Introduction
Инфекционные заболевания, вызванные видов внутриклеточной бактерией Chlamydia вызвать значительное бремя на здоровье населения, в том числе передающихся половым заболевания, воспалительные заболевания тазовых органов, слепота, пневмония и, возможно, атеросклероза 1-4. Способность Chlamydia, чтобы взаимодействовать с клеткой-хозяином, в пределах вакуоли (называется включение), является критическим фактором для их успешного инфицирования клеток и хостом. Включение роман патогенные отсек, который позволяет рост хламидийной и динамически изменять на протяжении всего 2-3 дней цикла развития хламидий 5. Облигатных внутриклеточный характер хламидий представляет многочисленные проблемы для научного сообщества, в частности для изучения непосредственно уникальную биологию включения. Основным препятствием является неспособность эффективно визуализировать либо внутриклеточный Chlamydia или их включение люминесцентной подходаES в живых клетках. Недавнее открытие, наконец, показал средства для генерации GFP, выражающую С трахоматис 6; Однако, этот вывод еще не привело к конкретному маркировки включения. Некоторые методы были описаны для маркировки бактерий и включений 7,8, но они страдают от недостатков, таких как не-специфичности, мимолетности и восприимчивости к фотообесцвечиванию. Ключевым открытием в нашей группе создана новая стратегия для освещения включение с помощью GFP выражения клеток-хозяев 9. Эта стратегия рационально использует внутреннюю герметичность включения мембраны молекул больше, чем 520 Da 10. Когда клетки инженерии стабильно выразить особую цитозольную флуоресцентный белок (например, GFP или mCherry), Chlamydia включений видны с замечательной ясностью их полного исключения флуоресценции. Эта обратная стратегия изображений позволяет немедленно визуализации включений для всех Хлamydia видов и она может быть легко адаптирована для большинства клеток-хозяев, представляющих интерес. В качестве демонстрации своей полезности, этот метод был использован ранее, чтобы выявить и определить пути выхода клеточные для Chlamydia SPP 9.
Здесь мы также продемонстрировать, как этот метод выполняется, и может быть использовано для получения ключевых количественных данных о динамике роста включение. Кроме того, она может эффективно заменить дорогие на основе антител методами подсчета и может быть использован в сочетании с другими флуоресцентными метками, такими как mKate2 экспрессирующих Chlamydia 11. Это мощное сочетание средств позволяет исследование физических свойств мембраны хламидийной включения внутри живых клетках-хозяевах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Генерация Люминесцентная линий клеток-хозяев
- День 1. Тарелка 293T клетки (или другой ретровируса упаковочная линия) на 6-луночных планшетах в 2 х 10 6 клеток / лунку, чтобы быть ~ 75% сливной следующий день. При желании плиты дублирующие лунки для каждой ретровируса, которые будут использоваться.
- День 2. Аспирируйте клетки и добавить 2 мл свежей среды роста (DMEM + 10% FBS + 2 мМ L-глутамина). Трансфекции клеток с 5-8 мкг каждого из ретровирусного вектора (содержащий GFP) и упаковки вектора (например., PVSVg) с использованием Lipofectamine 2000 или аналогичный реагент и следующей инструкции производителя.
- Инкубируйте клетки с ДНК в течение 4-6 часов в 37 ° C CO 2 инкубаторе, а затем заменить среду с 1 мл ростовой среды.
- Инкубируйте клетки в течение 48 ч в 37 ° C инкубаторе СО 2.
- День 3. Пластинчатые клетки-мишени (например,., HeLa) на 6-луночных планшетах в приближенной плотности 10 5 клеток / лунку, чтобы быть ~ 50% сливнойна следующий день. Проверка положительный трансфекции в клетки 293Т путем мониторинга флуоресценции GFP на инвертированный микроскоп.
- День 4. Сбор ретровируса, содержащего супернатантов выключения 293Т с помощью пипетки и фильтруют супернатанта через 0,45 мкм ацетата целлюлозы шприцевой фильтр.
- Удалить среды из клеток HeLa и добавить 0,5 мл среды для роста, содержащей 16 мкг / мл полибрена. Добавить ~ 0,5 мл отфильтрованной ретровируса к клеткам каплям и инкубируют клетки в 37 ° C инкубаторе СО 2 в течение 24 часов. Хранить любые оставшиеся ретровируса (т.е. из колодца дублировать) при 4 ° С.
