in arancione) prima di pregiudizio [pannello di sinistra - campo chiaro (BF) eepifluorescenza (epi)], 5 sec, 1 min, e 4 minuti dopo l'infortunio. Il sito di lesione è indicata da una freccia bianca. Pannello superiore mostra una cella feriti in presenza di calcio e pannello inferiore mostra una cella feriti in assenza di calcio. (B) Il grafico mostra la variazione FM colorante colorazione (ΔF/F0) delle celle a pannello A feriti in presenza di calcio (blu) o in assenza di calcio (rosso). La regione in cui entra colorante FM e quindi etichettatura fluorescenza aumentata è stata utilizzata per la quantificazione dell'intensità di fluorescenza. Scale bar = 10 micron). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 3. Imaging lisosomiale esocitosi in risposta al danno di massa. Le immagini mostrano colorazione nucleare Hoechst (blu), superficie cellulare LAMP1 colorazione (verde), TRITC destrano (rosso) e Merge di tutti i canali (overlay) di (A), le cellule infortunati non marcate con anticorpo primario, (B) cellule danneggiate consentito di riparazione in presenza di calcio, e (C) cellule danneggiate permesso di riparare in assenza di calcio. Scale bar 10 micron. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 4. Reale tempo di imaging di lisosomiale esocitosi in risposta al danno laser. Celle con FITC destrano lisosomi etichettati sono stati feriti da un laser pulsato in presenza di calcio. (A) Il confine della cella cheè stato ferito si delinea (in verde): pannello di sinistra - campo chiaro prima di infortunio, pannello centrale - TIRF prima di lesioni e pannello di destra - TIRF 105 s dopo l'infortunio. Il sito di lesione è segnato dalla casella ciano e l'area rappresentante indicato dal bianco / scatole viola e cerchi colorati all'interno ingrandito in pannelli BE. Il colore della vescicola l'immagine intera cella (grigio, arancione e blu) corrisponde al colore nel ingrandita immagini dei singoli lisosomi. Pannello (B) a sinistra mostra un grafico per il valore ΔF/F0 per la fluorescenza FITC di una vescicola assunto dopo l'infortunio. Pannello di destra mostra le istantanee della vescicola prima di pregiudizio (-2,5 s), prefusione (102.5 s), la fusione (104,8 s) e postfusion (107.1 s). Pannello (C) a sinistra mostra un grafico per il valore ΔF/F0 per la fluorescenza FITC di una vescicola ancorata prima della lesione. Pannello di destra mostra le istantanee della vescicola prima di pregiudizio (-2,5 s), prefusione (91 s), la fusione (93 s) e postfusion (94,5 s). (<pannello strong> D) sinistra mostra un diagramma per il valore ΔF/F0 per la fluorescenza FITC di una vescicola muoversi assialmente (verso e lontano dalla membrana cellulare). Pannello di destra mostra le istantanee della vescicola prima di pregiudizio (-2,5 s), e dopo l'infortunio alla posizione diversa in prossimità della membrana a 59,3, 59,6 e 63,7 s. (E) Istantanee della vescicola che si muoveva orizzontalmente lungo la membrana cellulare in diverse posizioni prima di pregiudizio (-2,5 s) e dopo la lesione al numero (8.7, 10.7, 11.9, 12.8 e 18.8 s). Barra della scala (A = 10 micron, B, C, D, E = 1 micron). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Animata video 1 Figura 2: . reale tempo di imaging di riparazione membrana cellulare in risposta al danno laser in presenza di calcio FM entrata colorante in una cella (indicato in arancione) ferito da pulsatolaser in presenza di calcio. Il film rappresenta 200 immagini acquisite ogni 2 secondi. Dopo fotogramma 4 La cella è stato ferito (regione segnata dalla piazza ciano). Il timbro tempo mostra il tempo in ore: min: sec: Formato msec. Barra della scala = 10 micron.
