Summary
Metoden förklarar hur att bygga och driva en kontinuerlig 13 C och 15 N isotopmärkning kammare för enhetlig eller differentiell växtvävnad märkning. Representativa resultat från metaboliska och strukturell märkning av Andropogon gerardii diskuteras.
Abstract
Spåra sällsynta stabila isotoper från växtmaterial genom ekosystemet ger den mest känsliga informationen om ekosystemprocesser, från CO 2-flöden och organiskt material i marken bildas till småskalig stabil-isotop biomarkör sondering. Koppling flera stabila isotoper, såsom 13C med 15 N, 18 O eller 2 H har potential att avslöja ännu mer om komplexa stökiometriska förhållanden under biogeokemiska transformationer. Isotop märkt växtmaterial har använts i olika studier av kullen nedbrytning och markens organiska material bildas 1-4. Från dessa och andra studier har det dock visat sig att strukturella komponenter i växtmaterial beter sig annorlunda än metabola komponenter (dvs.. Lakbara lågmolekylära föreningar) i form av mikrobiell användning och långsiktig lagring av koldioxid 5-7. Möjligheten att studera strukturella och metabola komponenterför sig ger ett kraftfullt nytt verktyg för att främja spetsen för ekosystem biogeokemiska studier. Här beskriver vi en metod för framställning av 13 C och 15 N märkt växtmaterial som är antingen likformigt märkt hela växten eller differentiellt märkta i strukturella och metaboliska växtkomponenter.
Här presenterar vi byggande och drift av en kontinuerlig 13 C och 15 N märkning kammare som kan ändras för att möta olika forskningsbehov. Enhetligt märkt växtmaterial är producerad av kontinuerlig märkning från planta till skörd, medan differentiell märkning uppnås genom att ta bort de växande plantor från kammar veckor före skörd. Representativa resultat från växande Andropogon gerardii Kaw demonstrera systemets förmåga att effektivt etikett växtmaterial på de riktade nivåer. Genom denna metod har vi producerat växtmaterialet med en 4,4 atom-% 13 C och 6,7 atom-% 15 </ Sup> N enhetlig växt etikett eller material som differentiellt är märkt med upp till 1,29 atom% 13 C och 0,56 atom% 15 N i sin metabola och strukturella komponenter (varmvatten extraherbara och varmvatten rest komponenter, respektive). Utmaningarna ligger i att upprätthålla rätt temperatur, fuktighet, CO2-koncentrationen, och ljusnivåer i en lufttät 13 C-CO 2 atmosfär för framgångsrik växtodling. Denna kammare beskrivning utgör ett användbart forskningsverktyg för att effektivt producera jämnt eller differentiellt multiisotopmärkt växtmaterial för att användas i försök på ekosystemet biogeokemiska cykling.
Introduction
Att förstå dynamiken i växt-mark-atmosfär processer är avgörande för exakt förutspå hur den globala kol (C) och kväve (N) cykler fungerar under nuvarande och framtida miljöförhållanden. Stabila isotoper är kraftfulla verktyg i kvantitativa studier av växt-jord-atmosfären C och N cykling. Spåra sällsynta stabila isotoper från växtmaterial genom ekosystemet tillhandahåller känslig information i studier av biogeokemiska cykler, från CO 2-flöden och organiskt material i marken bildas till småskaliga stabil-isotop biomarkör sondering t.ex. 4,8,9. Kombinera 13 C märkning med 15 N märkning, eller andra stabila isotoper såsom 2 H eller 18 O i växtvävnad ger en hög upptäckt, spårbart, men ändå komplext substrat för användning i kopplade studier av växt-och jord biokemi. Förmågan att enhetligt eller differentiellt märka strukturella och metabola växtmaterial annonsds ytterligare förmåga att ta upp komplexa frågor om C och N cykling genom ekosystem. Fördelen med användning av isotopmärkt växtmaterial i kvantitativa studier av C och N redovisning, beror emellertid på förmågan att producera 13 C och 15 N märkt material som är antingen likformigt eller differentiellt märkta.
Isotop märkningen har använts i studier som tar upp växt C och N assimilering 10, fördelning 11 och rhizodeposition 12. Enhetligt 13 C och 15 N märkt växtmaterial ger en komplex märkt substrat för studier av strö nedbrytning 1,4, organiskt material i marken bildning 2,6, mark CO 2-utsläpp 4, jordnäringsväven Studier 13, samt studier av mark C tider bosättning 2,14. Studier som använder 13 C märkt biochar från märkt växtmaterial börjar också avslöja ny information om tidigare förbiseddjord röding pooler 15. Medan 15 N, 2 H, och 18 O märkning är relativt lätt att uppnå genom vatten och gödnings behandling existerar utmaningen i att producera likformigt 13 C-märkt växtmaterial genom 13 C-CO 2 fixering.
Kontinuerlig isotopmärkning från planta till mognad i en förseglad kammare producerar enhetlig isotopmärkning i hela anläggningen. Andra metoder, såsom upprepad pulsmärkning 16 och bladapplicering eller wicking 17,18 producerar inte likformigt isotop märkt växtmaterial eller tydlig avvikelsen märkning av särskilda C-föreningar (t.ex. metabolisk kontra strukturell) 19. En viktig fråga vid isotopmärkning märkning effektivitet, på grund av den höga kostnaden för sällsynta isotop anrikade föreningar som används i märkningen. Även om kontinuerlig 13 C märkning har använts i det förflutna 2-4,20, det finns inte så vitt vi veten publicerad detaljerad teknisk beskrivning av en kontinuerlig märkning kammare med tecken på hög märkningseffektivitet och noggrann kontroll av mängden och enhetlighet isotopmärkning.