- День 5. Если дубликаты скважин были сделаны произвести дополнительный ретровирус, повторите шаг 1,7 серийно заразить остальных ретровирусных частиц.
- День 6. Прохождение трансфецировали клеток HeLa 1: 1 в 10 см блюдо, содержащее выбора антибиотика (например, 500 мкг / мл неомицина).
- Подождите достаточно времени для трансдуцированных клеток расти еще в присутствии выбора antibioкрестики, после чего клетки можно размножать с помощью стандартных методик с низкой концентрацией выбора антибиотика (например., 200 мкг / мл неомицина).
Примечание: Клетки также могут быть клонально выбран для идеального яркости в это время, если это необходимо.
2. Генерация GFP-выразив хламидиоза
- Подготовка 2x CaCl 2 буфера (20 мМ Трис рН 7,4, 100 мМ CaCl 2) и 4SP буфер (0,4 М сахарозы, 16 мМ Na 2 HPO 4).
- День 1. размораживайте С. трахоматис акций на льду и сразу же разбавить 10 мкл бактерии в 50 мкл 2x CaCl 2 буфера. Добавить 3 мкг плазмидной ДНК (например., ПАСК-GFP-mKate2-L2), хорошо перемешать и выдержать в течение 30 мин при 25 ° С.
- На этом этапе, подготовить клеток-хозяев trypsinizing Т-75 колбу McCoy клеток в центрифужную пробирку. Центрифуга клеточной суспензии в 50 мкг в течение 5 мин и отбросить супернатант. Resuspenд осадок клеток в соответствующий объем 1x CaCl 2 буфера с получением конечной концентрации 4 х 10 7 клеток / мл.
- После 30 мин инкубации (со стадии 2.2), добавьте 100 мкл приготовленных McCoy клетки преобразования смеси трубки (общий объем 200 мкл) и инкубируют еще 20 мин при 25 ° С. Добавить 100 мкл этой смеси трансформированных клеток в одной скважине из 6-луночного планшета и накладки с среды 2 мл питательной. Инкубируют при 37 ° С в СО 2 инкубаторе в течение 2 дней.
- День 3. Lyse Маккой клеток, инфицированных C. трахоматис путем замены среды с 1 мл дН 2 O и очищая клетки с изогнутой 1000 мкл пипетки чаевые. Добавить 1 мл буфера 4SP и передать суспензии через иглу 27,5 G ~ 5 раз для эффективного лизиса клеток и освобождения С. трахоматис.
- Передача 2 мл клеточного лизата, содержащего С трахоматис к Т-75 колбу, содержащую сливающийся монослой недавно покрытием МаккOy клетки; добавить 8 мл DMEM (без FBS) и инкубируют в течение 2 ч при 25 ° С, чтобы позволить C. трахоматис придерживаться клеток.
- Вытяжку клетки и добавить свежую среду роста с добавлением 10 ед / мл пенициллина G и 1 мкг / мл циклогексимид. Инкубируйте колбы в течение 48 ч в инкубаторе с 37 ° С СО 2.
- День 4. Проверьте с помощью световой микроскопии, что клетки инфицированного и включения содержат отклоняющееся Chlamydia. Определить включений в виде ярких вакуолей на стандартную светового микроскопа, и аберрантных органов Chlamydia как кольцевых объектов в включений, которые диаметр больше, чем 2 мкм.
- День 5. Lyse культура, заменив среду с 2 мл дН 2 O и очистить клетки в суспензии. Добавить 2 мл буфера 4SP и передать суспензии через иглу 27,5 G ~ 5 раз.
- Использование 2 мл лизата клеток заразить свежий монослой клеток McCoy в одной скважине в 6-луночный планшет. Инкубируйте клетки с лизатом в течение 2 ч при 25 ° C, аспирации и добавить свежий ростсреда, содержащая пенициллин G и циклогексимид.
- Инкубируйте клетки в инкубаторе 37 ° С СО 2 в течение 3-5 дней, в зависимости от общего состояния здоровья клеток.
- Повторите шаги 2.9-2.10 один или более раз, при необходимости, пассирования культур в свежих скважин в 6-луночного планшета до обычного вида включений (лишенные аберрантных органов) появились. В это время использовать перевернутую флуоресцентного микроскопа, чтобы проверить, что С. трахоматис выразить mKate2 (красный).