Animata video 2 Figura 2: . tempo reale l'imaging di riparazione membrana cellulare in risposta al danno laser in assenza di calcio FM entrata colorante in una cella (indicato in arancione) ferito da laser impulsato in assenza di calcio. Il film rappresenta 200 immagini acquisite ogni 2 secondi. Dopo fotogramma 4 La cella è stato ferito (regione segnata dalla piazza ciano). Il timbro tempo mostra il tempo in ore: min: sec: Formato msec. Barra della scala = 10 micron.
Animated Video 3 Figura 4: reale tempo di imaging di lisosomiale exocytosis in risposta al danno laser. differenti risposte dei lisosomi in una cella (indicato in verde, Video 3) ferito da laser impulsato. Il film rappresenta il 2 min di immagini lasso di tempo sequenziali acquisite tramite microscopia TIRF a 5 fotogrammi / sec. Brightfield immagini sono state acquisite ogni 20 sec. La cella è stato ferito (indicato dalla casella ciano) a 2 sec in questo video. I cerchi colorati (grigio, arancione e blu) e la scatola viola segnano i lisosomi descritte in figura 4 ei video animati 4-7, dimostrando le loro diverse sorti dopo la lesione delle cellule. Il timbro tempo mostra il tempo in ore: min: sec: Formato msec. Barra della scala = 10 micron.
Animated Video 4 figura 4 mostra lisosomi esocitica contrassegnato da cerchio grigio che viene reclutato alla membrana in risposta al danno. Alle 7 sec (lesione 5 sec post) in questo video lisosomi viene reclutato a livello della membrana cellularee poi fusibili in questo sito in 1 min e 47 sec. Barra della scala = 1 mm.
Animated video 5 figura 4 mostra lisosomi esocitica contrassegnato da cerchio arancione che è stata ancorata alla membrana prima di pregiudizio e fusibili in questo sito 1 min e 35 sec. Barra della scala = 1 mm.
Animata video 6 figura 4 mostra lisosomi contrassegnati da blu cerchio muoversi verso e lontano dalla membrana cellulare. Barra della scala = 1 mm.
Animata Video 7 figura 4 mostra una regione della cella contrassegnata da scatola viola in Video 3 dove dopo un trauma uno dei lisosomi (cerchio bianco) si muove along membrana cellulare. Barra della scala = 1 mm.
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Discussion
Lesioni membrana cellulare in vivo verifica a causa di una varietà di stress fisiologici e diversi approcci sperimentali sono stati sviluppati per imitare questi. Questi includono il ferimento membrana cellulare delle cellule aderenti raschiando loro fuori il piatto o da passaging attraverso uno stretto 9,10 siringa foro. Seguendo tali lesioni guariscono le cellule in sospensione e non aderire alla matrice extracellulare, come avviene normalmente nel tessuto. Altri ancora, come l'uso di pori formando tossine alterano chimicamente membrana cellulare per l'estrazione di lipidi come il colesterolo, quindi non imitando in vivo le lesioni meccaniche 5. Pertanto, il metodo utilizzato per danno cellulare può influenzare ciò che può essere imparato a conoscere la risposta di riparazione. Ciò richiede di prudenza non solo nella scelta del test danno cellulare, ma anche scegliendo approcci che meglio imitano le lesioni meccaniche in vivo. Tali approcci includono lesioni zero (dove un monostrato di cellule sono feritida un bisturi o un ago) e perline di vetro pregiudizio (dove danno è causato da perle di vetro che rotolano sulle celle aderito). Questi approcci sono adatti per il ferimento di cellule in massa, ma non sono suscettibili di rappresentazione reale tempo di processo di riparazione della membrana cellulare. Uso di microaghi e laser pulsati per creare lesioni localizzate e ben controllati al punto di impatto imitare il danno meccanico e traumatica in vivo e sono suscettibili di imaging in tempo reale della risposta di riparazione, ma permette di comprendere riparazione di una cella alla volta. Vale la pena notare che l'approccio pregiudizio laser pulsato è distinto dall'uso di irradiazione estesa della membrana cellulare con laser pulsato dove il pregiudizio membrana è causato dal riscaldamento localizzato, che è noto per indurre effetti non fisiologici quali danni fotossidativo e fototermico alla membrana lipidi e componenti citosolici 11.