I spetsen för kullen nedbrytning och markens organiska material bildas forskning är konceptet att metabola växtmaterial (dvs. lakbara, labila, lågmolekylära föreningar) och struktur växtmaterial (dvs.. Lignin, cellulosa, hemicellulosa) behandlas olika vad gäller mikrobiell Använd effektivitet, markens organiska material bildning, och på lång sikt mark C förvaring 5-7. Växtmaterial som differentiellt är märkt i sina strukturella och metabola komponenter, alltså, är ett användbart verktyg för att föra strö nedbrytning och markens organiska material bildas forskning. Differential märkning med dubbla isotoper möjliggör spårning av strukturella och metabola komponenter separat genom ekosystemet med en gren pool isotop technique 21.
Kontinuerlig isotopmärkning med 13 C och andra isotoper i en förseglad kammare kräver noggrann uppmärksamhet för att plantera fysiologiska betingelser för att maximera anläggningens produktivitet och isotopmärkningseffektiviteten. Dagtid temperaturtoppar måste kontrolleras för att förhindra växtskador när växer i en lufttät kammare. Ett optimalt utbud av fukt och temperatur krävs för att bibehålla öppna växt klyvöppningar och CO2 upptag 22. Hög luftfuktighet orsaka imma på kammarens väggar, vilket minimerar ljus tillgänglighet och kan skada kammarstrukturen. Noggrant övervägande och isotop effektivitetsmärkning genom att eliminera naturliga överflöd isotoper från kammaren (till exempel kommer från ingjutning med organiskt material i marken) och förhindra exponering för extern luft är viktigt när man arbetar med dyra tung-isotopmärkta föreningar.
Här presenterar vi en metod för att bygga och driva enkontinuerlig dubbel 13 C och 15 N isotopmärkning kammare för produktion av växtmaterial som är antingen jämnt märkta eller har sina strukturella och metabola komponenter märkta på olika nivåer. 13 C märkning styrs på kammarnivå, medan gödsling och 15 N märkningen är kontrolleras på individ potten nivå. Representativa resultat visas för att demonstrera förmågan hos denna metod för att styra temperatur, fuktighet, och CO2-koncentrationen under hela växtsäsongen. Resultat från växande Andropogon gerardii, Kaw visar också denna metod förmåga att producera jämnt eller differentiellt märkta växtmaterial. Den specifika kammar utformning och drift system beskrivs kan modifieras för att odla olika växtarter, samt att rymma 2 H eller 18 O-märkning.
Protocol
1. Avdelningen Konstruktion
- Konstrukt märkning kammaren i ett växthus för att möjliggöra maximal dagsljus potential för växternas tillväxt. Se till att tillräcklig strömförsörjning finns för att driva alla kammarkomponenter.
- Konstruera märkningen kammaren genom att montera 3.175 mm tjock transparent akryl väggar (polykarbonat skulle också vara lämpliga) och en 6,35 mm tjock transparent akryl tak på en aluminiumram med en vit-målat stål golv för att maximera solreflektans. Måtten på kammaren kan skräddarsys för att passa individuella forskningsbehov.
- Montera kammaren på ¾ tum (19 mm) plywood på aska block.
- Borra hål i akrylglas, aluminium och stål golv och använda skruvar för att fästa alla komponenter tillsammans.
- Täta alla skarvar med silikon täta för att säkerställa en lufttät tätning.
- Konstruera en dörr genom att montera en sektion av akryl paneler på långa skruvar, som kan skruvas ner med remototala brukade vingmuttrar.
- Täta dörren med gummilister för att förhindra luftläckage.
- Välj ett område i direkt anslutning till kammaren som ledningscentralen för att montera alla temperatur, fuktighet, CO2-kontroller och övervakningsutrustning.
- Borra försiktigt små hål i kammarväggen vid kontrollcenter för alla elektriska ledningar och gas slangar. Använd silikon täta för att täta hålen runt alla kablar och slangar för att förhindra luftläckage.
- Testa kammaren för luftläckage genom att fylla det med en hög nivå av CO2 (t ex 800 ppm) och låta det sitta över natten. Om CO2-koncentrationen i provkammaren skall hållas på sin ursprungliga nivå då det är lufttätt. Om koncentrationen sjunker under natten då alla sömmar ska undersökas och återförslutas med silikon täta tills en lufttät tätning uppnås.
- För vissa växter som är anpassade till höga ljusförhållanden, till lampor anslutna till en timer för den omedelbara yttre av cHamber att öka ljuspenetrering och anläggningens produktivitet.
2. Temperatur-och fuktkontroller
- Reglera kammartemperatur genom att installera en kommersiell split typ luftkonditioneringen med kylning (förångare) spolar placerade inne i kammaren och kompressorn och kondensorbatterier belägna utanför växthuset för att leda bort värmen. Ställ in luftkonditioneringen för att hålla önskad temperatur.
- Använd ett litet rum avfuktare för att styra luftfuktigheten i kammaren.
- Borra ett dräneringshål genom golvet av kammaren intill avfuktaren.