- Масштаб зараженные культуры для генерации с высоким титром запасов хламидийной, например, путем сбора Chlamydia трансформантов из инфицированных McCoy или HeLa клеток, выращенных в колбах Т-150.
3. Заражение клеток с Chlamydia
- Пластинчатые GFP-HeLa клетки на желаемой культуры судна, например со стеклянным дном посуды или камерных горками для визуализации с высоким разрешением, или 24-луночных планшетах для IFU определения и многоямного скрининга.
- Оттепель сюдадзен трубки, содержащей С трахоматис, С. muridarum или C. пневмонии на льду и разбавляют в HBSS до желаемой множественности инфекции (MOI), например МВД = 1.
- Выполнение либо статические или центрифугированием автоматизированного инфекций на основе штамма Chlamydia частности, которая будет использоваться.
- Для инфекций с C. трахоматис LGV серовар L2 или С. muridarum, мыть GFP-HeLa клетки и инкубируют HBSS разбавленными бактерий в течение 2 ч при 25 ° С. Аспирируйте и промыть клетки с HBSS и инкубировать клеток в среде роста в 37 ° C инкубаторе СО 2.
- Для инфекций с Хламидийной серовара D или C. пневмонии, мыть GFP-HeLa клеток с HBSS и добавить разведенные бактерии к клеткам. Поместите Multiwell тарелку или блюдо со стеклянным дном (крепится лентой в многоямного крышкой плиты) в многоямного держателя пластины крепления ротора в Бакет в настольный центрифуге.
- Центрифуга клетки при 900 мкг при 25 ° С в течение 1 часа. Удалить из культуры сосуды центрифуги и место в инкубаторе 37 ° С СО 2 в течение 1 часа.
- Аспирируйте клетки в области биобезопасности кабинета, мыть клетки дважды HBSS и добавить свежую среду роста. Место клеток в 37 ° С СО 2 инкубатора.
4. живых клеток Визуализация Chlamydia включений
- Удалить зараженные Chlamydia GFP-HeLa клетки от СО 2 инкубатора и замените среду с RPMI без фенола красного + 5% FBS.
- Mount клетки на перевернутой флуоресцентного микроскопа (Nikon Eclipse Ti-E или аналогичного), используя 20X или выше масла цель в.
- Использование ПО изображений (Volocity 6 или подобное), сосредоточиться и определить хламидиоз инфицированных GFP-клетки HeLa: зеленые клетки, содержащие большие черные дыры (Chlamydia включений).
- Отметьте XYZ расположение областей, содержащих Chlamydia -infected клетки интерес, используя программное обеспечение обработки изображений (Томocity 6 или аналогичный). Выполните это вручную 'Добавление Points ", а в режиме просмотра XY Stage. Таким образом, координаты XYZ сохраняется для каждого отмеченного местоположения.
- В диалоговом окне Настройка Acquisition, настроить программное обеспечение, чтобы получить зеленый (GFP, HeLa цитозоля) и красный (mKate2, хламидийной) каналов, а в размере новых кадров на канал каждые 5 мин.
- Приобретать последовательность изображения, используя приобретение введенный выше протокол, нажав кнопку "Capture / запись".
5. Количественный параметров роста включение в живых клетках
- В нужное время после заражения (например,., 24, 48 HPI) удалить Хламидиоз инфицированных GFP-клетки HeLa из инкубатора и смонтировать на перевернутом флуоресцентного микроскопа. Примечание: Цель 20X 40X или воздуха с высокой NA лучше подходит для 24-луночных планшетах и масла цель 40X рекомендуется для камеры слайдов. Рост клеток на подложке или на этой задницеай.
- Сосредоточьтесь на midplanes клеток, где включений в их максимального диаметра и дают четкие края.
- Получение изображений для многих областях в каждую лунку (минимум на 10 скважины); скважины, как правило, представляют собой экспериментальные повторов или переменные.
- Перечислять количество включений вручную, на глаз (включения черные отсеки в GFP-HeLa клеток) или использовать программные алгоритмы визуализации для автоматического определения и подсчета включений.
- Найти GFP-клетки HeLa от интенсивности флуоресценции ('Найти объекты »команду) и отрегулируйте порог интенсивности флуоресценции на основе относительных интенсивностей клеток.
- Фильтр Выбранные объекты, использующие принципы размера сохранить эти только больше, чем 5 мкм 2. Это и есть "население 1.