I protocolli qui descritte consentono sfruttare il potenziale di uno of la massa approccio en lesioni, che si basa sull'utilizzo di perle di vetro e uno dell'approccio lesioni localizzate (laser pulsato) per monitorare la capacità, la cinetica e il traffico subcellulare coinvolti nella riparazione di membrana cellulare dopo la lesione dimensione micrometrica. Questi approcci sono reciprocamente gratuito - lesione di massa consente di utilizzare una popolazione di cellule per identificare un deficit nella capacità di riparazione e il traffico subcellulare ad esso associati. Consentendo visualizzazione in tempo reale di riparazione in cellule singole, approccio lesioni laser permette di identificare quale punto riparazione membrana cellulare e subcellulare quali eventi sono associati con il deficit nella riparazione. Questo approccio è stato utilizzato per il monitoraggio delle cellule di riparazione della membrana in organismi mammiferi e invertebrati 7,12,13. In base alle esigenze dell'esperimento uno di questi due approcci potrebbe essere usato da solo. Tuttavia, quando la natura del deficit riparazione non è noto o il meccanismo subcellulare coinvolto in tsuo processo sconosciuto, utilizzando una combinazione di questi approcci è utile.
A causa della variabilità intrinseca del numero di cellule danneggiate tra i campioni a punto finale a base di saggi danno cellulare è necessario identificare in modo indipendente tutte le celle che sono feriti, che sono riusciti a riparare e quelli che non sono riusciti a riparare. L'approccio infortunio perle di vetro che abbiamo descritto qui permette di identificare queste cellule. Nell'effettuare la biglia di vetro ferendo è importante che mentre facendo lo sforzo per massimizzare il numero di cellule feriti lesioni stessi sono lievi modo le cellule non ricevono colpi multipli. Questo è importante in quanto ripetute offese farà sì che le cellule (selettivamente quelli che sono poveri a riparazione) a morire e staccano dal vetrino durante la procedura. Ciò comporterebbe una sottostima di cellule che non sono riusciti a riparare. E 'anche importante evitare qualsiasi rotolamento delle sfere di vetro durante la manipolazione e il lavaggio i coprioggetti per eliminare qualsiasi nuova lesione chesi tradurrà in una colorazione rosso (cellule falsi positivi). Questo approccio per lesioni consente anche il monitoraggio di una popolazione di cellule di superficie cellulare traslocazione della proteina di interesse, come è stato dimostrato qui per lisosoma associato membrana proteina 1 (LAMP1). Durante il monitoraggio solo le proteine localizzate superficie cellulare mediante immunofluorescenza un requisito fondamentale è quello di utilizzare anticorpi che si legano al dominio extracellulare della proteina di interesse e immunolabel cellule prima del fissaggio. Questo permette confrontando il livello LAMP1 alla membrana cellulare in cellule danneggiate con cellule lesionate o tra diverse popolazioni di cellule. Mentre questo protocollo è stato illustrato con LAMP1, può essere applicato a qualsiasi altra proteina di scelta per cui vi è un anticorpo specifico per dominio extracellulare della proteina. Quando infortunio innescato lisosomiale esocitosi deve essere confrontato tra due linee cellulari che non sono stati istituiti per avere basale simile (non innescato da infortunio) di esocitosi lisosomiale, Superficie cellulare LAMP1 colorazione sulle cellule illesi deve essere misurato. Per questo un ulteriore campione viene trattato come campione C2 tranne che al passaggio 9 le cellule devono essere incubate con l'anticorpo primario. Ciò fornirà una misura del tasso basale di esocitosi lisosomiale.