- Avlägsna kondensatuppsamlare från avfuktaren och anslut ett dräneringsrör från avfuktaren genom dräneringshålet i golvet av kammaren.
- Under kammaren, placera en öppen burk fylld med vatten för avfuktaren rinna direkt in. Detta skapar en lufttät tätning utan också möjliggöra tryckutjämning.
- Anslut kontrollenheten till avfuktningssystem med en solid-state relä och ställa fuktregulatorns med en hög larm och svinga för att upprätthålla optimala växtförhållanden i kammaren. Optimal temperatur-och fuktighetsförhållanden kommer att variera för olika växtarter.
3. CO 2 Kontroller
- Den 13 C-CO2 anrikning sker med hjälp av två rena CO2 gasbehållare, en av 10 atom% 13 C-CO 2 eller högre och en av 1,1 atom% 13 C-CO2 (naturligt överflöd).
- Övervaka CO2-koncentrationen genom att ha en membranpump drar kontinuerligt kammar luft genom en infraröd Gas Analyzer (irgA) och sedan pumpa luften tillbaka in i kammaren och därmed upprätthålla ett slutet system (figur 1).
- SelenTA låg larm och dödband på irgA programvara för att hålla CO2-koncentrationer inom ett önskat område. Här använder vi en låg larm på 360 ppm med en 40 ppm dödband att hålla CO 2-koncentrationer mellan 360-400 ppm.
- Anslut en doseringsventil för varje tank och försiktigt anpassa dem för att nå målet 13 C anrikningsnivå. Ställ tank regulatorer till 20 psi.
- Sätt i en magnetventil mellan doseringsventil och regulator av varje tank. Gå med utloppen från de två doseringsventiler tillsammans och rör dem i centrum av kammaren. Wire en solid-state relä till irgA utgång för att styra magnetventilerna (Figur 1).
4. Webbaserad Remote Monitoring System
- Övervaka CO 2-koncentrationer från irgA programvaran genom att logga det till en lokal fil en gång var 30 sek.
- Skapa ett eget verktyg (t.ex. Perl eller annat programmeringsspråk) för att plockaupp poster från den lokala CO2 loggning fil, tillsammans med den nuvarande laptop tidsstämpel, och ladda upp dem till en back-end webbapplikation.
- Ställ in webbapplikationen för att söka i temperatur och luftfuktighet sensordata.
- Använd ett övervakningssystem för att kontrollera status för temperaturen i kammaren var femte minut för att förhindra eventuella temperaturtoppar som skulle förstöra växterna om luftkonditioneringen misslyckades.
- Övervaka data CO2, temperatur och fuktighet på en vanlig webbläsare, så att oväntade spikar temperatur eller CO 2 droppar omedelbart kan åtgärdas.
5. BEVATTNINGSANLÄGGNING
- Borra ett litet hål i väggen på akrylglas kammaren per kruka.
- Använd bevattning slang för att skapa en droppbevattning ring per kruka och mata bevattningsslangen genom kammarväggen till det yttre.
- Täta hålen runt bevattningsslangen med silikon tätaför att förhindra luftläckage.
- På utsidan av kammaren, anslut spolslangen till rörledningen för en peristaltisk pump.
- Använd en liten slangklämma för att stänga av all bevattning slang för att förhindra luftläckage mellan vattning.
6. Potting Växter
- Välj en pott storlek lämplig för växterna som odlas. Här, 40, är 15 L krukor används.
- Skapa ett jordfritt ingjutning mix genom att blanda sand, vermikulit och profil porös keramik.
- Testa den vattenhållande kapaciteten hos potting mix genom vägning av en fylld kruka torr, blötläggning potten med vatten och låta den rinna fullständigt, och vägning potten våt. Använd denna maximala vattenhållande förmåga för att säkerställa inte läcker att överskott märkt gödsel och vatten ur krukorna under vattning.
- Gro frön i planteringsjord innan plantera dem i krukor. Detta säkerställer att endast lyckats grodda frön startas i märkning kammaren.
- Inokulera t Han plantor med ny jord slurry att införa nyttiga mikrober.
- När fröna har grott, försiktigt transplantera plantor till krukor i det önskade numret.
- När krukväxter, flytta krukorna in i kammaren och montera varje kruka med en individuell bevattningsslang.
7. Tätning kammaren
- När första tätnings dörren till kammaren en stor massa av extern luft fyller kammaren utrymme. Skrubba ut denna externa CO 2 genom att ansluta en natronkalk skrubber till luftpumpen för att skrubba den CO 2-koncentrationen till åtminstone 200 till 250 ppm innan de fylls kammaren tillbaka upp till 400 ppm med användning av tankblandning 13 C-CO 2.
- Försök att hålla kammaren stängd genom varaktigheten av växtsäsongen för att minimera naturliga överflödet CO 2 kontamination.
- Övervaka växtligheten visuellt och justera gödsling och bevattning beroende på efterfrågan.
- Använd en gödselmedelslösning, såsom en modifierad Hoagland lösning 23, för att gödsla växter via bevattningssystem.
- Märk gödselmedlet med 15 N med hjälp av en 15 N-KNO3 subsolution vid riktad atom% 15 N-nivå genom att blanda 98 atom% 15 N-KNO3 med naturligt överflöd 15 N-KNO 3 (0,37 atom% 15 N).