- Применить "залатать дыры в объектах" команду, используя "население 1 'в качестве входа. Этот шаг создает "население 2 '.
- Вычтите "население 1" с "рopulation 2 ', чтобы получить положительно отмечены Chlamydia включений, обозначенные как "населения 3.
- Применение размер фильтр 'населения 3' ('фильтр' командной населения), например, сохраняя объектов больше, чем 25 мкм 2 для включений в клетках, инфицированных в течение 24 ч или дольше. Для ранних времен инфекции, такие как до 18 часов, установите размер фильтра, чтобы сохранить объекты, превышающие 4 мкм 2, так как эти включения являются намного меньше. Результаты фильтрации Размер в популяции объектов, обозначенных как "включений".
- Рассчитать количественные данные из изображений, например, номер включения, размер включений и окружность включение, с помощью программного обеспечения визуализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Клетки млекопитающих, выражающие цитозольные флуоресцентные белки (например, GFP) могут быть сконструированы для того, чтобы освещение Chlamydia включений в живых, инфицированных клеточных культурах. После инфицирования Chlamydia включений хорошо видны как черные пятна в клетках-хозяевах (рисунок 1). Ясность флюоресценции хватает включений может быть использована для автоматизированной идентификации включений через многочисленные поля зрения и / или лечения (рисунок 1). После того, как люминесцентные клетки-хозяева были сформированы, новый мощный рабочий процесс включен для быстрого количественного анализа, хламидийной инфекции в уровнях экспериментальных образцов. Одним из основных приложений является определение Chlamydia включения единиц (IFU) в живых, инфицированных клеток (рисунок 2). Этот экспериментальный стратегия устраняет необходимость процедуры иммунофлюоресценции, которые обычно используются в этой области, которые, как много времени идорогостоящим.
Другой ключевой особенностью описанного подхода изображений является то, что может быть легко применены к любым видам Chlamydia или деформации, и, кроме того, могут быть использованы для вывода важных биологических характеристик хламидийной включений. В качестве примера, время анализа курс GFP-HeLa клеток, инфицированных C. трахоматис LGV серовар L2, С. трахоматис серовар D, С. muridarum и C. пневмонии была выполнена в 16, 24 и 48 HPI (рисунок 3). Для каждого из этих видов хламидий и деформаций, включений были отмечены и проанализированы, чтобы вычислить их среднюю площадь, длина периметра, и номер на клетку порой указано (рисунок 4). Эти атрибуты предоставляют важную информацию о биологии хламидий включений и сообщить, как они взаимодействуют с клеткой-хозяином. Описанный способ обеспечивает легкое подход для доступа к этой информации таким образом, чтобы вс rpasses что может быть достигнуто другими экспериментальных методик. Окончательное утилита обратной стратегии маркировки для реального времени визуализации Chlamydia включений в живых клетках. Пример этого показан на Movie 1.
Рисунок 1. Автоматизированная обнаружения С. хламидийной включений. (А) GFP-HeLa клетки были инфицированы (В) mKate2 экспрессирующих С трахоматис L2 и отображены в прямом эфире на 24 HPI. Алгоритм обработки изображений на основе был использован для автоматической идентификации хламидийной включений (C) выбор черных дыр в GFP-HeLa клеток, отмеченные оранжевым. (D) Комбинированное изображение инфицированных клеток из панелей А и В также показана. Масштабная линейка = 20 мкм. .jove.com / файлы / ftp_upload / пятьдесят одна тысячу сто тридцать одна / 51131fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Количественный Chlamydia единиц включения формирования (IFU) в GFP-HeLa клетки. GFP-HeLa клетки были инфицированы C. трахоматис L2 на двух разных кратностей инфекции и отображены на 24 HPI. Включения на 10 полей в инфекции были обнаружены и перечислены с использованием автоматизированных программное обеспечение и результаты приведены (N = 3). Усы представляют стандартную ошибку среднего. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