Per il protocollo pregiudizio laser le membrane cellulari sono vittime di un singolo fotone laser pulsato nsec alta intensità. Ferita viene effettuata in presenza di cellule colorante impermeant la cui fluorescenza aumenta su endomembrane vincolante (ad esempio FM 1-43). Pertanto a seguito della cella associata colorante fluorescente fornisce una misura di tempo impiegato dalla cellula per guarire 3. Pregiudizio laser provoca il colorante FM di entrare nella cellula e si legano endomembrane, con conseguente aumento della FM colorante fluorescente. Riparazione della membrana cellulare danneggiato impedisce un'ulteriore entrata colorante nella cellula. Così, per una cella che riparazioni, fluorescenza del colorante raggiunge un plateau, mentre per una cella che non riesce a riparare colorantefluorescenza aumenta continuamente.
Imaging dal vivo cella di singoli eventi subcellulari coinvolti nella riparazione membrana cellulare richiede il monitoraggio della membrana cellulare ad alto rapporto segnale-rumore. Riflessione interna totale fluorescenza (TIRF) microscopia è un approccio adatto per eventi di superficie cellulare di imaging ad alto rapporto segnale-rumore 14-16. Ci sono diversi sistemi TIRF disponibili in commercio e uno di questi sistemi compatibili con l'imaging cellulare dal vivo possono essere utilizzati. Inoltre, abbiamo descritto approcci per la creazione di microscopi TIRF fatti in casa altrove 17,18. Indipendente della configurazione TIRF vi è la necessità di stabilire approcci che consentano il monitoraggio di diversi destini di vescicole subcellulari prima e dopo la lesione. Altrove abbiamo fornito una discussione di tali approcci che consentano il monitoraggio natura, la durata e il grado di fusione di ogni lisosomi 19. Per monitorare lesioni innescato esocitosi di FITC-destrano marcato lysosomes descritti nel protocollo 4, la caratteristica fondamentale di osservare sono i flash. Il flash comporta rilascio di destrano FITC contenuta nel lisosoma individuale in un unico passaggio con conseguente diffusione laterale della fluorescenza. Mentre ogni lampeggio indica in genere una fusione esocitica di singolo lisosomi, è importante stabilire questo monitorando quanto sono presenti molti lisosomi nel sito di fusione prima e dopo il flash.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzioni AR055686 e AR060836 e borsa di studio postdottorato al dC da Francese Distrofia Muscolare (AFM). L'impianto di imaging cellulare utilizzato in questo studio è sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzioni HD040677.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma | H1387 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| HEPES | Fisher | BP410 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| FITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1820 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| Glass beads | Sigma | G8772 | |
| TRITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1818 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| PFA 16% | EMS | 15710 | 4% in PBS |
| Hoechst | Invitrogen | H3570 | 1/10 000 in PBS |
| FM dye | Invitrogen | T3163 | 1 µg/µl in CIM or PBS |
| FITC dextran | Sigma | FD40S | 2 mg/ml in growth medium |
| LAMP1 | Santa Cruz | sc-19992 | 1/300 in growth medium |
| Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG | Invitrogen | A21470 | 1/500 in blocking solution |
| Mounting media | Dako | S3023 | |
| Coverslips | Fisher | 12-545-86 | |
| Glass bottom petridish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Silicone O ring | Bellco | 1943-33315 | |
| Coverslip holder | Bellco | 1943-11111 | |
| Invitrogen | A-7816 | ||
| DMEM | VWR | 12001-566 | |
| FBS | VWR | MP1400-500H | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Penicillin/Sreptomycin | VWR | 12001-350 | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Chicken serum | Sigma | C5405 | 5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining |
| PBS (Ca2+ and Mg2+ free) | VWR | 12001-664 | |
| Epifluorescence microscope | Olympus America, PA | IX81 | |
| TIRF illuminator | Olympus America, PA | Cell^TIRF (IEC60825-1:2007) | |
| Epifluorescence illuminator | Sutter Instruments, Novato CA | Lambda DG-4 (DG-4 30) | |
| CCD Camera | Photometrics, Tucson, AZ | Evolve 512 EMCCD | |
| Image acquisition and anaysis software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Slidebook 5 | |
| Pulsed laser | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Ablate (3iL13) | |
| Stage top incubator | Tokaihit, Japan | INUBG2ASFP-ZILCS |
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