- Blanda upp tillräckligt av gödselmedelslösningen vid varje befruktning händelse för hela kammaren, baserat på den vattenhållande kapaciteten hos potting mix. Placera rätt mängd gödsel i en kruka i en glasburk, och förbereda så många burkar det finns krukor.
- Ta loss bevattningsslangar och placera var och en av dem i en burk med gödsellösningen, och sedan koppla dem till den peristaltiska pumpen.
- Vattenväxter genom att pumpa vatten genom den peristaltiska pumpen genom den enskilda dropp irritationrande slangar regelbundet som växterna behöver det.
- Befruktning med Hoagland lösning bör följa efterfrågan växt eller experimentell design, med ökad efterfrågan näringsämnen som växten produktivitetsökningar för att maximera produktiviteten.
- Först pumpa Hoaglands lösning genom bevattningsslang, sedan pumpa en vattensköljning genom att minimera alg-och bakterietillväxt i rören.
- Spänn alla slangar efter gödsling och bevattning för att eliminera kammarluftläckage.
9. Uniform och differentierad Märkning
- För differentiell märkning av strukturella och metabola komponenter, ta bort växter från märkning kammaren 1-3 veckor före skörd. Växter som ska enhetligt märkt kan vara kvar i den förseglade märkning kammaren kontinuerligt tills skörd och bevattnas med 15 N-Hoagland lösning.
- Behåll de borttagna växter i växthuset under denna tid, så att de får tillräckligt ljusoch CO2 vid naturlig överflöd 13 C.
- För differential 15 N märkning, fortsätter att gödsla och vattna växterna som vanligt, men använd naturlig överflöd 15 N-KNO3 i Hoagland s gödselmedelslösning.
10. Skörd
- Sluta vattna växter 1 vecka före skörd så att växterna börjar senesce och planteringsmediet torkar ut.
- Öppna kammaren och flytta krukorna ut för omedelbar klippning och skörd av ovan jord biomassa
- Häll ut planteringsjord mix och rötter över en grov sikt.
- Använd skärmen för att skilja ut rötterna från ingjutning mix och skaka rötterna gratis planteringsjord mix.
- Placera rötterna på en 2 mm sikt och skölja dem med vatten för att avlägsna eventuell kvarvarande ingjutningsmaterial. Använd pincett för att ta bort eventuella vermikulit som kan hålla fast vid rötterna.
- Låt rötter lufttorka i förberedelse för framtida experiment.
- Väg lufttorra växtmaterial för att bestämma märkningskammar biomassa.
- Slipa ett delprov för kemisk analys.
- Placera 2,0 g av ugnstorkad (60 ° C) kull i en 125 ml syratvättad kolv och tillsätt 50 ml avjoniserat vatten.
- Placera provet i en förvärmd (60 ° C) omrörare platta och placera en omrörare i kolven. Ställ omrörning under 200 rpm och tillåta provet att värma under 30 min.
- Efter 30 min, filtrera strö lösningen genom ett 20 ^ m Nylon mesh på en vakuum-filtreringssystem.
- För över extraktet till en förvägt syra tvättade rör och frysa.
- Överför fast kull återstoden till en i förväg vägd aluminiumskål och torka vid 60 ° C. Väg pannan och strö efter torkning för att bestämma massvarmvattenrester.
- Frystorkades varmvattenextrakt och väg för att bestämma den varmvattenextrakt massa.
- Analysera ugnstorkades (60 ° C) kull, frystorkning varmvattenextrakt, och ugnstorkad varmvattenrester i en Elemental Analyzer - Isotopkvotsmasspektrometern (EA-IRMS).
Representative Results
Vår märkning Kammaren är 1,2 mx 2,4 mx 3,6 m i storlek och rymmer 40,15 L krukor (Figur 1). Det datoriserade irgA kontrollsystemet underhålls CO 2-koncentrationer mellan våra uppsatta värden för 360 och 400 ppm under fotosyntetiskt aktiva tid på dygnet (figur 2a). Den låga CO2-larmfunktionen på irgA utlöste magnetventiler för att låta CO2 från 13C berikad och naturliga överflöd stridsvagnar in i kammaren när koncentrationen sjunkit under minimitröskeln (t ex 360 ppm). Den döda bandfunktionen stoppade flödet när koncentrationen nått den övre börvärde (t ex 400 ppm). Den iSeries temperatur och luftfuktighet övervakningssystem ansluten till luftkonditioneringen och avfuktare höll klimatförhållanden inom de inställda parametrarna under hela växtsäsongen (Figur 2b). Vi använde en en-tons (3,5 kW) luftkonditionering enhet att KEep kammar cool.
Fjärr övervakningssystemet tillät loggade data som ska visas när som helst genom en vanlig webbläsare. CO 2-koncentrationer, temperatur-och fuktighetsvärden ned samplas av webbapplikationen för att visa grafer över de senaste 24 till 240 timmar, i 24 steg om hr. Detta skapade en snabb visuell för att bekräfta att de dagliga fluktuationer var inom de förväntade gränserna. Kollar webbgränssnittet också visade den aktuella kammar status, samt som varnar för potentiella problem som inte tar emot nya data. När som helst den kompletta dataset även kan laddas ner från webbgränssnittet.