OAD / 51 131 / 51131fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Время, конечно С. трахоматис серовар L2, С. трахоматис серовар D, С. muridarum и C. пневмонии инфекция в GFP-HeLa клеток. GFP-HeLa клетки были инфицированы C. трахоматис LGV серовар L2 и отображены живой флуоресцентной микроскопии на (A) 16 HPI, (б) 24 HPI, и (с) 48 HPI. GFP-HeLa клеток, инфицированных C. трахоматис серовар D были обследованы на (D), 16 HPI, (E) 24 HPI, и (F), 48 HPI. GFP-HeLa клеток, инфицированных C. muridarum были обследованы в (G) 16 HPI, (H) 24 HPI, и (I) 48 HPI. GFP-HeLa клеток, инфицированных C. пневмониибыли обследованы в (J) 16 HPI, (K) 24 HPI, и (L) 48 HPI. Типичные изображения показаны для всех инфекций и времени. Масштабные полоски = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Представитель количественные данные получены из опытов, конечно время. Включения из GFP-HeLa клеток, инфицированных (A) С трахоматис LGV серовар L2, (Б) С. трахоматис серовар D, (С) С. muridarum, и (D), С пневмонии были обнаружены и перечислены в 16, 24 и 48 HPI (5 полей в интервале времени, п = 3). Физические характеристики chlamydial включений количественно области включения поверхности, включения длины периметра, и число включений на клетку. Усы представляют SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы смотреть это видео. Фильм 1. промежуток времени видео mCherry-HeLa клеток, инфицированных GFP С трахоматис L2, принято на 48 HPI. Видео составлен из серии покадровой изображений, принятых на 5-минутными интервалами в течение 125 мин. Изогнутая видео чередуется через mCherry-HeLa клеток (красные), С. трахоматис L2 (зеленый) и слияние обоих полях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы опишем экспериментальный стратегии для генерации флуоресцентных клеток-хозяев для реального визуализации и анализа Chlamydia включений времени. Этот подход вакуоль визуализация дает мощные возможности для освещения, отслеживать и количественно измерить динамические свойства хламидийной включений по популяциях клеток или в одиночных камерах в течение долгого времени. Chlamydia включений в флуоресцентный белок меченых клеток поразительно хорошо определены, так что они легко идентифицируются без необходимости дополнительной обработки иммунофлуоресцентного. Кроме того, этот подход достаточно чувствительны, чтобы решить подписи морфологические различия, что различные виды и штаммы Chlamydia обладают, например, числа вакуолей в клетки и включение кривизны. Кроме того, показано, как для обработки изображений может быть приспособлен для автоматической идентификации включений в GFP экспрессирующих клеток-хозяев. Избавление от иммунофлуоресцентных шагов маркировки для ИлLumination хламидийной включений приводит к значительным временных и экономии для пользователя для конечных анализов, таких как определение включения единиц (IFU). Кроме того, способность к изображения включений в живых клетках позволяет той же популяции инфицированных клеток для анализа в конкретное время в течение цикла развития хламидийной, тем самым уменьшая количество скважин или пластин, необходимых для исследований, конечно времени. Цитозольного GFP, mCherry и т.д., получая яркий, стабильный сигнал, что не страдает от фотообесцвечивания; эта функция имеет решающее значение для длительных экспериментов покадровой обработки. Наконец, так как метод не зависит от экспрессии генов Chlamydia развития, это одинаково эффективны на всех стадиях клеточного инфекции хламидиями.
По сравнению с существующими стратегиями для маркировки внутриклеточного Chlamydia и мембран 7,8, этот метод предлагает простоту и гибкость для экспериментального аpplications. Флуоресцентные клетки-хозяева зараженные хламидиями могут быть отображены немедленно, без необходимости для погрузки красителя, маркировки или других клеточных манипуляций. Этот подход хорошо освещает и определяет края включения при сохранении просвета пространство включения (и бактерий) немеченого. Для освещения и перечисления Хламидиоз инфицированные клетки, преимущество этого подхода заключается прежде всего в его совместимости с живыми культурами, и поэтому значительная экономия времени она предоставляет. Тем не менее, для маркировки и выводе количественных параметров самого Chlamydia, содержащий вакуоли, коммерческие антитела для этого отсеке не являются широко доступными. Следовательно, перевернутый GFP подход остается наиболее легкое и прямые средства для демаркации мембраны этого патогена отсека.
Есть ключевыми факторами для применения этого метода визуализации в visualizat Chlamydiaионная рабочий. Важно, что хост клеточные линии со стабильной экспрессией GFP, mCherry и т.д., генерируются заранее. Хотя хламидийные включения легко обнаружены в клетках-хозяевах, которые временно трансфицированных флуоресцирующих белков, клетки, полученные таким образом, страдают от неполной трансфекции среди населения, а также переменных уровней экспрессии. Кроме того, добавляет трансфекции ненужных шагов к общей процедуре. Другим ограничением описанного способа является то, что включений, полученных из различных Chlamydia SPP. может быть резко отличается по морфологическим внешний вид и того, каким образом они взаимодействуют с клеткой-хозяином. Этот подход изображения вполне надежный для обнаружения и обработки изображений, содержащих включений С. трахоматис, С. muridarum или C. пневмонии; Однако, в течение нескольких видов Chlamydia (особенно С. psittaci и С. caviae) включений менее способны за исключением GFP от их просвета пространстве. Включения, содержащие С psittaci и C. caviae легко различимы в GFP-HeLa клеток, но вторжение какой-GFP в этих включений увеличивает частоту ошибок на основе программного обеспечения обнаружения включений.
После того, как общая стратегия эксперимента была реализована правильно, создаются новые возможности для количественного анализа Chlamydia включений в живых клетках. Мы показываем, как эта техника позволяет обтекаемый процесса для включения перечисления - либо в автоматическом режиме с помощью программного обеспечения визуализации, или вручную скоринга. Роман применение этого подхода для вывода значимых количественных данных о включении, например площадь включение, объема и формы. Наконец, этот метод визуализации хорошо адаптируется и может быть использован в сочетании с другими флуоресцентными маркерами, чтобы показать дополнительное понимание биологии Chlamydia зараженный клетках-хозяевах, напримерGFP- или mKate2-выражения Хламидиоз 6,11, флуоресцентный актина 12 или GFP помечены Inc белки 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene | Sigma | H9268 | |
| 0.45 µm filters | Fisher | 09-719D | |
| G418 | Invitrogen | 10131 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| RPMI 1640 w/o phenol red | Cellgro | 17-105-CV | |
| Penicillin G | Sigma | 13752 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Chamber slides, Lab-Tek II | Nunc | 154526, 154534 |
References
- Stamm, W. E. Chlamydia trachomatis infections: progress and problems. The Journal of Infectious Diseases. 179, Suppl 2. S380-S383 (1999).
- Schachter, J. Infection and disease epidemiology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. Stephens, R. S. , ASM Press. 139-169 (1999).
- Campbell, L. A., Kuo, C. C. Chlamydia pneumoniae--an infectious risk factor for atherosclerosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (1), 23-32 (2004).
- Darville, T., Hiltke, T. J. Pathogenesis of genital tract disease due to Chlamydia trachomatis. The Journal of Infectious Diseases. 201, Suppl 2. S114-S125 (2010).
- Hackstadt, T. Cell biology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. Stephens, R. S. , ASM Press. 101-138 (1999).
- Wang, Y., Kahane, S., Cutcliffe, L. T., Skilton, R. J., Lambden, P. R., Clarke, I. N. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector). PLoS Pathogens. 7 (9), e1002258 (2011).
- Hackstadt, T., Scidmore, M. A., Rockey, D. D. Lipid metabolism in Chlamydia trachomatis-infected cells: directed trafficking of Golgi-derived sphingolipids to the chlamydial inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
- Boleti, H., Ojcius, D. M., Dautry-Varsat, A. Fluorescent labelling of intracellular bacteria in living host cells. Journal of Microbiological Methods. 40 (3), 265-274 (2000).
- Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of host cell exit by the intracellular bacterium Chlamydia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11430-11435 (2007).
- Heinzen, R. A., Hackstadt, T. The Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuolar membrane is not passively permeable to low-molecular-weight compounds. Infection and Immunity. 65 (3), 1088-1094 (1997).
- Wickstrum, J., Sammons, L. R., Restivo, K. N., Hefty, P. S. Conditional gene expression in Chlamydia trachomatis using the tet system. PLoS One. 8 (10), 10-1371 (2013).
- Chin, E., Kirker, K., Zuck, M., James, G., Hybiske, K. Actin recruitment to the Chlamydia inclusion is spatiotemporally regulated by a mechanism that requires host and bacterial factors. PLoS One. 7 (10), e46949 (2012).
- Agaisse, H., Derré, I. A C. trachomatis cloning vector and the generation of C. trachomatis strains expressing fluorescent proteins under the control of a C. trachomatis promoter. PLoS One. 8 (2), e57090 (2013).