Vi mätte fotosyntetiskt aktiv strålning (PAR) i den omedelbara inre och yttre av kammaren på fyra punkter med och utan lamporna på i mitten av sommaren och mitt på dagen med hjälp av en kvantsensor. PAR i kammaren var 31,5% lägre än det yttre när kammarljusen were av och 22% lägre än det yttre när ljuset var på. Sålunda kammarljusen bidra till att avsevärt öka PAR penetrering inuti kammaren med 9,5% (P <0,05).
Vårt kontinuerliga märkningssystem kunde producera 2759 g A. gerardii biomassa, var 37% av de som ovan jord biomassa och 63% av de som var belowground biomassa. Vi uppnådde en 4,4 atom% 13 C hela anläggningen etikett i vår uniform växtmaterial genom att magnetventilerna på de två CO 2 tankar om detta (Figur 1, Tabell 1). Vi åstadkom en 6,7 atom-% 15 N hel växt etikett i vår likformig växtmaterialet genom att blanda 98 atom-% 15 N-KNO3 med 0,37 atom-% 15 N-KNO 3 i KNO3 subsolution av en modifierad Hoagland lösning 23 (tabell 1) . Vi vattnade A. gerardii varje vecka med 750 ml total vätska (vatten plus Hoagland lösning) i hela den växande havetson. Vi gödslade med 200-500 ml 15 N märkt Hoagland lösning per vecka beroende på anläggningens produktivitet.
Vi utnyttjas hetvattenextraktion metod för att bestämma om det fanns isotopiska skillnader mellan den enhetliga och differentiellt märkta växtmaterial. För differentiellt märkta växter, efter skörd vi bort alla blad som var helt döda och hanteras dessa separat eftersom de sannolikt inte differentiellt märkt. När man tittar på 13 C innehåll, alla fyra inkorporerings dagarna var signifikant skilda från varandra för hela anläggningen och varmvattenextrakt, men för varmvatten rest dag 14 och 22 var inte signifikant från varandra (Tabell 1). Vid en jämförelse av växtvävnadsfraktioner inom varje dag, var signifikant olika från varandra varmvattenextraktet och återstoden för alla fyra dagar och vid dag 22 hela växten, extrahera och återstoden var alla betyficantly skiljer sig från varandra (tabell 1). För 15 N inkorporering i anläggningsdelar, det fanns skillnader mellan dagarna för bildandet och växtvävnadsfraktioner. För varmvattenextrakt alla fyra inkorporerings dagarna var signifikant skilda från varandra för 15 N, och för hela anläggningen och det varma vattnet kvar den kortare dagar för inkorporering var betydligt annorlunda än de längre dagarna av bolagsordning (tabell 1). Växtvävnaden fraktionerna i de enhetliga plantorna var inte signifikant skilda från varandra i 15 N, men det varma vattenextraktet och återstoden var signifikant skilda från varandra i 15 N för differentiellt märkta kull.
Alla isotop värden redovisas enligt atomprocent (atom%) notation (ekvation 1), vilket är en mer korrekt notation än% för att använda vid höga halter av tungisotopanrikning 21. Till exempel:
(1)
För denna studie, sprang vi statistiska analyser med hjälp av SAS version 9.2. Vi testade skillnader mellan kammarens inre och yttre ljusnivåer med användning av ett parat t-test. Vi testade skillnader mellan 13 C och 15 N märkning av extrakt varmvatten och varmvattenrester med hjälp av envägs variansanalys (ANOVA) i PROC ANOVA. Vi använde Duncans Multiple Range-test för multipla jämförelser analys. Betydelse godtogs som P-nivå på 0,05. Vi använde en Wilcoxon rank sum test för att testa att uppgifterna mötte antaganden i analysen.
Figur 1. Schematic diagram av 40 potten kapacitet kontinuerlig flerisotopmärkning kammaren från ett fågelperspektiv. Streckade linjerna representerar elektriska ledningar, medan heldragna linjerna representerar gas eller vattenslangen. Klicka här för att visa en större bild.
. Figur 2 A) Genomsnittlig CO2-koncentration (ppm) (+ / -. SE) under en tjugofyratimmarsperiod för en hel växtsäsong B) Genomsnittlig temperatur (º C), öppna cirklar, och fuktighet (%), slutna cirklar . (+ / - SE) under en tjugofyratimmarsperiod för en hel växtsäsong Klicka här för att visa en större imålder.
| Uniform (0) | Differential (7) | Differential (14) | Differential (22) | ||
| Hela kullen | 13 C-atom% | 4,46 ± 0,02 Aab | 3,93 ± 0,05 Ba | 3,64 ± 0,03 Ca | 3,35 ± 0,06 Db |
| 15 N-atom% | 6,69 ± 0,07 Aa | 6,72 ± 0,01 Aa | 6,33 ± 0,06 Ba | 6,41 ± 0,07 Ba | |
| 13 C-atom% | 4,59 ± 0,04 Aa | 3,35 ± 0,06 Bb | 2,79 ± 0,06 Cb | 2,37 ± 0,03 Dc | |
| 15 N-atom% | 6,69 ± 0,03 Aa | 6,43 ± 0,01 Bb | 5,89 ± 0,07 Db | 6,16 ± 0,05 Cb | |
| Varmvatten Återstod | 13 C-atom% | 4,37 ± 0,06 Ab | 4,1 ± 0,03 Ba | 3,79 ± 0,10 Ca | 3,66 ± 0,05 Ca |
| 15 N-atom% | 6,57 ± 0,04 Ba | 6,71 ± 0,02 Aa | 6,45 ± 0,02 Ca | 6,44 ± 0,03 Ca |
Tabell 1.
Discussion
Denna design för en kontinuerlig isotopmärkning kammare användes för att producera likformigt och differentiellt 13 C och 15 N märkt A. gerardii för efterföljande fält-och laboratorieexperiment. Under tre växtsäsonger i drift, har kammaren lyckats fortsätta temperatur, luftfuktighet och CO 2-koncentrationer inom de inställda parametrarna (Figur 2). Tillförlitligheten i temperatursystemet är kritisk under toppen av sommaren när höga solstrålning kan leda till överhettning i lufttäta kammare. Eliminera överflödig fukt som orsakas av transpiration från de växande plantorna ser till att anläggningen klyvöppningar förbli öppen för foto upptag 22 och att kondens inte hämmar ljuspenetrering eller skada strukturen i kammaren.
Den nära kontinuerlig övervakning av CO 2-koncentration av irgA mjukvaran underhålls kontinuerligt13 C-märkning av plantorna medan de växte i kammaren. På grund av den höga fotosyntetisk aktivitet hos A. gerardii växer i denna kammare, har CO2 in i systemet ofta i dagsljus i toppen växtsäsongen när fotosyntetiska aktiviteten drog CO 2 koncentrationer ner till 360 ppm, ungefär var 15-20 min. Doseringen av den berikade och naturliga överflödet 13 C-CO 2-tankar som tillåts för en kontrollerad 4,4 atom-% 13 C atmosfären genom växtsäsongen för jämn växtvävnad märkning. 13 C-CO 2 produktion kan också uppnås genom att blanda 13 C-natrium bikarbonat eller 13 C-natriumkarbonat och saltsyra, men denna typ av system är mer komplicerat och kräver mer övervakning och underhåll, så vi rekommenderar användning av 13 C-CO 2-gas. En viktig faktor för att övervaka CO2 concentrations använder en irgA är att IR-analysatorer förlora två tredjedelar av deras känslighet vid mätning 13 C-CO2. Denna underskattning av ca 2,9% ppm för våra 4,4% 13 C-CO2 blandning var inte ett stort bekymmer för oss, men kan bli en viktigare fråga när märkning på högre 13 C-nivå 27.
A. gerardii är en varm säsong perenna Tallgrass Prairie graminoid arter. Utformningen av denna kammare var optimerad för A. gerardii produktion (Figur 1). Storleken och höjden på kammaren valdes som ersättning för den maximala höjden produktivitet A. gerardii på fältet, liksom för den önskade produktionsanläggning biomassa för framtida experiment. A. gerardii är känt för att vara ljus begränsas inom området 24,25. PAR i ett växthus kan minskas med 30-47% jämfört med yttre nivå 26. Eftersom vår anläggnings odlades i ett akrylglas kammare inne i ett växthus, PAR begränsning var ett bekymmer. När den är på de lysrör ökade PAR i kammaren med 9,5%, vilket kan ha bidragit till att öka produktiviteten i denna ljuskänsliga arter. När du använder denna kammare design för att odla andra typer av växter specifika fysiologiska behov som storlek, belysning, näringskrav, temperaturkänslighet, och markfuktighet bör noga anpassade för att upprätthålla optimala odlingsförhållanden för växterna.
När man arbetar med dyra isotopiskt märkta föreningar, såsom 10 atom-% 13 C-CO 2 och 98 atom-% 15 N-KNO3, effektivitet med märkningen är en viktig faktor. Denna kammare konstruktion optimerar 13C märkning genom att göra alla ansträngningar för att försegla kammaren och minimera luftläckage in i och ut ur kammaren. Om denna kammare aldrig öppnas under växtsäsongen, då ingen av de 13 C-etiketted CO 2 från kammaren är läckt ut till atmosfären. Den CO2 bygga upp under natten andning verkar inte skada växande växter och snabbt tas upp efter soluppgången (Figur 2). Under differentiell märkning, var kammaren kort öppnas för att ta bort de differentiellt märkta krukor men det verkade inte späda den riktade 4,4 atom% 13 C märkning av de kontinuerligt märkta plantor (Tabell 1). 13 C märkning också optimerats genom att skura ut initial atmosfärisk luft i kammaren vid tätning. Under förberedande prov på kammaren utan en initial skrubba av atmosfärisk CO2, var plantor uppmättes ha en utspädd 13 C-nivå i de första bladen som produceras än i de senare bladen produceras. Den initiala skrubba av atmosfärisk CO2 vid kammar nedläggning är att eliminera detta problem genom att tillåta kontinuerlig 13C märkning frånplanta till förfall. Att upprätthålla ett jordfritt ingjutning blandning av sand, vermikulit, och lera också eliminerar naturligt överflöd CO2 föroreningar från markandningen. Elimineringen av jord från systemet kräver noggranna befruktning och ympning överväganden, som kan vara unika för olika växtarter. 15 N märkning genom den riktade 7 atom% 15 N Hoegland lösning produceras mycket märkt växtmaterial på 6,7 atom% 15 N (tabell 1). En viss utspädning från den riktade 15 N etikett kan orsakas av några naturliga överflöd N i ingjutning mix eller från den befintliga jorden ympning.
Under biosyntesen av föreningar, naturliga diskriminering av 13 C (eller 15 N) sker som ett resultat av kinetisk fraktionering och nonstatistical isotopfördelning i de syntetiserade föreningarna. Således, i fallet med C, sekundära produkter (t.ex. lipider, fenolföreningar) är i allmänhet utarmat på 13 C i jämförelse med primärprodukter (kolhydrater). Denna naturliga diskriminering 13 C tycks kvarstå även när växter odlas i en berikad 13C atmosfär, som kan ses i den lilla skillnaden i atom% 13 C i varmvattenextrakt och rester varmvatten för enhetligt märkta plantor (Tabell 1 ). Denna naturliga kinetiska fraktionering är mycket liten jämfört med anrikningen och inte äventyrar enhetligheten i märkningen.
Differential märkning av strukturella och metaboliska växtvävnader är en ny teknik med potential för avancerade studier i kull nedbrytning, mikrobiell ekologi och markens organiska material bildas. Skillnaden i 13 C och 15 N på varmvattnet extrakt och varmvattenrester tyder på en betydande utspädning av 13 C och 15 N i urlakningsbart, lågmolekylvikt föreningar (varmvatten extrakt) från konstruktions växtmaterial (varmvatten rester) efter 7, 14, och 22 dagar för differentiell märkning (P <0,005). Denna differentiella märkningen av växtvävnader kan användas för att spåra vad som händer med de strukturella och metaboliska komponenter separat genom ett ekosystem. Den 13 C differential märkning var mer extrem än 15 N differentiell märkning. Detta kan bero på omedelbarhet 13C utspädning när du tar bort växterna från 13 C-CO2 märkt atmosfär, medan 15 N märkningen är fortfarande i planteringsjord mix under en tid och 15 N utspädning sker långsammare. För mer drastiska differentiell märkning av 15 N, kan man överväga att spola krukorna med vatten före naturligt överflöd gödsling under de sista veckorna av tillväxten utanför kammaren.
Utformningen och driften av denna kontinuerliga 13 </ Sup> C och 15 N märkningssystem för uniform eller differential, metabola och strukturella, växtvävnad märkningen ger en ny metod för att framställa isotopmärkt växtmaterial för avancerad forskning. Den utformning och operativa detaljer i denna kammare har valts för 4,4 atom% 13 C och 7 atom% 15 N märkning av A. gerardii, men kan anpassas till andra typer av vegetabiliska och isotopmärkningsnivåer. De odlingsförhållanden som beskrivs här bör skräddarsys för att passa den storlek, temperatur, luftfuktighet, ljus, vatten och näringsämnen krav på speciella växtarter av intresse. Märkning med 18 O eller 2 H kan också uppnås genom att märka det vatten som används i bevattningssystem. Det system som beskrivs här tar upp många av de utmaningar som en enhetlig och differential 13C märkning av växtmaterial. Denna grundläggande kammar design kan användas av andra forskargrupper för att producera mycket märkt växtmaterial för advlad studier i ekosystemet biogeokemi.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Särskilt tack till växt ökad tillväxt och EcoCore analytisk anläggning vid Colorado State University och till de många elever och lärare som hjälpt till med detta projekt. Detta arbete finansieras av NSF DEB bidraget # 0918482, USDA National Needs Fellowship, och Cotrufo-Hoppess fond för markekologi forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40 in Remote Tower Fan | Living Accents | FS10-S3R-A | |
| 42 in Electric Tower Fan with remote control | LASKO | 2559 | |
| Mr. Slim Split-type air conditioner | Mitsubishi Electric | R410A | |
| Electronic 24 hr time switches | Intermatic | ET100C | Operates Fluorescent Light System |
| iSeries Humidity and Temp Controller | Omega | CHiTH-i8DV33-5-El | |
| Solid State Relay | Omega | SSRL240 | |
| CKR Series Solid State Relay | Crydon | ||
| Solenoid Coils | Dayton | 6X543 | |
| GasHound CO2 Analyzer | LI-COR | LI-800 | |
| Dehumidifier | Dayton | 1DGX4 | |
| Specialty gas regulator | Airgas | CGA 580 | |
| T5 Hight Output Commercial Fluorescent Light System | Hydro Farm | FLT48 | |
| Air pump | Thermo Scientific | 420-1901 | |
| Masterflex Cartridge Pump HeadSystem | Cole Parmer | 7553-70 | |
| 1900 Series Network Switch | Catalyst | ||
| Profile Porus Ceramic Top Dressing | Greens Grade | ||
| Industrial Quartz 40 mesh | Unimin | 4095 | |
| Mycorrhizae Professional Growing Medium | ProMix | ||
| Vermiculite and Perlite | Thermo-Ran | C633 | |
| Potassium Nitrate- 15N 98 atom % | Sigma-Aldrich | 335134 | |
| Carbon-13C Dioxide 10 atom % | Sigma-Aldrich | 600180 | |
| Medical grade CO2 | Airgas | ||
| Regulator | Airgas | CGA 350 | |
| 4 in box fans | Grainger | ||
| Masterflex PharMed BPT Tubing | Cole Parmer | HV-06508-24 |
References
- Bird, J. A., Torn, M. S. Fine roots vs. Needles: A comparison of (13)C and (15)N dynamics in a ponderosa pine forest soil. Biogeochemistry. 79, 361-382 (2006).
- Bird, J. A., van Kessel, C., Horwath, W. R. Stabilization of C-13-carbon and immobilization of N-15-nitrogen from rice straw in humic fractions. Soil Sci. Soc. Am. J. 67, 806-816 (2003).
- Denef, K., Six, J. Contributions of incorporated residue and living roots to aggregate-associated and microbial carbon in two soils with different clay mineralogy. Eur. J. Soil Sci. 57, 774-786 (2006).
- Rubino, M. Carbon input belowground is the major C flux contributing to leaf litter mass loss: Evidences from a C-13 labelled-leaf litter experiment. Soil Biol. Biochem. 42, 1009-1016 (2010).
- Cotrufo, M. F., Wallenstein, M. D., Boot, C. M., Denef, K., Paul, E. The Microbial Efficiency-Matrix Stabilization (MEMS) framework integrates plant litter decomposition with soil organic matter stabilization: do labile plant inputs form stable soil organic matter. Glob. Change Biol. 19, 988-995 (2013).
- Mambelli, S., Bird, J. A., Gleixner, G., Dawson, T. E., Torn, M. S. Relative contribution of foliar and fine root pine litter to the molecular composition of soil organic matter after in situ degradation. Org. Geochem. 42, 1099-1108 (2011).
- Prescott, C. E. Litter decomposition: what controls it and how can we alter it to sequester more carbon in forest soils. Biogeochemistry. 101, 133-149 (2010).
- Denef, K., Roobroeck, D., Wadu, M., Lootens, P., Boeckx, P. Microbial community composition and rhizodeposit-carbon assimilation in differently managed temperate grassland soils. Soil Biol. Biochem. 41, 144-153 (2009).
- Bird, J. A., Kleber, M., Torn, M. S. C-13 and N-15 stabilization dynamics in soil organic matter fractions during needle and fine root decomposition. Org. Geochem. 39, 465-477 (2008).
- Andresen, L. C., Jonasson, S., Strom, L., Michelsen, A. Uptake of pulse injected nitrogen by soil microbes and mycorrhizal and non-mycorrhizal plants in a species-diverse subarctic heath ecosystem. Plant Soil. 313, 283-295 (2008).
- Horwath, W. R., Pregitzer, K. S., Paul, E. A. C-14 Allocation in tree soil systems. Tree Physiol. 14, 1163-1176 (1994).
- Denef, K. Community shifts and carbon translocation within metabolically-active rhizosphere microorganisms in grasslands under elevated CO2. Biogeosciences. 4, 769-779 (2007).
- Pollierer, M. M., Langel, R., Korner, C., Maraun, M., Scheu, S. The underestimated importance of belowground carbon input for forest soil animal food webs. Ecol. Lett. 10, 729-736 (2007).
- Stewart, D. P. C., Metherell, A. K. Carbon (C-13) uptake and allocation in pasture plants following field pulse-labelling. Plant Soil. 210, 61-73 (1999).
- Santos, F., Torn, M. S., Bird, J. A. Biological degradation of pyrogenic organic matter in temperate forest soils. Soil Biol. Biochem. 51, 115-124 (2012).
- Bromand, S., Whalen, J. K., Janzen, H. H., Schjoerring, J. K., Ellert, B. H. A pulse-labelling method to generate 13C- enriched plant materials. Plant Soil. 235, 253-257 (2001).
- Putz, B. A simple method for in situ-labelling with 15N and 13C of grassland plant species by foliar brushing. Methods Ecol. Evol. 2, 326-332 (2011).
- Wichern, F., Mayer, J., Joergensen, R., Müller, T. Evaluation of the wick method for in situ <sup>13</sup>C and <sup>15</sup>N labelling of annual plants using sugar-urea mixtures. Plant Soil. 329, 105-115 (2010).
- Fahey, T. J. Transport of Carbon and Nitrogen Between Litter and Soil Organic Matter in a Northern Hardwood Forest. Ecosystems. 14, 326-340 (2011).
- Stewart, C. E., Paustian, K., Conant, R. T., Plante, A. F., Six, J. Soil carbon saturation: Evaluation and corroboration by long-term incubations. Soil Biol. Biochem. 40, 1741-1750 (2008).
- Fry, B. Stable Isotope Ecology. , Springer. (2006).
- Nippert, J. B., Fay, P. A., Carlisle, J. D., Knapp, A. K., Smith, M. D. Ecophysiological responses of two dominant grasses to altered temperature and precipitation regimes. Acta Oecol. Int. J. Ecol. 35, 400-408 (2009).
- Hoagland, D. R. aA., I, D. The Water-Culture Method for Growing Plants without Soil. , The College of Agriculture, University of California, Berkeley. Berkeley, CA. (1950).
- Lett, M. S., Knapp, A. K. Consequences of shrub expansion in mesic grassland: Resource alterations and graminoid responses. J. Veg. Sci. 14, 487-496 (2003).
- Knapp, A. K., Seastedt, T. R. Detritus Aaccumulation limits productivity of tallgrass prairie. Bioscience. 36, 662-668 (1986).
- Ting, K. C., Giacomelli, G. A. Solar photosynthetically active radiation transmission through greenhouse glazings. Energy Agric. 6, 121-132 (1987).
- McDermitt, D. K., Welles, J. M., Eckles, R. D. Effects of Temperature, Pressure and Water Vapor on Gas Phase Infrared Absorption by CO2. , Li-Cor, Inc.. Lincoln, NE. Forthcoming.
